土壤是为植物提供维系生命的载体，容纳作物生长所需养分和水分，培育健康的土壤是地球上生命得以持续发展的必要条件。因此，提高土壤质量，保持土壤健康是实现农业可持续发展的关键因素。前人研究发现，当归连作障碍的成因非常复杂，主要由生物和非生物两种因素构成，生物因素主要是土壤微生物群落、结构失衡等；非生物因素是土壤物理结构和化学性质恶化、土壤养分流失、化感自毒作用、根系代谢物及根腐病菌积累等因素，均能加剧当归连作障碍的发生^[1-2]。

土壤微生物对植物生长及土壤农田微环境的调节至关重要，其群落结构和多样性受种植作物类型、耕作方式、土壤质量状况、土壤类型、土壤 pH 值、温度和湿度、作物根系分泌物等的影响^[3-5]。课题组前期研究发现：豌豆-黄芪-当归轮作模式较豌豆-当归-当归连作模式显著增加了当归根际土壤变形菌门和放线菌门细菌的相对丰度，是克服当归连作障碍的适宜种植模式^[5-6]。土壤真菌是土壤碳氮循环的主要动力，是土壤健康与否的指示物，其群落丰度与当归土传病害、连作障碍关系密切^[3，7-8]。因此，深入研究当归根际土壤真菌群落及其功能特征对于提高当归产量和品质及建立和优化合理轮作模式具有重要的实践意义。

种植不同作物对土壤环境中微生物群落结构和多样性的影响差异较大，在这种种植方式下会直接改变土壤微生物的生存环境，从而导致土壤环境中微生物的组成、丰度和活性发生变化^[9-10]。小麦、黄芪、马铃薯、当归是甘肃省渭源县的主栽作物，但随着当今社会的变迁、经济的发展，作物茬口的轮换是当地改变当归连作障碍的主要农业生产模式，豌豆-黄芪-当归、豌豆-小麦-当归等的轮作是如何影响甘肃省当归主产区渭源县当归田土壤微生物群落结构和丰度的变化仍不清楚。因此，本试验采用高通量测序 Illumina Misqe2500 平台，用 FUNGuild 预测类群功能营养方式的变化对栽培不同作物下当归田土壤真菌群落多样性及类群功能预测分析研究，在前期休耕和种植作物对当归田土壤养分影响及种植作物对当归根际的细菌群落多样性研究基础上开展了当归根际真菌微生物群落结构、多样性及功能类群的研究，旨在明确栽培不同作物土壤真菌群落多样性、优势种类、土壤理化因子与土壤真菌物种的相关性，解析栽培不同作物对土壤质量演替、土壤真菌群落及多样性的作用机理，建立道地当归优质高产与环境保护协调的养分资源管理体系，为当归高质量生产及连作障碍机理探讨提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

本试验设在当归主产区甘肃省渭源县莲蓬镇绽坡村（35.13°N，104.22°E），海拔 2100 m，年日照时数一般为 2406～2822 h。年均气温 5.7℃，年均降水量约 556 mm，全年无霜期约 165 d。土壤为黑麻土，是当归传统的道地产区。

1.2 田间试验设计

试验采用单因素随机区组设计。播种前该试验地种植当地主栽作物，2017 年 4 月 20 日播种“陇碗 2 号”豌豆，均衡土壤肥力，2018 年培育茬口，播种春小麦、黄芪、当归、马铃薯，不播种作物为休耕。田间管理同大田，2019 年选用大小一致的当归苗子移栽于各茬口小区，可构成豌豆-春小麦-当归（A）、豌豆-蒙古黄芪-当归（B）、豌豆-马铃薯-当归（C）、豌豆-当归-当归 （D）、豌豆-休耕-当归（E）5 种种植模式的土壤系统，各处理 3 次重复，小区面积 3.0 m×2.0 m，间距 0.5 m，共计 15 个小区。

1.3 土壤样品采集

2019 年当归采挖时随机选取各小区健康植株 18 株，轻抖、无菌袋收集紧密附着根系的土壤，编号并冷冻运回实验室，保存于-80℃超低温用于土壤真菌群落测定。

1.4 测定方法

采用 MN NucleoSpin 土壤 DNA 提取试剂盒（上海摩速科学器材有限公司，德国）抽提土样细菌总 DNA，引物序列如表1^[11-12]。扩增程序：95℃ 5 min，95℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 40 s，25 个循环， 72℃ 7 min，4℃保温；PCR 反应体系 10 μL：5 μL 缓冲液，2 mmol·L^-1 dNTP 2 μL，10 μmol·L^-1 Vn F/Vn R 特异性引物各 0.3 μL，KOD FX Neo 聚合酶 0.2 μL，50 ng DNA 模板 2.2 μL。PCR 产物委托百迈克生物科技有限公司，高通量测序平台 Illumina HiSeq 2500 双向测序。所得序列依据 PE reads 折叠关系，采用 Flash V1.2.11^[11] 拼接原始双端序列（Raw tags），采用数据质控 Trimmomatic V0.33 拼接过滤原始序列，得到高质量测序标签（Clean tags），采用 UCHIME V4.2 和 UCHIME V8.1 去除嵌合体，得到有效序列（Valid tags），采用 QIIME V1.8 和 USEARCH V10.0 97% 相似度聚类有效序列（Valid tags）^[12]、获得细菌分类操作单元（OTU）^[13]，采用最高相对丰度作为该细菌 OTU 的代表序列进行生物信息分析。

采用 SilvaRelease132（http://www.arb-silva.de）数据库注释细菌 OTU 序列在门、纲、目、科、属、种水平的群落组成，采用 Mothur v1.30.0^[12]和 Mothur V1.32.0（http://www.mothur.org/）分析各模式下当归根际土壤细菌群落的相对丰度和 α 多样性。

2 结果与分析

2.1 当归根际土壤理化性质分析

由表2 可知，5 种种植模式下当归根际理化特性差异性因指标而异。各种植模式 pH 值差异不显著。电导率（EC） 为 B>D>A>E>C，CO₂ 呼吸速率（${\mathrm{R}}_{{\mathrm{C}\mathrm{O}}_2}$） 为 E>B>A>C>D，有机质含量为 E>B>A>C>D，碱解氮（AN） 和速效钾（AK） 含量均为 D>C>A>B>E，有效磷（AP） 含量为 D>A>C>B>E。说明 B 模式有利于增加当归根际土壤的 EC，降低 AN 含量；E 模式有利于增加当归根际土壤的 ${\mathrm{R}}_{{\mathrm{C}\mathrm{O}}_2}$ 和有机质（OM）含量，降低 AN 和 AP 含量。

2.2 当归采挖期真菌多样性分析

不同处理方式对当归根际土壤真菌多样性产生了一定影响，5 种处理方式下根际土壤真菌 Chao1指数、Ace 指数、辛普森（Simpson）指数和香农 （Shannon）指数差异性不显著（P>0.05）。较对照 D 处理，A、B、C 和 E 处理的 Chao1 指数、Ace 指数和 Shannon 指数较低，Simpson 指数较高（表3）。5 种处理方式下根际土壤真菌 Chao1 指数和 Ace 指数的高低顺序均为 D>C>A>B>E；5 种处理方式下根际土壤真菌 Simpson 指数高低顺序为 E=B>C>A=D； 5 种处理方式下根际真菌 Shannon 指数高低顺序为 D>A>C>E>B。D 和 C 处理的 Chao1 指数、Ace 指数和 Shannon 指数较高，Simpson 指数较低。

注：同列不同小写字母表示不同种植模式之间差异显著（P<0.05）。下同。

2.3 不同处理对根际土壤真菌群落结构组成的影响

2.3.1 对根际土壤真菌门水平相对丰度的影响

5 种处理方式下当归根际土壤真菌群落在门水平的结构组成基本相似（图1）。真菌群落 OTUs 在门水平隶属于 11 个门，其中 4 个门的相对丰度≥ 5%，为优势真菌门，分别为子囊菌门（Ascomycota）相对丰度 50.89%（41.10%～61.62%）、被孢菌门 （Mortierellomycota）相对丰度 14.71%（13.11%～16.38%）、担子菌亚门（Basidiomycota）相对丰度 7.64%（4.56%～10.45%）、壶菌门（Chytridiomycota）相对丰度 3.87%（1.01%～8.15%）。与对照 D 相比，子囊菌门相对丰度 C、E 处理显著增加，B 处理显著降低，被孢菌门相对丰度 A、B、C 处理显著增加，担子菌亚门相对丰度 A、B、C、E 处理显著增加，壶菌门相对丰度 A、B、C、E 显著降低。

2.3.2 不同处理下根际土壤真菌属水平相对丰度

5 种不同处理下当归根际土壤真菌群落在属水平隶属于 167 个属（图2），其中 2 个属的相对丰度≥ 5%，为优势真菌属，即被孢霉属（Mortierella） 相对丰度 14.12%（12.30%～15.09%）、四枝孢属 （Tetracladium） 相对丰度 7.07%（3.45%～12.76%）。在属水平优势真菌相对丰度不同，被孢霉属相对丰度大小为 B>A=C>D>E，四枝孢属相对丰度大小为 A>C>B>D>E，网囊藻属（Plectosphaerella）、Solicoccozyma、赤霉菌属（Gibberella）、Lectera、周刺座霉属 （Volutella）、镰胞菌属（Fusarium）为非优势属，相对丰度值在 1% 以上。

注：Unk：未命名；Oth：其他；Aph：Aphelidiomycota；Rot：Rotifera；Olp：油壶菌门；Glo：球囊霉门；Cer：虫门；Chy：壶菌门；Bas：担子菌亚门； Mor：被孢菌门；Unc：未分类；Asc：子囊菌门。下同。

注：Unk：未命名；Oth：其他；Fus：镰胞菌；Vol：周刺座霉属；Lec： Lectera；Gib：赤霉菌属；Sol：Solicoccozyma；Ple：Plectosphaerella；Cha：毛壳菌属；Tet：四枝孢属；Mort：被孢霉属；Unc：未分类。

2.4 不同处理下根际土壤性质与真菌群落关联性分析

2.4.1 不同处理下根际土壤理化性质与真菌门水平微生物群落冗余度（RDA）分析

5 种处理方式根际土壤真菌群落多样性在门水平 X 轴和 Y 轴分别代表21.7% 和 12.33% 的变量 （图3）。当归田根际土壤理化因子对真菌群落的影响程度不同，蒙特卡罗检验显示：土壤真菌群落相对丰度值与${\mathrm{R}}_{{\mathrm{C}\mathrm{O}}_2}$、EC、AK 显著相关，与 pH 值极显著相关。土壤理化因子对当归田根际土壤真菌群落多样性在门水平贡献大小排序为 AK>EC>pH>${\mathrm{R}}_{{\mathrm{C}\mathrm{O}}_2}$>AN>AP>OM。

2.4.2 不同处理下根际土壤理化性质与真菌属水平微生物群落 RDA

5 种处理方式在属水平 X 轴和 Y 轴分别代表着 13.35% 和 8.45% 的变量（图4），蒙特卡罗（Forward selection）检验表明，当归田根际土壤真菌属水平群落多样性与 OM 显著相关。当归田土壤理化因子对根际土壤真菌群落多样性在属水平的贡献大小排序为 OM>pH>${\mathrm{R}}_{{\mathrm{C}\mathrm{O}}_2}$>AN>EC>AP>AK。

注：Kic：Kickxellomycota；Asc：子囊菌门；其余同图1。下同。

注：Ily：Ilyonectria；其余同图2 和图3。

2.5 不同处理下根际土壤理化性质与真菌微生物群落热图分析

2.5.1 不同处理下根际土壤理化性质与真菌微生物门水平群落热图分析

为了进一步明确不同茬口对当归根际土壤真菌群落与土壤理化性状的相关性，对真菌门菌群与土壤理化因子间进行皮尔森相关分析，在门水平皮尔森聚类（图5）发现：5 种处理下当归根际 AK 与油壶菌门极显著负相关、${\mathrm{R}}_{{\mathrm{C}\mathrm{O}}_2}$与油壶菌门极显著正相关；AK 与担子菌亚门极显著正相关；AK 与壶菌门显著正相关；土壤 pH 值与臭氧菌门（Kickxellomycota）显著正相关；EC 与子囊菌门（Ascomycota）显著正相关；OM 与球囊霉门（Glomeromycota）显著正相关。

在门水平皮尔森聚类图的左侧聚类树为物种聚类树，上方的聚类树为土壤理化性状的聚类树，两物种间距离越近，枝长越短，说明这两个物种的丰度越相似，图5 上方的聚类树表达的意义和左侧聚类树相似。从图5 可以看出，左侧的聚类树分为两大类型，Kickxellomycota 和油壶菌门为一类，其余的为另一类；从上部的聚类数可以看出，土壤理化特性也分为两大类，AK 为一类，其余指标聚为一类。而且土壤理化特性的聚类结果存在交叉现象。

2.5.2 不同处理下根际土壤理化性质与真菌微生物属水平群落热图分析

在属水平皮尔森聚类（图6）发现：5 种处理下当归根际 OM 和 ${\mathrm{R}}_{{\mathrm{C}\mathrm{O}}_2}$与土赤壳属（Ilyonectria）显著正相关，AN 与网囊藻属（Plectosphaerella）显著正相关，pH 值与四枝孢属（Tetracladium）极显著正相关，EC 与子囊菌门毛壳菌属（Chaetomium）显著正相关，OM 与 Solicoccozyma 显著负相关。以上表明，5 种处理下 OM、${\mathrm{R}}_{{\mathrm{C}\mathrm{O}}_2}$、AN、pH 值、EC 与 Ilyonectria、网囊藻属（Plectosphaerella）、四枝孢属（Tetracladium）、子囊菌门毛壳菌属（Chaetomium）具有正向相关性。

在属水平左侧和上部的聚类树表达的生物学意义和门水平的一样，左侧物种的聚类树也分为两大类，镰刀菌属（Fusarium）和慢生霉属（Bradymyces） 为一类，其余为另一类。从上部的聚类分析可以看出，pH、AN 以及 AP 为一类，AK 和 OM 以及 EC 和 ${\mathrm{R}}_{{\mathrm{C}\mathrm{O}}_2}$为另一类。

2.6 不同处理下根际土壤真菌 FUNGuild 功能预测分析

FUNGuild 预测了 5 种处理方式下土壤样品真菌群落的营养型和功能群，结果（图7）表明，5 种处理下根际土壤真菌群落相对丰度值较高的 10 个不同的营养型中有 5 条相对丰度值大于 2%，E 和 B 处理的腐生营养型植物腐生生物（Plant Saprotroph）相对丰度较高，C 处理居中，A 和 D 处理次之，B 和 E 处理增加了腐生营养型的相对丰度；B 和 E 处理的真菌寄生虫（Fungal Parasite）相对丰度较高，C 处理居中，D 和 A 处理次之。以上表明，B 处理病理营养型减少，腐生营养型增加，同时有些功能性真菌群落类型发生变化。说明 B 处理下土壤中微生物对凋落物、土壤动物粪便等有机物质的分解功能增强^[14-15]，这是 B 处理克服连作障碍的主要原因（图8）。

注：PP：植物病原体；WS：木头腐生生物；AP：动物病原体；PS：植物腐生生物；FP：真菌寄生虫。

3 讨论

3.1 不同处理对真菌多样性指数的影响

土壤是植物摄取营养的主要场所，土壤微生物多样性[形态、结构、代谢、生态、行为方式和进化（或遗传）]是微生物群落稳定性的特征^[16-17]。一般情况下，微生物多样性越好，土壤生物活性越强，越有利于植物生长。研究表明，高粱和玉米轮作的根际土壤 Shannon 指数显著高于高粱连作，表明轮作处理改变了土壤生态环境^[18]。林药复合系统根系土壤真菌 Chao1 指数、Ace 指数和 Shannon 指数显著增加，证明林药复合系统能够提高土壤真菌丰富度和多样性^[16]；高篙等^[19]对龙胆草根际土壤真菌群落结构的研究表明，随着种植年限延长，真菌多样性与生长年限呈负相关关系，根际真菌群落丰度和多样性指数呈明显下降趋势。本文对 5 种处理下当归土壤根际真菌 Alpha 多样性变化研究发现，B 和 E 处理下真菌种类较少，多样性较低。D 和 A 处理下真菌多样性较高，C 处理下真菌多样性次之，进一步证明轮作处理下真菌种类及多样性减少，轮作有利于真菌微生物朝有益方向发展。其原因是当归连作后根际土壤中有益微生物数量减少，有害微生物数量不断累积，使土壤中原有微生物动态平衡被打破，根际微生物活动降低，这是形成连作障碍的主要原因。本研究当归轮作处理真菌多样性降低，这一结果和前人研究结果相似^[20-21]。

3.2 不同处理对土壤真菌群落结构的影响

合理轮作能够提高土壤生产性能，调节土壤微生物动态变化^[22-24]。根际土壤生态系统中养分循环、有机质分解及土传病害发生过程反映了土壤质量的变化^[25]。土壤真菌群落物种受农田生态系统作物种植年限及作物种类的影响，真菌群落组成和相对丰度大小随着作物种类及连作年限变化而变化^[26]。本文采用高通量测序 Illumina Misqe2500 平台对不同茬口当归根际真菌群落多样性研究发现，短期连作和轮作下对真菌群落结构具有一定影响，在门水平下，子囊菌门相对丰度较高，其次为被孢菌门、担子菌亚门和壶菌门，这一研究结果与马欣等^[27]对不同种植年限紫花苜蓿土壤真菌研究及武睿对甘肃贝母茬口选择及其适应性机理的研究结果相似，表明子囊菌门为优势真菌门，但不同类型作物对其土壤环境作用不同，子囊菌门在不同研究对象中的相对丰度差异较大，高篙等^[19]对龙胆草的研究中相对丰度为 55.99%～66.38%，马欣等^[27]对苜蓿的研究中相对丰度为 55.12%～90.01%，武睿^[28]对甘肃贝母的研究中相对丰度为 60.20%～80.42%，本试验对当归研究中的相对丰度为 41.10%～61.62%。这是由于土壤分解菌多集聚于子囊菌门中，如腐生菌等，它们发挥特长将作物难以吸收利用的有机物质降解为作物容易吸收的养分，如角质素和木质素等分解成易被作物吸收利用的养分，种植不同作物后，残留在土壤中作物残茬和枯枝落物为子囊菌提供了不同底物来源，加之不同作物的根系分泌物不同，使子囊菌繁衍生长速度不同，导致不同研究对象的土壤中子囊菌相对丰度差异较大。被孢霉属真菌是土壤有益真菌，可以补氮溶磷，促进植物生长，提高植物抗病性。本研究被孢霉属真菌相对丰度较高，赤霉菌属、周刺座霉属、镰孢菌属相对丰度较低，健康植株土壤中的相对丰度显著高于发病植株土壤。玉米根系分泌糖和氨基酸，能促进微生物活化难利用的磷，进而提高了被孢霉属丰度。不同种植模式对被孢霉属真菌的影响不同，说明当归根际土壤被孢霉属真菌资源的挖掘还有待提高，这一研究结果与马欣等^[27]、王子夜等^[29]、张健等^[30]研究结果相似。

3.3 不同处理对土壤理化性状与真菌相关性的影响

反映土壤肥力状况的养分基本组成成分为 pH 值、有效氮、有效磷、速效钾、有机碳等，是药用植物有效成分累积及种类变化的主要影响因素，土壤质量及肥沃状况会直接影响药用植物生长特性、次生代谢产物合成，进而影响产量和品质，种植作物种类不同会直接改变根际土壤的理化性质^[31]。本研究 RDA 分析表明：5 种处理方式下当归根际土壤真菌群落多样性在门水平 X 轴和 Y 轴分别解释 21.7% 和 12.33% 的变量，在属水平 X 轴和 Y 轴分别解释 13.35% 和 8.45% 的变量。以上表明，不同处理方式当归根际土壤真菌群落组成除受土壤理化因子作用外，还受其他相关因素影响。这进一步印证了杨彦明等^[32]得出的玉米根际土壤细菌群落与土壤温湿度正向相关、与土壤气象因子负向相关，还受耕作措施影响的研究结果。因此，轮作条件下土壤理化因子对土壤微生物群落特征的影响还有待进一步研究。

Pearson 相关分析表明：在门水平上，EC 与子囊菌门显著正相关（P<0.05），表明 EC 对子囊菌门有正向驱动作用；AK 与油壶菌门极显著负相关 （P<0.01），与担子菌亚门、壶菌门极显著和显著正相关（P<0.01），表明 AK 与担子菌亚门、壶菌门和油壶菌门有正向和负向的驱动作用。在属水平， pH 值与四枝孢属极显著正向相关（P<0.01），表明 pH 值对四枝孢属起正向驱动作用。因此，EC、 AK、pH 为真菌多样性的主要驱动因子，聚类分析的结果也证实了这一发现。本试验中，土壤自身性质（基本的土壤理化特性和养分含量）是影响土壤真菌微生物群落结构差异的主要驱动因子，这一研究结果与 Tarin 等^[33]的研究结果土壤 pH 值、AK和 EC 等环境因子与土壤真菌群落呈显著相关关系，及与任春光等^[34]得出的猕猴桃苗不同生育期根际真菌群落结构及多样性土壤中速效养分含量与猕猴桃苗不同生长期真菌变化相互关系存在差异， EC 和 AK 是子囊菌门群落组成的主要驱动因子的研究结果相似。

3.4 根际土壤真菌群落的 FUNGuild 功能预测

土壤中含有的主要三大类微生物为真菌、细菌、放线菌，三者相比较，真菌的生活史较为复杂。真菌为了适应复杂多变的生活环境，在长期的生存演变过程中采取了较为高级的生存策略。病理营养型、共生营养型、腐生营养型、病理—腐生过度类型等是真菌最主要的营养方式^[13]。本研究发现，不同处理下，病理营养型和腐生营养型是主要的真菌营养类群。B 处理下，病理营养型减少，腐生营养型增加，同时有些功能性真菌群落类型也有变化，表明 B 处理下土壤中微生物对枯枝落叶、土壤动物尸体、粪便等物质的分解能力增强。由此可见，在豌豆-黄芪-当归处理下，真菌营养方式逐渐发生了变化，该研究仅是在年限较短的一个作物轮作周期内的试验结果，关于不同茬口对土壤真菌功能类群的长期影响需要进一步试验研究，为不同茬口对土壤真菌功能类群变化的影响及当归高效栽培模式的选择奠定了理论基础。

4 结论

（1）不同处理方式下真菌群落 OTUs 在门水平隶属于 11 个门，子囊菌门、被孢菌门、担子菌亚门和壶菌门为真菌优势菌门；被孢霉属、四枝孢属为真菌属的优势属。

（2）5 种处理方式下根际土壤真菌群落多样性在门水平 X 轴和 Y 轴分别代表21.7% 和 12.33% 的变量，土壤理化因子对当归田根际土壤真菌群落多样性在门水平贡献大小排序为 AK>EC>pH>${\mathrm{R}}_{{\mathrm{C}\mathrm{O}}_2}$>AN>AP>OM，表明 AK、EC、pH 值是门水平土壤真菌的主要驱动因子。5 种处理方式在属水平 X 轴和 Y 轴分别代表着 13.35% 和 8.45% 的变量，当归田土壤理化因子对根际土壤真菌群落多样性在属水平的贡献大小排序为 OM>pH>${\mathrm{R}}_{{\mathrm{C}\mathrm{O}}_2}$>AN>EC>AP>AK，表明 OM、pH、${\mathrm{R}}_{{\mathrm{C}\mathrm{O}}_2}$是属水平真菌的主要驱动因子。

（3）FUNGuild 预测表明，植物病原体（Plant Pathogen）和腐生营养型[木头腐生生物（Wood Saprotroph）]是真菌群落中较高的两个功能群。

参考文献