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水稻（Oryza sativa L.）是包括我国在内的亚洲国家最为重要的粮食作物，在保障粮食安全、保护生态环境方面具有举足轻重的作用。我国水稻田氮肥用量约为 N 180 kg/hm2，比全球平均水平高 75%[1]；加之氮素利用效率较低，造成了土壤质量退化和一系列氮环境污染问题，包括氨挥发和灰霾污染、水体富营养化和面源污染、地下水硝酸盐污染，以及氧化亚氮（N2O）排放等。以有益微生物为核心的新型生物肥料不仅可以部分替代化学肥料，还可以减少氮环境污染与温室气体排放，有利于强化水稻田生态系统减排增汇，从而促进水稻种植业绿色健康发展。
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N2O 在百年尺度的增温潜势约为 CO2 的 265 倍[2-4]。研究显示，全球人为排放的 N2O 主要是来自农业土壤，其中，由微生物活动引起的硝化和反硝化过程是农业土壤中 N2O 排放的主要来源。反硝化过程中由 nosZ 基因编码的氧化亚氮还原酶（nitrous oxide reductase）可将 N2O 还原为氮气（N2），是已知的生物途径中 N2O 唯一的汇[5-8]。温度是影响微生物生长和酶活性的重要因素，当温度适宜时，微生物的生长较快，相关酶活性也较高[9-10]。目前，来自土壤环境中的反硝化细菌还原 N2O 能力的相关研究较少[10-11]。
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植物根际促生菌（PGPR）指存在于植物根际周围的一类可促进植物生长及其对养分元素吸收利用、提高作物对非生物胁迫的抗性、防治作物病害并有效降低病原物对作物危害等有益细菌的总称，是植物根际微生物群落的重要组成部分，也是微生物肥料最重要的菌种来源。含有 nosZ 基因的 PGPR 在减少农田土壤 N2O排放中起着重要作用[12-15]。如果能分离筛选到含有 nosZ 基因的 PGPR，研究其还原 N2O 的能力并评价其植物促生潜力，将为通过生物技术途径调控土壤 N2O 排放、有效减少温室气体排放和开发新型微生物肥料提供关键科学基础[11]。
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用于生物肥料的 PGPR 通常以芽孢杆菌属细菌为主，效果大多集中在促生、抑病和抗逆等方面，具有生态环境效应的生物肥料十分有限。分离筛选具有温室气体减排等生态环境效应的 PGPR，将为发展新型的生物肥料提供宝贵的菌种资源。水稻田是典型的人工湿地，从水稻田、池塘等相近环境分离 N2O 还原细菌，将有利于菌株应用后快速适应环境和发挥作用。本研究拟从这些环境分离筛选具有 N2O 还原能力的 PGPR，为水稻田新型生物肥料创制和绿色低碳发展战略提供关键菌种资源。
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1 材料与方法
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1.1 菌株来源
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N2O 还原细菌 YSQ030 分离自江苏省南京市江北新区某水塘芦苇根际土，分离筛选培养基为固氮培养基，纯化培养基为 1/100 含硝酸钠和琥珀酸钠的营养肉汤培养基（NBNS）。纯化 5～6 代后，-80℃超低温保存，待用。
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1.2 培养基
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分离固氮培养基（g/L）：酵母提取物 0.5，甘露醇 20，KH2PO4 0.2；K2HPO4 0.8，MgSO4·7H2O 0.2； CaSO4·2H2O 0.1，FeCl3 0.0025，Na2MoO4·2H2O 0.0025，琼脂 15；灭菌前培养基 pH 7.2。
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纯化培养基为 NBNS：多聚蛋白胨 5 g/L，牛肉浸粉 3 g/L，NaNO3 0.3 mmol/L 和琥珀酸钠 4 mmol/ L，灭菌前培养基 pH 7.2～7.5。
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反硝化培养基（g/L）：KH2PO4 1.5，Na2HPO4·7H2O 5.0，MgSO4·7H2O 0.1，KNO3 1.0，丁二酸钠 4.7，微量元素母液2 mL/L；灭菌前培养基 pH 7.0。
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微量元素母液（g/L）：Na2EDTA 50，MnCl2·4H2O 5.06，ZnSO4·7H2O 2.2，CuSO4·5H2O 1.57，CaCl2 5.5， NaMoO4·4H2O 1.1，FeSO4·7H2O 5.0，CoCl2·6H2O 1.61。
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水稻幼苗培养液为霍格兰营养液，购买自山东省青岛市高科技工业园海博生物技术有限公司，按生产商说明书配制，使用前调节 pH 至 5.8。
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1.3 菌株形态观察、生理生化特征分析和基因序列分析
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1.3.1 菌株形态观察
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挑取单菌落进行革兰氏染色，在光学显微镜下进行显微形态观察。
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1.3.2 菌株生理生化特征
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利用 Biolog 半自动细菌鉴定仪分析菌株生理生化特性，按 BiologGen Ⅲ MicroPlateTM 使用说明书操作。
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1.3.3 菌株 16S rRNA 基因序列分析
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采用细菌全基因组试剂盒提取菌株的基因组 DNA，作为模板扩增 16S rRNA 基因。PCR 扩增所用引物为 27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，1492R：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′。PCR 反应体系 （20 μL）：DNA 聚合酶（Taq 酶）0.1 μL，10×PCR buffer 2 μL，dNTP（2.5 mmol/L）1.6 μL，27F（10 μmol/L）0.4 μL、1492R（10 μmol/L）0.4 μL，DNA 模板量（50～100 ng/μL）0.1 μL，dd H2O 15.4 μL。 PCR 扩增程序为：① 95℃预变性 10 min；② 95℃变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 90 s；③第②步 32 个循环；④ 72℃ 终延伸 7 min。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测、割胶回收后进行测序。测序结果在 NCBI 数据库中进行同源性比对分析。下载同属的序列和外源序列，用 MEGA5.22 进行 cluster 比对，邻接法绘制 16S rRNA 基因序列的系统发育树。
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1.3.4 菌株 nosZ 基因扩增
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以菌株 YSQ030 的 DNA 为模板，用特异性引物扩增 nosZ 基因。PCR 扩增所用引物为 nosZ-F-1181： 5′-CGCTGTTCITCGACAGYCAG-3′，nosZ-R-1880： 5′-ATGTGCAKIGCRTGGCAGAA-3′。PCR 反应体系 （25 μL）：DNA 聚合酶（Taq 酶）0.125 μL、10×PCR buffer 2.5 μL、nosZ-F-1181（50 μmol/L）0.2 μL、 nosZ-R-1880（50 μmol/L）0.2 μL、dNTP（2.5 mmol/L）2 μL、DNA 模板量（50～100 ng/μL）0.5 μL、ddH2O 19.475 μL。PCR 扩增程序为：① 94℃ 预变性 2 min；② 94℃变性 30 s，60℃退火 45 s， 72℃延伸 45 s；③第②步 32 个循环；④ 72℃延伸 6 min。PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳检测、割胶回收后进行测序。测序结果在 NCBI 数据库中进行同源性比对分析。下载同属的序列和外源序列，用 MEGA5.22 进行 cluster 比对，邻接法绘制 nosZ 基因序列的系统发育树。
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1.4 菌株 N2O 还原能力的测定
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1.4.1 菌株的培养与准备
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挑取 YSQ030 单菌落，接种于经高压灭菌的装有 100 mL 反硝化培养基的 250 mL 三角瓶中，用封口膜封口，置于 30℃、200 r/min 的摇床（ZQZY-88CN，上海知楚仪器有限公司，中国）中培养 36 h。
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1.4.2 样品的采集与 N2O 含量测定
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培养 36 h 后，将菌液倒入 10 mL 离心管中，4000 r/min 转速离心 10 min，用无 KNO3 的反硝化培养基洗涤 2 次，用 10 mL 无 KNO3 的反硝化培养基充分悬浮；加入装有 30 mL 无 KNO3 的反硝化培养基的顶空瓶中，密封；同时向顶空瓶中加入 40 mL 无 KNO3 的灭菌反硝化培养基作为空白对照，试验处理与空白对照均设置 3 个重复。接着用氩气置换顶空瓶中气体，抽真空 1 min，重复 3 次；最后充入 216.1 μg/L 的 N2O 气体；置于 30℃、200 r/min 摇床内培养 4 h 后，将顶空瓶取出，采集 N2O 气体。采用气相色谱仪（Agilent 7890 A，USA）测定 N2O 浓度，即培养后的 N2O 含量。气相色谱仪分析柱为 Poropak Q 填充柱，柱箱温度为 60℃，载气为 99.999% 的高纯氮气；后检测器为微池电子捕获检测器（ECD），用于测定气体样品中的 N2O 浓度，工作温度为 400℃，尾吹气为 5% 氩甲烷标准气（99.999%），流量为 2 mL/min，最低检测下限为 32μg/kg。
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1.4.3 温度对菌株 N2O 还原能力的影响
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明确纯培养条件下温度对菌株 N2O 还原能力的影响。除培养温度设置为 20、30 和 40℃外，其他条件均与 1.4.2 一致。
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1.5 菌株的促生特性
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1.5.1 菌液制备
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挑取菌株 YSQ030 的单菌落，接种于 NBNS 液体培养基中，置于 30℃、200 r/min 的摇床（ZQZY-88CN，上海知楚仪器有限公司，中国）中培养 12 h。将菌液倒入 10 mL 离心管中，在 4000 r/min 转速下离心 10 min，接着用 1/5 霍克兰培养液重悬，稀释至约 105 CFU/mL，菌液待用。
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1.5.2 水稻水培试验
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选取籽粒饱满、大小均匀的水稻南粳 44 的种子，进行表面消毒（70% 酒精浸泡 1 min，无菌水冲洗 3 次，2.5% NaClO 浸泡 15 min），无菌滤纸吸干表面水分。将 1.5.1 中的 NBNS 菌液离心后用 1/5 霍克兰培养液重悬，然后将菌液接种到水稻种子；以 1/5 无菌的霍克兰培养液作为对照。将处理后的水稻种子放置于育苗盘中，于 25℃光照培养箱中培养，每周更换一次培养液，培养 2 周后，测定幼苗株高、地上部鲜重和根鲜重，计算总鲜重和根冠比。每个处理 10 个重复（10 株幼苗），运用 SPSS 19.0 对水稻幼苗促生试验结果进行独立样本 t 检验（P<0.05）。
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2 结果与分析
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2.1 菌株的形态观察与鉴定
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分离筛选的 N2O 还原细菌 YSQ030 在 NBNS 培养基上培养 36 h 后，菌落呈圆形、轻微隆起、淡黄色，湿润、半透明、边缘整齐、光滑（图1a）；液体培养静止时有菌膜形成（图1b）。革兰氏染色和生理生化结果显示，YSQ030 菌株经革兰氏染色呈阴性、杆状、无芽孢，液化明胶，产铵，还原硝酸盐，水解淀粉，产生生长素，溶磷，可形成生物膜。
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图1 菌株 YSQ030 的表型特征
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注：图 a 为菌株在平板上形态特征；图 b 为发酵液状态。
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菌株 YSQ030 经测序得到长度为 1407 bp 的 16S rRNA 基因片段。在 NCBI 数据库中进行 BLASTN 序列比对，发现 YSQ030 与无色杆菌属 （Achromobacter sp.）的多株菌的 16S rRNA 基因相似性为 99%。将菌株 YSQ030 的 16S rRNA 基因片段存入 GenBank，登录号为 OQ519915。通过检索与 YSQ030 亲缘性相近菌株比对并建系统发生树 （图2），结果表明，该菌与多株无色杆菌（Achromobacter spp.）高度同源。进一步采用 Biolog 自动微生物鉴定系统的 GENIII 微孔板鉴定其表型指纹 （表1），即通过四氮唑类染料发生氧化还原反应时的颜色变化，来指示菌株对碳源的利用程度以及对化学物质的敏感程度，将 YSQ030 鉴定为反硝化无色杆菌（Achromobacter denitrificans）。
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图2 菌株 YSQ030 的 16S rRNA 系统发育树
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注：括号中的数字是 GenBank 中的序列登录号，节点上的数字表示邻居加入分析的引导值。通过邻接法构建，并基于 1000 次重复对其进行评估。下同。
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注：+ 表示可利用或敏感；-表示不可利用或不敏感；/ 表示介于可利用或敏感和不可利用或不敏感之间。
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以 nosZ-F-1181、nosZ-R-1880 为引物对菌株 YSQ030 的基因组 DNA 进行扩增，并进行琼脂糖凝胶电泳检测，在 700 bp 左右可见清晰的特异条带。测序后在 NCBI 数据库中进行 BLASTN 序列比对，发现 YSQ030 与无色杆菌属的多株菌的 nosZ 基因相似性为 99%。这些结果表明该菌含有 nosZ 基因，一定程度上证明该菌可还原 N2O。将菌株 YSQ030 的 nosZ 基因片段存入 GenBank，登录号为 OQ565744。通过检索与 YSQ030 亲缘性相近菌株比对并建系统发生树（图3），结果表明，该菌与多株无色杆菌高度同源。
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图3 菌株 YSQ030 的 nosZ 基因系统发育树
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2.2 菌株 YSQ030 还原 N2O 的能力
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菌株在 30℃、转速为 200 r/min、氧气浓度为 0% 的培养条件下，向反硝化培养基中充入 216.1 μg/L 的 N2O 反应 4 h 后，处理组剩余 64.4 μg/L 的 N2O，菌株的 N2O 还原量用对照组（ 无 KNO3 的灭菌反硝化培养基）剩余的 N2O 含量减去处理组 （YSQ030）剩余的 N2O 量，结果显示，菌株还原 N2O 效率为 66.3%（图4），表现出了较高的 N2O 还原能力。
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图4 菌株 YSQ030 还原 N2O 的能力
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注：处理前表示培养前充入 216.1 μg/L 的 N2O，对照处理后表示充入 216.1 μg/L 的 N2O 后未接种菌株 YSQ030 培养 4 h，YSQ030 处理后表示充入 216.1 μg/L 的 N2O 后接种菌株 YSQ030 培养 4 h。
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温度变化可能会影响细菌的氧化亚氮还原酶活性。在 20℃条件下 YSQ030 的 N2O 浓度范围、平均值和变异系数分别为 144.3～156.3 μg/L、 151.7 μg/L 和 0.02，对照组则分别为 190.5～201.0 μg/L、194.6 μg/L 和 0.02；在 30℃条件下 YSQ030 的 N2O 浓度范围、平均值和变异系数分别为 10.7～108.4 μg/L、64.4 μg/L 和 0.44，对照组则分别为 202.0～211.0 μg/L、207.6 μg/L 和 0.01；在 40℃条件下 YSQ030 的 N2O 浓度范围、平均值和变异系数分别为 166.6～170.2 μg/L、168.8 μg/L 和 0.01，对照组则分别为 196.6～213.2 μg/L、207.5 μg/L 和 0.03。在 20、30 和 40℃条件下，根据处理组（YSQ030）和对照组（无 KNO3 的灭菌反硝化培养基）N2O 消耗量的差值可以得出，菌株 YSQ030 还原 N2O 的效率分别为 19.8%、66.3% 和 17.9%（图5）。在供试的 3 个培养温度中，菌株 YSQ030 还原 N2O 的最佳温度是 30℃，此时 N2O的还原效率最高。随着温度的降低或者升高，N2O 的还原效率均下降，但仍有一定的 N2O 还原能力，表明该菌株对于温度的改变具有一定的适应能力。
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PGPR 是微生物肥料的重要菌种来源，具有 N2O 还原特征的 PGPR 可以减少农田土壤 N2O 的排放。最新研究表明，在土壤、肥料表面或者植物根际接种 N2O 还原细菌或具有 N2O 还原特征的 PGPR 可以减少 N2O 的排放[6，14-18]。例如，在纯培养体系和蛭石盆栽试验体系中，在大豆根部接种含 nosZ基因的大豆根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）可以减少 N2O 的排放[6]；在田间种植条件下，于大豆根部接种含 nosZ 基因的大豆根瘤菌可以减少大豆收获后其根瘤降解过程中产生的 N2O[6]；接种 N2O 还原菌至添加畜禽粪便有机肥的土壤中，可以减排 N2O[14]；接种具有 N2O 还原功能的固氮细菌到牧草地土壤，可以促进牧草生长，同时减少土壤 N2O 的排放[15]。本研究筛选获得的反硝化无色杆菌 YSQ030 含有 nosZ 基因，并且产生植物生长素，可以溶磷、产铵，在水培条件下还可以促进水稻生长，表明其为一株具有 N2O 还原特性的植物促生菌。
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图5 不同温度条件下菌株还原 N2O 的效率
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农业土壤是 N2O 的重要人为排放源，土壤微生物是影响农田土壤 N2O 排放的关键生物因素，决定着 N2O 的产生和消除过程。通常观测到的 N2O 净排放是土壤中 N2O 产生微生物和还原微生物相互作用的结果。农业土壤 N2O 产生的微生物过程主要是硝化和反硝化作用，而 N2O 还原为 N2 的过程则主要由含 nosZ 基因的 N2O 还原细菌来完成。研究人员从不同的生境中分离筛选到反硝化细菌[10，19-23]，种类主要来自芽孢杆菌属（Bacillus）、产碱菌属 （Alcaligenes）、假单胞菌属（Pseudomonas）、盐杆菌属（Halobacterium）、根瘤菌属（Rhizobium）、 Pseudogulbenkiania、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）等。本研究分离筛选到的菌株为无色杆菌属 （Achromobacter），无色杆菌属为土壤中的优势菌群[24]。无色杆菌属的一些细菌具有降解环境污染物的功能[25]，还具有优良的植物促生特性[26-27]和缓解非生物逆境胁迫的特性[28-29]等。本研究筛选获得的反硝化无色杆菌 YSQ030 在纯培养条件下可以还原 N2O，表明其具有减少农田土壤 N2O 排放的潜力。
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2.3 菌株 YSQ030 的促生特性
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由表2 可得，菌株 YSQ030 对水稻幼苗生长具有明显的促进作用。与对照相比，接种 YSQ030 处理对水稻的地上部鲜重、根鲜重和总鲜重均有显著提高，分别提高了 48.3%、37.6% 和 42.6%。根冠比是指水稻根系与茎、叶鲜重的比值，反映水稻地下部分与地上部分的相关性，接种 YSQ030 相对于对照没有明显增加水稻株高和根冠比。
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注：同一列不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。
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水稻田氮肥施用量大、氮素利用效率低加剧了农业面源污染、空气雾霾和地下水硝酸盐超标等环境污染和全球变暖。从水稻田等湿地环境分离筛选具有 N2O 还原功能的微生物，发展新型生物肥料，不仅可以部分替代化学肥料，还可以减少水稻田氮环境污染与温室效应。水稻土中优势的 N2O 还原细菌包括固氮螺菌属（Azospirillum）、草螺菌属（Herbaspirillum）、Bradyrhizobium 和固氮弧菌属 （Azoarcus）的细菌；研究者已经从水稻土中分离到这些细菌属的一些微生物菌株[19，30-32]。接种这些 N2O 还原细菌到有机肥或土壤，可以在室内模拟试验和田间原位试验条件下减少 N2O 排放[14]。此外，在温室盆栽试验条件下，接种固氮螺菌属和草螺菌属的 N2O 还原细菌不仅可以减少牧草地土壤 N2O 排放，还可以促进牧草生长[15]。然而，同时具有促进水稻生长和减少 N2O 排放的微生物尚未见报道。本研究分离筛选到了具有 N2O 还原功能的无色杆菌 YSQ030，其对水稻具有明显的促生作用，将为发展水稻专用生物肥料提供核心菌种。此外，本研究还明确了 YSQ030 还原 N2O 的适宜温度。这将为大量分离筛选具有生态环境效应的 PGPR、明确其发挥作用的适宜环境条件提供新思路，也将为发展新型生物肥料、减少化肥用量和农业绿色低碳发展提供实际指导。N2O 还原细菌通常将 N2O 还原为氮气，但本研究仅以未接种对照的 N2O 浓度与接种 YSQ030 的浓度差来评价 N2O 的还原能力，还缺乏直接还原为氮气的证据。后续研究可通过测定氮气浓度来评价细菌的 N2O 还原能力以进一步提供证据。
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3 结论
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本研究采用纯培养试验，从水塘芦苇根际土中分离筛选到一株含 nosZ 基因、在反硝化培养基中生长状况良好的菌株，命名为 YSQ030；经 Biolog Gen Ⅲ微孔板鉴定其表型指纹和 16S rRNA 基因序列分析，将 YSQ030 鉴定为反硝化无色杆菌；在不同培养温度条件下，菌株 YSQ030 还原 N2O 的能力不同。在供试温度中，30℃时菌株还原 N2O 的效率最高，为 66.3%；随着温度的升高或者降低其还原 N2O 能力相对减弱，但仍然具有较强的还原 N2O 能力；在温室水培条件下，与不接种的对照相比，接种菌株 YSQ030 对水稻幼苗的地上部鲜重、根鲜重和总鲜重均有显著的促进作用。在田间应用条件下，YSQ030 对作物的生长和对农田土壤 N2O 排放的影响还需要进一步的研究。
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摘要
筛选获得具有氧化亚氮（N2O）还原活性及植物促生特性的细菌，为新型微生物肥料的研发与应用提供微生物资源。通过固氮培养基筛选以及含硝酸钠和琥珀酸钠的营养肉汤培养基纯化，从水塘芦苇根际土中分离得到一株细菌 YSQ030；通过形态观察、16S rRNA 基因序列和生理生化特征分析，对菌株进行鉴定；采用无氮反硝化培养基测定菌株的 N2O 还原能力；通过纯培养试验测定菌株的促生特征并通过水培试验研究其对水稻的促生效应。结果显示，菌株 YSQ030 为反硝化无色杆菌（Achromobacter denitrificans），含 nosZ 基因；在 30℃、转速为 200 r/min、氧气浓度为 0% 的前提下，还原 N2O 的效率为 66.3%；分泌吲哚乙酸、具有溶磷和产生 1- 氨基环丙烷 -1- 羧酸（ACC）脱氨酶的能力；温室水培试验结果表明，与未接菌的对照组相比，接种 YSQ030 菌液显著提高了水稻幼苗的地上部鲜重和根鲜重，分别增加了 48.3% 和 37.6%。本研究表明，YSQ030 具有明显的 N2O 还原能力，同时对水稻生长具有显著的促进作用，可为进一步构建具有 N2O 还原能力的生物肥料提供良好的种质资源。
Abstract
Aimed to screen bacteria with nitrous oxide（N2O）-reducing and plant growth-promoting abilities that provide microbial resources for the development and application of new biofertilizers. A bacterial strain named YSQ030 was isolated from the rhizosphere soil of common reed grown in a pond through azotobacter mannitol agar plate，and purified on nutrient broth media containing sodium nitrate and sodium succinate. The strain was further characterized through morphological observation，16S rRNA gene sequencing，and physiological and biochemical characteristics analyses. The N2O-reducing activity of this strain was measured in a nitrogen-free denitrification medium. Meanwhile，the plant growth-promoting characteristics of this strain was determined under pure culture condition. Moreover，the plant growth-promoting effect on rice was determined under hydroponic condition. The results showed that the strain YSQ030 was a Achromobacter denitrificans possessing nosZ gene that encodes N2O reductase. The N2O reduction efficiency was 66.3% when YSQ030 was cultured in vial with 0% of oxygen concentration in headspace at 30℃ and 200 r/min. The strain YSQ030 could produce indole-3-acetic acid，solubilize phosphate，and synthesize 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase. The inoculation with YSQ030 significantly increased the fresh weight of rice seedlings and roots by 48.3% and 37.6% compared with the non-inoculated control，respectively，in a greenhouse hydroponic experiment. This study suggests that the strain YSQ030 has promising N2O-reducing ability and plant growth-prompting effect on rice，thereby providing invaluable microbial resources for the development of biofertilizer with N2O-reducing ability.