在农业现代化快速推进的同时，肥料的高投入低利用和大量的农业废弃物给生态环境带来沉重压力^[1]。为积极推进资源化综合利用，将农业废弃物制成天然有机肥打造高效高质农业农产品是助力生态循环农业，改良土壤肥力、保护绿色环境的重要发展模式。在有机肥中添加微量元素可为农产品的质量安全赋能增效^[2-3]，硒是人体必需的微量元素，具有防止骨髓端病变、清除体内自由基、抗癌防癌的作用^[4]。调查显示全球仍有 10 亿人存在不同程度的缺硒，我国约有 61% 地区的人口硒摄取量不足^[5]，威胁到人们的健康发展。食品中补硒是增强人体健康的有效途径，而目前市场上富硒农产品的生产多以亚硒酸钠（Na₂SeO₃）溶液作为无机硒肥以叶面喷施、根部灌溉的方式添加^[6-7]。有数据显示，采用叶面喷施、根部灌溉的方式施肥的 Na₂SeO₃浓度一般在 2～15 mg·kg^-1 范围内^[8]，导致添加不同浓度的 Na₂SeO₃是决定富硒效果的关键因素。但无机硒施用过多会污染水体环境，毒害水生生物，抑制作物生产，危害人体健康。国内学者将 Na₂SeO₃溶于化学肥料中制成富硒控释肥^[9] 来提高作物硒含量，最新的研究是在农业废弃物堆肥过程中接种富硒微生物来制造有机富硒肥料，提高作物硒含量的效果显著^[10]。所以研制富硒肥料是富硒农产品在生产上能达到安全高质的重要途径。

在“秸秆种植食用菌-菌渣堆肥-富硒农产品”的绿色农业生态循环模式中，有机富硒肥是通过农业固体废弃物菌渣、菜粕、秸秆作为原料好氧堆肥制得，以微生物在有氧条件下对有机质进行快速降解来循环利用农业废弃物。因此，微生物是研制富硒菌肥质量的关键因素^[11]。本文探究 EM 菌 （有效微生物群）、枯草芽孢杆菌、圆褐固氮菌在富硒堆肥中的效果，并选取菠菜作为栽培作物，分析富硒菌肥对菠菜生长、硒含量的影响，以期为有机富硒肥料在社会生产实践中的应用提供理论依据，促进农业废弃物实现资源化利用，发展富硒生态农业。

1 材料与方法

1.1 试验材料

堆肥原料中菜粕、秸秆和菌渣来自合肥立新菌种厂培训学校，Na₂SeO₃购买于合肥拜尔迪化学科技有限公司。EM 菌购自于山东君德生物科技有限公司，枯草芽孢杆菌购买于广西强兴生物科技有限公司，圆褐固氮菌购自南京塞尔特生物科技有限公司。本研究所用盆菜品种为小叶菠菜。堆肥原料的基本理化性质见表1。

1.2 堆肥方法与试验设计

1.2.1 富硒菌剂的制备

使用 LB 液体培养基分别扩培上述菌种，并将培养基中 Na₂SeO₃的浓度梯度设置为 0、20、 40、60、80 mg·L^-1，每组试验注入体积分数 2%、 4%、6%、8% 的菌液（浓度 1×10₈ CFU·mL^-1）于 37℃培养箱下培养。通过微生物自身的生物转化能力将利用率低的Na₂SeO₃转化为毒性小、易吸收的有机态硒，并在一系列浓度梯度中添加不同接种量的菌种来探究最佳的富硒微生物培养浓度。

试验在安徽省合肥智慧农业协同创新研究院堆肥大棚中进行。将菜粕、菇渣、秸秆以 4∶4∶1 的质量比混匀。为比较不同微生物菌的富硒堆肥效果，试验设计一个空白对照组（CK）和 3 个处理组， T1：接种富硒 EM 菌；T2：接种富硒枯草芽孢杆菌；T3：接种富硒混合菌（富硒圆褐固氮菌 + 富硒枯草芽孢杆菌），以上活化后的菌剂接种量均为堆体总质量的 1% 且使堆体有效活菌数（CFU）≥ 0.2 亿个·g^-1。CK 按上述一致的总硒浓度计算添加 Na₂SeO₃。调节含水率为 60% 左右，调节碳氮比至 25 左右。

所有试验组均按长 × 宽 × 高 =1.5 m×1.5 m×0.8 m 锥体自然堆置，适时翻抛补充水分，试验周期设定为 38 d，堆肥过程中其他条件保持一致。

1.2.2 采样与测定指标

每日用温度计测定堆体温度、环境温度。在堆肥当天和 4、7、13、21、28、33、38 d 对点取样混匀。新鲜样品用来测定种子发芽率，剩下样品风干、研磨测其 pH、有机质含量、总养分含量、总硒含量及不同形态硒的含量。

1.2.3 测定方法

用 pH 计（ 上海雷磁 PHS-3E）测定 pH。有机质、总养分含量的测定参照《有机肥料》（NY/T525—2021）标准^[12]。

总硒、不同形态硒含量采用 HNO₃-HClO₄ 溶液 （体积比为 4∶1）于 170℃下重复消解样品至灰白色后测定^[13]。硒形态的测定参考瞿建国的连续浸提法^[14]。

种子发芽指数（GI）=（堆肥处理的种子发芽率 × 种子根长）/（对照处理的种子发芽率 × 种子根长）×100%

1.3 盆菜试验

试验用盆（长 × 宽 × 高 = 60 cm×25 cm×20 cm）为聚丙烯树脂材质，以上述制得的富硒肥按 10% 的比例与泥炭土混合装盆，浇透后种植浸泡 12 h 的小叶菠菜种子，每盆播种 10 粒，全生育期 35 d 后收获。试验将堆制好的富硒菌肥按 20% 的比例与基质混合使用，共设 1 个对照、 3 个处理，（1）OF：施 CK 有机肥；（2）F1：施 T1 有机肥；（3）F2：施 T2 有机肥；（4）F3：施 T3 有机肥。

盆菜测定：菠菜生长指标按照宋卫卫的方法^[15] 测量，总硒、有机硒含量的测定按照《食品中硒的测定》（GB 5009.93—2017）的标准^[16]，铅、镉元素含量的测定采用电感耦合等离子体质谱法^[17]。

1.4 数据分析

用 Excel 2019、SPSS 2020 对试验数据进行处理分析，用 Origin 2021 进行绘图。

2 结果与分析

2.1 堆肥基本的理化性质指标

从图1a 可以看出，所有组的堆肥温度趋势总体呈先升高后降低，最后趋于稳定。T1、T2 和 T3 处理的温度最高值分别达到了 63.0、61.9 和 68.2℃，并且在高温阶段（>50℃）维持了 12～14 d，CK 的最高温度为 56.7℃并在高温阶段的时间只持续了 8 d，这比处理组要少 4～6 d。从堆肥最高温度和高温持续时间来看，堆肥效果：T3>T1>T2>CK。T3 处理增加堆肥的温度累积量最高，加快了堆肥进程和提高堆肥腐熟程度。

由图1b 看出所有试验组的 pH 变化范围在 6.89～8.43，均为先减少后增加，变化规律较为相似。在堆肥的前 5 d 内 pH 急剧下降，紧接均呈现迅速升高的变化趋势并在堆肥 30 d 后趋于稳定。在堆肥高温阶段，处理组 pH 的变化进程在时间上要快于 CK，添加富硒微生物加快了堆肥的反应进程，T3 处理的 pH 在堆肥结束时达到 8.43，变化幅度最大，说明该复合菌组合使堆肥的反应程度更剧烈。

由图1c 可知，在堆制过程中所有试验组有机质含量整体变化差异不大，均为逐渐降低。堆制结束后，T1、T2、T3 处理和 CK 的有机质含量分别为 681.8、688.5、673.7 和 715.3 g·kg^-1，T1、 T2、T3 处理和 CK 的有机质降解率分别为 16.08%、 15.18%、17.04% 和 12.16%。所有处理组降解能力均显著高于对照组，这三类处理均促进堆肥中有机质的降解和转化，其中 T3 处理降解堆体的有机质含量最多，降解效果明显。

如图1d 所示，在试验初始 GI 值都低于 50% 时，说明堆肥物料是具有一定的植物毒性，不在植物生长可接受的条件内。随着堆肥的进行，0～5 d，各试验组的 GI 值变化差异不大，后期堆肥的 GI 迅速上升并在结束后都超过 80%。另外相比于 CK，处理组的 GI 值都在 100% 以上，T2 处理最高，为 111.46%，其次是 T3 处理，为 109.32%，CK 最低，只为 97.63%。结果表明，堆肥浸提液对种子的萌发具有促进作用并达到腐熟标准。

从图1e 可以看出，堆制结束时，堆体总养分含量相较堆制初期都在增加且 T1、T2 和 T3 处理的总养分含量分别为 5.51%、5.69% 和 5.89%，均超过 CK（5.18%）的总养分含量。根据《有机肥料》（NY/T525—2021）^[12]中指标规定，均达到总养分（N+P₂O₅+K₂O）含量（以干基计）5% 的行业标准。

在 0～20 d 内尽管堆体有 NH₃ 排放和 pH 出现下降的现象，但图1f 看出总氮含量仍然是逐渐增加的，这与唐尙柱等^[18]的堆肥研究情况相符，出现此结果的原因在于堆体中含碳有机物的降解率远大于 NH₃ 的排放率，从而使得总氮含量持续增加。堆制 38 d 后，T1、T2、T3 处理的总氮含量分别为 30.85、32.90、35.82 g·kg^-1，相较于 CK 分别提高 8.55%、15.78%、26.06%。T3 处理的总氮含量分别较 CK、T1 和 T2 处理提高了 27.4%、16.12% 和 8.87%，累积总氮含量最高。

2.2 堆肥过程硒含量、硒形态的变化

富硒微生物菌剂制备的预试验中，上述 3 种微生物在相同硒含量的培养基中接种量为 6% 时，菌落生长正常，培养基中转化 Na₂SeO₃ 的速度最快。如表2 所示，在微生物接种量一致时添加质量浓度为 40 mg·L^-1 的 Na₂SeO₃，其富集率达到最高。

如图2a 所示，所有试验组堆肥结束后，总硒含量均出现不同程度的上升。CK 在堆制结束后总硒平均含量为 32.22 mg·kg^-1，整体变化趋势不明显。而 T1、T2 和 T3 处理在 38 d 测得总硒含量高达 58.13、 60.38 和 62.35 mg·kg^-1，分别是堆肥初期的 1.81、 1.88 和 2.14 倍，并显著高于 CK 的总硒含量。T3 处理总硒含量是大于其他处理，说明该混合菌更适应对 Na₂SeO₃的转化，同时堆体的碱性环境也抑制可挥发态硒化物的合成，减少总硒的损失。

通常将土壤硒形态按水溶性及其结合强度分为可溶态硒（SOL-Se）、可交换态硒（SOL-Se）、铁锰氧化物结合态硒（FMO-Se）、有机结合态硒（OM-Se）和残渣态硒（RES-Se）^[19]。由图2b 所示，CK 的硒形态分布在堆肥过程中 SOL-Se、 EXC-Se 含量比例分别从 20.18%、44.63% 降到 13.35%、31.34%，OM-Se、RES-Se 含量比例分别从 15.31%、12.18% 上升至 21%、27.6%，FMO-Se 性质稳定变化差异不大。试验组中明显可见 OM-Se 含量比例增加，T1、T2、T3 处理的 OM-Se 含量占比从初始的 14.86%、15.19%、17.74% 上升至 33.24%、35.46%、40.28%；RES-Se 含量占比从初始的 13.68%、12.85%、11.88% 上升至 26.68%、 23.85%、21.15%；SOL-Se 和 EXC-Se 含量占比有不同程度的缩减。

2.3 盆栽试验

在菠菜的生育期结束后测定生长指标。由表3 可知，相较于 OF，其他处理均提高了菠菜的株高、根长、叶宽、鲜重及叶绿素，促进菠菜生长。F1、F2 和 F3 处理的株高分别比 OF 增加了 43.73%、47.89% 和 50.21%，根长增加 26.61%、37.16% 和 47.48%；叶宽分别是 OF 的 1.67、1.86 和 1.78 倍；鲜重分别是 OF 的 1.57、1.71 和 1.75 倍。菠菜的叶绿素含量也有不同程度的增幅，F1 的增幅为 17.69%，F2 的增幅最大，为 18.84%，F3 的增幅最小，为 13.63%。各处理与 OF 之间菠菜生物量均呈显著性差异，处理之间差异不显著。

注：同列不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。

菠菜对硒、重金属具有较强的富集能力，由图3 可知，相较于 OF 菠菜总硒含量的 38.64 μg·kg^-1，F1、 F2 和 F3 处理菠菜总硒含量高达 94.28、97.44 和 126.72 μg·kg^-1，分别是 OF 的 2.43、2.52 和 3.27 倍。F3 处理的菠菜总硒含量是 F1、F2 处理的 1.3 倍，有机硒含量是 F1、F2 处理的 1.28 倍，说明 F3 处理使得菠菜体内累积总硒、有机硒含量达到最高，这与斯鑫鑫等^[10]的研究结果相似。在各处理菠菜采收后测得体内重金属 As、Pb、Cd 的累积量均低于 OF 菠菜，F1、 F2、F3 处理菠菜相比于 OF 体内 As 的累积量最大要低 17.61%，Pb 的累积量最大要低 25.9%，Cd 的累积量最大要低 28.63%。硒元素的添加可能会使菠菜对重金属 As、Pb、Cd 的吸收起到一定的拮抗作用，降低菠菜对重金属 As、Pb、Cd 的累积量，从而缓解该类重金属对菠菜生长的胁迫作用^[17]。

3 讨论

3.1 不同富硒微生物对有机肥养分和硒含量及形态的影响

蔬菜富集硒的含量与环境中的硒含量呈正相关，并且对不同外源硒的富集程度不同。蔬菜对生物硒的富集能力要强于 Na₂SeO₃，利用富硒微生物加快腐熟农业废弃物的堆肥进程，堆制出富硒有机肥培育安全的富硒蔬菜对农业发展和农业资源化利用具有一定的现实意义。堆肥温度有助于微生物分解转化物料，利用高温灭杀致病真菌，是判定堆肥中微生物活动及好氧堆肥腐熟程度的直接指标之一^[20]。T3 中的微生物组合能持续有机肥堆制的高温阶段最久，pH 变化幅度最大。T3 的 pH 先下降再升高的变化趋势可能是在升温阶段微生物快速繁殖，菜粕和菌渣中的蛋白质在生物菌的酶解作用下形成大量氨基酸，从而出现堆肥 pH 初始时的降低现象。但随着堆肥进程的推进，有机酸部分通过挥发散逸，部分被微生物当作能源摄入利用而逐渐减少。同时，氨基酸在脱氨基后产出的 NH₃ 被固氮菌利用，增加堆体铵态氮的累积量。有机酸、氨基酸、NH₃ 的共同作用导致 pH 先下降后快速升高^[20]。数据显示，T3 的总养分含量相较于 CK 增加了 13.70%，其中总氮含量增加了 26.06%；有机质的分解能力相较于 CK 提高了 4.88%。添加富硒微生物增加了有机肥的养分含量并且固氮菌转化累积出更多的氮源，减少堆肥氮素的损失，有机质含量在堆肥高温阶段下降幅度最大，这个阶段易于微生物生长繁殖，降解有机质的效率最高。到了堆肥后期，有机质降解速率变缓，可能是微生物在腐熟阶段的数量减少，并且剩下的碳源主要为较难分解的木质素等结构复杂的有机物^[21]。堆肥是不同微生物相互协调作用的复杂进程，复合菌剂的堆肥效果要优于单一菌种^[22]，聂晖等^[23]发现嗜热一氧化碳链霉菌与放线菌与保水剂混合能提高土壤养分和酶活性。鲁耀雄等^[24]研究认为复合菌如 EM 菌在牛粪堆肥中的堆肥效果高于枯草芽孢杆菌。本试验中 T3 的总硒（以纯 Se 计）比 CK 提高了 1.93 倍，其中的富硒枯草芽孢杆菌与富硒圆褐固氮菌利用蛋白质、纤维素等物质协同作用，促进物质的快速转化进程要快于富硒 EM 菌。EM 菌为乳酸菌、酵母菌、光合菌、放线菌等 80 多种微生物组合，添加 Na₂SeO₃扩培后可能会对细菌多样性和群落结构产生影响，抑制了部分微生物的降解能力。刘莹莹^[25]在木质素降解菌堆肥试验中，发现堆肥中硝化细菌和氨氧化细菌数量减少。所以 T3 中选择的枯草芽孢杆菌含有活性较强的芽孢，在无机硒的转化上更适于复合菌 EM 菌。微生物活动可将环境中的无机硒导入甲基，在自身合成有机硒储存下来，或将高价态的硒还原为零价硒及负二价化合物类如可挥发态的二甲基硒[（CH₃）₂Se]^[26]。其总硒含量高，但是利于植物吸收的 SOL-Se 含量减少，当硒进入堆肥试验时被堆体有机质吸附固定，微生物的腐殖化活动促使硒的价态发生变化或形成络合物而富集，从而决定了土壤中硒主要以 OM-Se 存在。硒的赋存形态是决定堆肥中硒生物有效性的重要因素，与动植物体硒营养状况关系密切，微生物生化作用加剧了硒赋存形态的变化程度，使 OM-Se 为主要占比，减少了像 RES-Se 等难以吸收形态的累积。OM-Se 在一定条件下可以重新释放出富里酸结合态硒，其矿化后呈现的小分子量有机硒如腐殖酸硒会更容易被植物体吸收成为土壤潜在有效态硒^[19]。试验表明 T3 在减缓硒向残渣态的衰老速度能力更强，固定住更多的有机态硒，促进富硒肥中硒的活化，提高硒的有效性，从而可以向植株起到缓释硒肥的作用。

3.2 施用不同富硒微生物肥料对菠菜的影响

盆栽试验中，F3 相比于 CK 不同程度地促进菠菜生长和提高体内叶绿素含量，使得菠菜总硒、有机硒含量达到最高，满足富硒食品中硒含量标准（Se ≥ 0.1 mg/kg）。硒可通过影响作物体内化合物水平来促进其生长，这与番茄^[27]、大蒜^[28]中的研究结果一致。前沿的研究者^[29]发现硒会提高辣椒体内的可溶性糖、可溶性蛋白含量。杨海涛等^[30]研究证明硒代蛋氨酸能提高小白菜中维生素 C、游离氨基酸含量，降低硝酸盐和粗纤维含量。陈铭等^[31]发现硒与各营养元素之间也会相互作用，既可以促进营养元素的吸收，也可以抑制某些元素的吸收，其原理可能与硒的形态相关。Li 等^[32] 发现硒一定程度地提高作物对 S、P、Ca、 Mn、Cu、Zn 的吸收。刘帅等^[33]认为施用 Na₂SeO₃会提高菜心根系调控 Fe、Zn 元素对地上部分的供应。本试验结果发现施用富硒微生物肥抑制菠菜对 As、Pb、Cd 重金属元素的吸收程度高于 OF。综合来看，T3 的富硒微生物有机肥具有更高的富硒效果，也验证出其提高了菠菜的富硒水平和作物产量，在废弃物堆肥工程化应用中为发展富硒功能农业提供理想的富硒方式。

4 结论

本试验分别接种不同富硒微生物到菌渣菜粕为原料的堆肥中，富硒微生物提高了堆体发酵温度，加快反应进程，增强有机质的分解能力。堆肥结束后其产品能有效促进种子萌发，提高肥料养分，在增加有机肥中硒含量的同时能改变硒的有效形态。在 38 d 的试验期内，所有试验组指标均满足《有机肥料》（NY/T525—2021）农业标准，其 T3 中的两种富硒微生物增加有机肥总养分、总氮、总硒含量的效果最明显。在盆栽试验中，施用添加 T3 的有机肥促进菠菜生物量的积累效果最明显，并达到富硒食品中的硒含量标准。综上所述，以添加 40 mg·L^-1 的 Na₂SeO₃培养接种量为 6% 枯草芽孢杆菌和圆褐固氮菌的复合菌液能有效提高有机肥的养分含量和硒含量。

参考文献