蔬菜是人类生活中必不可少的食物，能提供人体所需的重要营养物质。我国蔬菜种植面积和产量均排在世界首位。但是，近十几年，我国蔬菜 Cd 含量超标问题层出不穷，广西、贵州等南方地区蔬菜 Cd 超标率达到了 21.10%^[1]。Cd 是最具毒害的重金属之一，不仅会严重损害菜田土壤质量，还会通过土壤在蔬菜中的累积，借助食物链进入人体，降低人体免疫力，造成慢性中毒。因此，采取有效的措施减轻农田土壤中的 Cd 污染，降低土壤中 Cd 含量对保障人体健康和保护耕地生产安全是非常有必要的^[2]。

目前农田的 Cd 污染土壤修复所采用的方法主要有物理修复、化学修复、生物修复及农业生态修复等措施^[3]。而农田土壤钝化修复因成本低廉、操作方便、效果明显，且适合大面积推广等优点，受到越来越多研究者的关注^[4]。邓惠强等^[5]在研究不同土壤钝化剂对 Cd 污染土壤及油麦菜生物量的过程中发现，石灰 + 泥炭处理既能显著降低土壤中的 Cd 含量，也能提高油麦菜的产量。胡丽萍等^[6] 研究也表明，施用复合钝化剂降低了小白菜的 Cd 含量且提升了小白菜的品质。可见，土壤钝化剂在保证土壤修复作用的同时还可作为基础肥料促进蔬菜的生长^[7]。此外，相关研究表明，重金属能引起土壤微生物的生物量、活性、微生物群落结构、功能和多样性等生态特征变化^[8]。而土壤微生物是评价土壤质量的重要指标之一，与土壤肥力及土壤安全有着密不可分的联系。

贵州省山地地貌独特，适合发展特色优质农产品，但其作为典型的碳酸盐岩发育地区，具有重金属 Cd 地球化学异常特征，在这种异常条件下，农产品的安全生产问题显得格外突出。研究表明，叶菜类蔬菜对重金属 Zn、Pb 和 Cd 的富集能力高于果菜类和根菜类蔬菜。菠菜（Spinacia oleracea L.）重金属富集能力较大，其抗重金属污染能力较弱^[9]。李学德等^[10]研究几种不同重金属在菠菜和青菜的不同器官中的累积效应，结果表明 Cd 在菠菜叶片中含量最高。因此，在重金属污染区种植菠菜，重金属有可能通过食物链在人体内富集，对人类健康构成威胁。鉴于我国农田土壤重金属污染面积大，且大多以中轻度污染为主，利用其他修复措施成本过高，且对环境的影响较大，因此，发展重金属污染土壤原位钝化修复技术对有效保障农产品品种安全、维护人类健康具有十分重要的意义^[11]。孙约兵等^[12]研究表明，投入海泡石菠菜可食部位 Cd 质量分数低于 0.2 mg/kg，可满足食品卫生标准。范贝贝等^[13]的研究表明，水滑石改性生物炭可显著抑制菠菜对 Cd 的积累，降低菠菜的重金属富集系数。但是，当前有关不同钝化剂对蔬菜 Cd 累积及土壤微生物群落结构影响的研究较为少见。

鉴于此，本研究选择常见叶菜类菠菜为研究对象，通过开展有机、无机钝化剂单施和配施温室盆栽试验，比较研究各处理的菠菜生物量和 Cd 含量，利用高通量测序分析技术测定根际土壤微生物群落结构，同时测定土壤理化性质，以期阐明施用不同钝化剂对菠菜土壤 Cd 吸收累积及微生物群落结构的影响。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试土壤采自贵州省安顺市，利用多点采样法采集 0~20 cm 土层的污染农田土样，去除表层腐殖质和杂物后，自然风干、混匀、磨碎过筛备用。供试土壤重金属 Cd 含量及基本化学性质见表1。菠菜品种为日本大叶菠菜。供试纳米羟基磷灰石购自南京埃普瑞纳米材料有限公司，钙磷比为 1.73，纯度为 97.9%，羟基磷灰石结晶相含量为 97.2%，未见其他结晶相，其余为非结晶。巯基生物炭为实验室自制，主要成分为烷基和芳香结构碳，其表面含有大量的羟基、羧基、氨基、酰胺基、巯基和甲氧基官能团，含有大量的 C，少量的 N、P、S、Cl 等元素。

1.2 试验设计

采用温室土培盆栽试验，以菠菜为研究对象，设置不施钝化剂（CK）、单施纳米羟基磷灰石 （nHAP）、单施巯基生物炭（TMB）、配施纳米羟基磷灰石 + 巯基生物炭（HPTB）4 个处理，每个处理各设置 3 个重复，1 个重复 1 盆。

育苗方法：将大小均匀的完整种子经 5% NaClO（V/V）表面消毒 15 min 后，用去离子水洗涤数次并浸入 25℃去离子水中 12 h，在营养基质中培养至 4 片真叶时移栽。

培养条件：将 5 kg 处理好的供试土壤[单施钝化剂按照 2%（W/W）的比例与土壤混合，配施钝化剂各按照 1%（W/W）的比例与土壤混合]装入深色塑料方盆（规格为长 44 cm，宽 20 cm，高 11 cm），同时施入底肥：N（0.30 g/kg）、P₂O₅（0.20 g/kg）、K₂O（0.30 g/kg），施入肥料形态分别为（NH₄）₂SO₄、KH₂PO₄、K₂SO₄。将装有供试土壤和底肥的方盆置于温室中稳定 1 周后（土壤含水量保持在田间持水量的 60%~70%），开始移栽长势均匀的菠菜，每盆等距定植 4 株，在贵州农业科学院温室自然光条件下培养，白天温度为 25℃，夜间温度为 20℃，相对湿度为 65%～75%，培养期间每1～2 d 进行浇水，土壤水分含量保持在田间持水量的 60%~70%。

1.3 样品采集及测定

植物样品采集与处理：在移栽后的 72 d 采集菠菜植株样品，1 个处理 3 盆，1 盆 4 株，共采集 12 株。植物地上部和根部分开，将根浸入 20 mmol/L Na₂-EDTA 中交换 15 min 以除去附着在根表面的 Cd²⁺，然后用自来水和去离子水冲洗。冲洗后，将植物样品的地上部及地下部放于烘箱中，在 105℃ 下杀青 30 min 后于 80℃下干燥至恒重，然后用球磨仪磨碎过筛备用。土壤理化性质的测定方法参考 《土壤农化分析》^[14]。

植物样品 Cd 含量测定：称取 0.2500~0.3000 g 植株样品置于 50 mL 消煮管中，加入 4 mL 优级纯浓 HNO₃，消化过夜后置于 110℃消煮炉上加热 2 h，取出冷却后用滴管少量多次加入 3 mL 优级纯 H₂O₂，然后在 170~180℃ 下赶酸，至到剩余 2 mL 左右无色透明溶液为止，冷却后用超纯水转移并定容至 50 mL，每 20 个样做 1 个平行，同时做空白对照，Cd 含量用电感耦合等离子体质谱仪[ICP-MS， （7700x，Agilent，US）]测定。测定过程中质量控制样品为国家标准物质 GBW10020（GSB-11），质控样品测定结果在标准值范围内^[15]。

根际土壤样品采集与处理：在移栽 72 d 后，用抖根法分别采集不同处理的根际土壤。将采集的土壤一部分过 2 mm 筛后用液氮处理并及时带回实验室保存在-80℃的冰箱中，用于测定土壤微生物多样性。剩余部分风干粉碎后分别过 2 和 0.25 mm 筛用于土壤理化性质及土壤 Cd 含量的测定。

根际土壤微生物群落结构由上海美吉生物医药科技有限公司采用高通量测序进行测定。

土壤样品全 Cd 含量测定：称取 0.2 g 过 0.25 mm 筛的风干土壤样品，利用王水 + H₂O₂ 微波消解冷却后用超纯水定容至 50 mL，用 ICP-MS（7700x， Agilent，US）进行测定。

土壤样品有效态 Cd 含量测定：称取 5 g 过 2 mm 筛的风干土壤样品，加入 25 mL 二乙三胺五乙酸-三乙醇胺浸提液，然后振荡大约 2 h （180 r/min），用 ICP-MS 测定。

1.4 数据统计与分析

采用 Excel 2010 对试验数据进行整理和统计，利用 SPSS 22.0 进行单因素方差分析，并用 Duncan 法进行基于方差分析的多重比较，P<0.05 被认为具有统计学意义，利用 GraphPad Prism 6、Original 22 进行作图。

2 结果与分析

2.1 不同钝化剂处理对菠菜生物量的影响

由表2 可知，施加不同钝化剂均能增加菠菜地上部和地下部生物量。相较于 CK，HPTB、nHAP 处理下菠菜生物量显著增高，地上部生物量分别增加了 143.86%、90.41%，地下部生物量分别增加了 92.10%、73.68%。可见，HPTB 处理下对菠菜生物量的提升效果最好，nHAP 处理次之。

注：表中的数据为平均值 ± 标准差（n =3），不同小写字母代表各处理间的差异达到 P<0.05 的显著性水平。下同。

施加不同钝化剂均能降低菠菜地上部和地下部 Cd 含量。相较于 CK，nHAP、TMB、HPTB 处理下菠菜的地上部 Cd 含量分别降低了 78.26%、7.24%、 65.22%，地下部 Cd 含量分别降低了 66.42%、 39.41%、52.55%。结果表明，nHAP 处理下菠菜 Cd 含量最低。

2.2 不同钝化剂处理对土壤化学性质的影响

如表3 所示，相较于 CK 处理，nHAP、TMB、 HPTB 处理下土壤 pH 分别提高了 1.36、0.08、0.76 个单位。此外，施加钝化剂处理后，有机质含量均高于 CK 处理，其中，TMB 和 HPTB 处理对于有机质的增加最为显著，分别增加了 27.46% 和 13.41%。各处理下土壤全氮含量无显著性差异，但 nHAP 和 HPTB 处理下土壤全磷、有效磷含量均显著高于 CK 和 TMB 处理，且相较 CK 处理，nHAP 和 HPTB 处理下土壤全磷、全钾、有效磷含量分别增加了 122.22% 和 0.92%、14.42% 和 4.64%、297.48% 和 231.72%。此外，施加钝化剂后，土壤碱解氮含量均低于 CK 处理，而速效钾含量均高于 CK 处理。

2.3 不同钝化剂处理对土壤微生物群落多样性的影响

不同钝化剂处理下土壤细菌群落在属水平的组成如图1（A）所示，不同钝化剂处理下土壤细菌群落的细菌共有 32 个属，其中，CK、nHAP、 TMB、HPTB 处理下细菌相对丰度分别为 67.14%、 72.44%、65.77%、71.63%。较 CK 而言，TMB 处理下细菌相对丰度降低了 1.37%，而 nHAP 和 HPTB 处理下细菌相对丰度分别增加了 5.30% 和 4.49%。各处理中，土壤的主要优势菌群仍为 norank_f_ norank_o_Gaiellales、unclassified_f_Micrococcaceae、 Gaiella、Massilia、Bacillus（芽孢杆菌属）、Sphingomonas（鞘鞍醇单胞菌属）。

不同钝化剂处理下土壤真菌群落在属水平的组成如图1（B）所示，不同钝化剂处理下土壤真菌群落的真菌共有 28 个属，CK、nHAP、TMB、HPTB 处理下真菌相对丰度分别为 90.71%、91.65%、90.41%、 85.47%。较 CK 而言，TMB 和 HPTB 处理下真菌相对丰度分别降低了 0.30% 和 5.24%，而 nHAP 处理下相对丰度增加了 0.94%。主要优势菌群仍为 Fusarium（镰孢霉菌属）、unclassified_f_Chytridiaceae、 Mortierella（被孢霉菌属）、Trichoderma（木霉菌属）、 Neocosmospora（新赤壳菌属）。结果表明，不同钝化剂处理对土壤主要优势均属组成没有显著的影响，但会改变细菌和真菌的相对丰度。

注：不同的颜色代表不同的菌属。

2.4 不同钝化剂处理下土壤微生物群落结构主成分分析

基于 Bray-Curtis 距离进行不同钝化剂处理下土壤微生物群落主成分分析，如图2（A）所示，细菌第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）的贡献率分别为 16.16% 和 15.22%。TMB 样本点形成的簇与 CK 存在交叉，HPTB 样本点形成的簇离 CK 最远，nHAP 次之，而 TMB 样本点形成的簇离 CK最近，说明 HPTB 处理对土壤细菌的微生物群落结构影响较大，nHAP 次之，而 TMB 影响最小。如图2（B）所示，真菌第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）的贡献率分别为 15.05% 和 12.85%。 HPTB 形成的簇离 CK 最远，nHAP 次之，而 TMB 几乎与 CK 重合，说明 HPTB 处理对土壤真菌微生物群落结构影响较大，nHAP 处理次之，而 TMB 处理下真菌微生物群落结构与 CK 较为相似。

注：不同颜色或形状的点代表不同分组的样本，两样本点越接近，表明两样本物种组成越相似。

2.5 不同钝化剂处理土壤微生物与土壤化学性质的冗余分析

土壤化学因子和细菌优势菌属之间的关系如图3（A）所示。第一轴的解释度为 69.59%，第二轴的解释度为 7.40%。pH、全钾、全磷、速效钾、碱解氮、全氮、有效磷、有机质环境因子对细菌优势菌属的解释度分别为 59%、8.8%、7.0%、1.8%、 1.3%、1.0%、0.9%、0.5%。其中，pH 对细菌群落结构的影响最大，贡献率也最高，为 60%。

图3（B）反映了土壤理化因子和真菌优势菌属之间的关系，第一轴的解释度为 55.93%，第二轴的解释度为 26.76%。全磷、碱解氮、pH、有效磷、速效钾、全钾、有机质、全氮环境因子对真菌优势菌属的解释度分别为 46.7%、10.0%、9.6%、 5.6%、5.1%、3.1%、2.8%、2.7%。其中，全磷对真菌群落结构的影响最大，贡献率也最高，为 51.50%。

3 讨论

3.1 不同钝化剂处理对菠菜生长及镉含量的影响

钝化剂由于自身含有作物生长所需的营养元素，可降低土壤重金属的活性，进而减轻其对作物的毒害，从而对作物具有一定的增产效应^[16]。本研究中，纳米羟基磷灰石、巯基生物炭单施、纳米羟基磷灰石 + 巯基生物炭混施均能增加菠菜地上部和地下部生物量，纳米羟基磷灰石 + 巯基生物炭混施菠菜生物量最大，这与张迪等^[17]的研究相似。冯佳蓓^[18]的研究也指出，在 Cd、Pb 污染土壤中施加钝化剂可以有效增加小白菜生物量。钝化剂的施用能够促进作物的生长，主要是由于钝化材料通过与重金属相互作用，降低土壤重金属活性、改善土壤理化性状，降低植物对重金属的吸收，减轻重金属对植物的毒害，从而改善植物生长^[19]。土壤pH 是影响 Cd 活性最重要的因素之一^[20]，研究结果表明，单一钝化剂和钝化剂配施均能提高土壤的 pH 和有机质。土壤 pH 的提高不但可增加土壤表面负电荷，提高对 Cd²⁺ 的吸附，而且可产生碳酸盐沉淀^[21]。有机质可以增加土壤对重金属的吸附能力，有机产物也可以与重金属形成难溶性沉淀，降低重金属在土壤中的迁移^[22]。此外，各处理下速效钾含量均增加，这与韩晓芳等^[23]的研究结果相似，这是由于添加复合微生物改良剂可以显著提高速效钾的含量。

注：蓝色箭头表示优势菌种，红色箭头代表土壤化学因子。OM、TN、TP、TK、AN、AP 和 AK 分别为有机质、全氮、全磷、全钾、碱解氮、有效磷和速效钾。

钝化剂通过影响土壤性质、改变重金属在土壤中的吸附、沉淀、离子交换和络合作用等过程^[24-25]，进而制约重金属在土壤中的形态和活性。本研究发现，单施纳米羟基磷灰石、巯基生物炭、纳米羟基磷灰石 + 巯基生物炭混施均能降低菠菜地上部和地下部 Cd 含量。这是由于土壤中的 Fe、Mn 等离子易与 OH^- 结合形成羟基化合物，为重金属离子提供更多的吸附位点，增加 Cd²⁺ 的吸附能力^[26]。同时，土壤中 Cd²⁺ 可以与羟基磷灰石中的 Ca²⁺ 进行离子交换或表面吸附反应等^[27]。施用钝化剂可以抑制重金属从根部向地上部的转移而降低重金属在地上部的累积，结果表明，不同钝化剂处理下菠菜地上部和地下部 Cd 累积量均减少，这与代允超^[28]的研究结果一致。nHAP 处理下菠菜 Cd 累积量最低，抑制了菠菜对 Cd 的转运和富集。含磷材料主要通过系列化学作用将重金属固定在土壤中，从而降低重金属在土壤中的迁移性和生物有效性^[29]。

综上所述，施用钝化剂可以有效提高菠菜产量，改善土壤性质，降低菠菜 Cd 累积。因此，在 Cd 污染土壤中进行菠菜种植时，钝化剂的施用对作物的安全生产是有必要的。

3.2 不同钝化剂处理对土壤微生物群落结构的影响

研究发现，不同钝化剂处理改变了细菌和真菌的相对丰度。这与任露陆等^[30]的研究相似，在属水平上，不同处理之间微生物群落结构未发生明显变化，仅优势菌属相对丰度发生变化，这可能是由于微生物群落结构主要受土壤污染物水平与土壤理化性质共同影响的原因^[31]。其中，纳米羟基磷灰石 + 巯基生物炭的混施对土壤细菌和真菌的微生物群落结构影响较大，纳米羟基磷灰石单施次之，巯基生物炭单施影响最小，这与雷海迪等^[32]的研究相似，这可能是由于羟基磷灰石是一种碱性材料（pH>7.6），其溶解过程能够消耗大量 H⁺，使得土壤 pH 提高^[33]，进而导致细菌群落结构的变化。但值得注意的是，尽管不同钝化剂的施加改变了细菌和真菌的相对丰度，但并没有改变土壤属水平上的优势菌群，可见，钝化剂的施加并不会破坏土壤微生物群落结构。

RDA 分析发现，pH 是影响细菌群落结构的主要因子，这与前人的研究一致^[34-35]，这主要由于 pH 能够影响多种环境因素，包括土壤重金属形态、营养物质及酶活性。此外，研究发现，全磷是影响真菌群落结构的主要因子，这是由于 C、N、P 源改良剂的添加直接提高土壤微生物生长、代谢所需要的 C、N、P 等营养物质^[36]。而土壤中 P、C、N 存在耦合关系，P 的变化可导致土壤中微生物代谢所利用的养分发生改变，从而影响土壤微生物整体结构。值得注意的是，土壤中磷酸酶能促进土壤有机磷脱落，提高 P 的有效性，进而增强土壤微生物的活性^[37]。可见，钝化剂的施加能有效提高土壤微生物的活性，选择带有 P 源如纳米羟基磷灰石等的钝化剂，对于土壤微生物活性的提高更有效。

4 结论

（1）不同钝化剂处理下菠菜生物量均增加，Cd 含量均降低。其中，纳米羟基磷灰石对菠菜的促生效果最好，地上部、地下部生物量均显著增加，Cd 含量均显著降低。

（2）添加不同钝化剂均可提高土壤 pH 和有机质含量。其中，纳米羟基磷灰石处理土壤 pH 增加最为明显，巯基生物炭处理土壤有机质增加最为明显。

（3）不同钝化剂对土壤主要优势菌群的组成没有显著的影响，但会改变细菌和真菌的相对丰度。纳米羟基磷灰石对细菌群落结构的影响较大，对真菌群落结构影响较小。

（4）通过 RDA 分析，得出 pH 是影响细菌群落结构的主要因子，全磷是影响真菌群落结构的主要因子。

（5）纳米羟基磷灰石可缓解 Cd 污染农田土壤 Cd 对菠菜的毒害作用，同时具有促进作物生物量增加的双重效果。

参考文献