磷作为土壤主要的大量营养元素，通常以无机和有机两种形式存在^[1]。在农业生产过程中，磷元素参与植物体内光合作用、能量转移、碳水化合物代谢和细胞分裂等多个新陈代谢过程，而且还存在各类酶中参与其活性和功能的调节过程^[2]。研究表明磷是一种沉积性矿物，绝大部分易与 Ca²⁺、Fe²⁺ 等金属阳离子结合形成难溶的无效磷酸盐，造成土壤中有效磷含量下降，很难被植物吸收利用，因此，土壤缺磷往往成为植物生长的限制因素^[3-5]。目前，施加有机和化学磷肥是缓解土壤缺磷的主要手段，但在施用过程中存在利用率低、环境污染和土壤酸化板结等问题。解磷微生物作为能够将土壤中难溶性磷酸盐活化成易被植物吸收利用的可溶性磷酸盐的特定微生物类群，可以在不增加化学磷肥的情况下提高土壤有效磷含量，改善植物磷素营养状况^[6]。

根际微生物作为土壤和植株两者之间的连接体，在两者物质和能量循环中发挥着至关重要的作用，其中解磷菌可将难解磷矿盐转化为可被植物吸收利用的有效磷，既能提高土壤的有效磷含量，减少环境污染^[7-8]，还能有效提高植物抗逆能力^[9-10]。近年来，随着国家各项绿色农业政策的实施，开发新的促生菌剂、微生物肥料逐渐受到重视，解磷微生物的应用已经成为当前的研究热点^[11]。土壤中解磷菌的种类和磷源不同，其解磷的机制也不同，迄今为止，国内外研究较多的溶解磷酸盐的菌株已有 20 多个属，主要包括假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、根瘤菌属（Rhizobium）、链霉菌属（Streptomyces）、青霉属（Penicillium）、曲霉属（Aspergillus）等。在蚯蚓体内分离筛选解磷细菌（PSB）时得到一株解磷活性最高的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），而且对长豇豆和黄葵种子萌发以及植株生长有一定的促进作用^[12]。木霉菌（Trichoderma）是一类生防菌，可有效防治土传病害，吴紫燕等^[2]发现木霉菌 Tr940 的解磷效果好，同时还可以促进番茄幼苗生长。普凤雅等^[13]从薏苡幼苗中筛选发现，短小芽孢杆菌 R24 溶解有机磷的能力最强，贝莱斯芽孢杆菌 L21 溶解无机磷的能力最强，可溶性磷含量分别达到 37.2、 62.93 mg/L，而且可促进薏苡生长。

植物根际土壤是植物新陈代谢和能量转化最重要的部位之一，其中存在着数量可观的微生物，数量远远高于普通土壤^[14-15]。桃作为世界核果之首，因其色艳味美深受大家喜爱。平谷大桃种植历史悠久，曾荣获“国家地理标志保护产品”，近几年种植面积 1.33 万 hm² 左右，200 多个品种。经调查发现，由于乱施有机肥导致桃园氮素过盛，有机质含量偏低，土壤微生物区系发生变化，桃品质受到影响。因此，通过施用微生物菌剂，改善土壤微生态环境，保证平谷大桃品牌化种植，推动大桃产业升级，实现可持续发展势在必行。本研究以‘油蟠 7’为研究对象，对桃树根际土壤微生物进行分离，并通过盆栽试验做进一步验证，筛选出高效且具有促生特性的解磷菌，为进一步开发微生物菌肥提供资源菌株和理论依据，也为生物肥料的应用和推广提供指导意义。

1 材料与方法

1.1 土壤样品采集

采样地点位于北京市平谷区‘油蟠 7’桃园。选择健康的桃树作为取样目标，采用 5 点混样法，用铲子去除地表植被和杂物，使用土钻获取土和根系的混合样，挑出细根，轻刷根际土壤于密封袋中并编号，样品充分混匀后共 100 g，带回实验室于 4℃冰箱保存。

1.2 供试培养基

PDA 培养基：去皮马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，水 1000 mL，pH 自然，固体培养基在液体培养基的基础上加入 18 g 琼脂粉。

LB 培养基：胰蛋白胨 10 g、酵母提取物 5 g、 NaCl10 g、水 1000 mL，pH 自然，固体培养基在液体培养基的基础上加入 18 g 琼脂粉。

无机磷培养基：葡萄糖 10.0 g、NaCl 0.3 g、 KCl 0.3 g、（NH₄）₂SO₄ 0.5 g、MgSO₄·7H₂O 0.3 g、 FeSO₄·7H₂O 0.03 g、MnSO₄ 0.03 g、Ca₃（PO₄）₂ 10 g、蒸馏水 1000 mL，pH 自然，固体培养基在液体培养基的基础上加入 18 g 琼脂粉。

有机磷培养基：葡萄糖 10.0 g、NaCl 0.3 g、 KCl 0.3 g、（NH₄）₂SO₄ 0.5 g、MgSO₄·7H₂O 0.3 g、 FeSO₄·7H₂O 0.03 g、MnSO₄ 0.03 g、卵磷脂 2 g、蒸馏水 1000 mL，pH 自然，固体培养基在液体培养基的基础上加入 18 g 琼脂粉。

1.3 解磷菌的分离筛选

将根际土过筛处理后，配成 3 个梯度的土壤悬液，采用稀释涂布平板法在无机磷固体培养基表面进行分离纯化，28℃培养 5 d，挑选呈现透明圈不同形态的菌落，在无机磷固体培养基上多次划线纯化，得到单菌落后编号。

1.4 菌株解磷能力的测定

1.4.1 定性测定

活化初筛后选出的 3 株解磷菌，分别点接于无机磷和有机磷固体平板上，每个菌株重复 3 次， 28℃培养 7 d，观察是否出现解磷圈，用游标卡尺测量解磷圈直径（D）、菌落直径（d）。根据解磷指数（D/d）大小初步确定菌株的解磷能力。

1.4.2 定量测定

活化初筛后的菌株于 LB 液体培养基和 PDA 液体培养基，摇瓶发酵分别培养，调整 600 nm 波长的吸光度值（OD₆₀₀）至 1.0，将菌株发酵液按 5% 比例接种到无机磷、有机磷和磷矿粉液体培养基中，以加入等量无菌水作空白对照（CK），28℃， 200 r/min 摇床培养，分别在培养第 2、4、6 d 取待测菌株发酵产物 8000 r/min 离心 10 min 后，采用钼锑抗比色法测定各菌株上清液有效磷含量，同步用酸度计测定其 pH。

$X=\frac{P\times V_1\times K}{V_2}$

式中，X 为上清液中磷的含量（mg/L）；P 为磷标准曲线上查得的磷的质量浓度（mg/L）；V₁ 为显色液体积 （mL）；K 为稀释倍数；V₂ 为吸取上清液体积（mL）。

1.5 盆栽试验

将待测菌株于 28℃、200 r/min 振荡培养 2 d 后得到发酵液，用于后续试验。种植前每盆装入 2 g 磷矿粉和 2 kg 园土，混合均匀作为栽培基质，每盆播种 4 粒玉米种子，待玉米幼苗长至 3 片子叶时，间苗至 2 株。试验采用随机区组设计，设置 4 个处理，每个处理 3 组重复，分别为添加 JP01 菌悬液、PG62 菌悬液、5% 磷活化剂（由深圳市芭田生态工程股份有限公司提供）和不接菌对照（CK）。采用灌根法，每盆灌入 20 mL 菌悬液和磷活化剂 （5%），置于温室大棚培养，出苗 10 d 后补灌一次菌悬液。第一次接菌 30 d 后测量玉米株高、茎粗、干重，植物全磷以及土壤有效磷含量。

1.6 菌株鉴定

1.6.1 菌株形态观察

将筛选出的解磷效果好的菌株接种到固体培养基上培养 24～72 h，观察菌落形状、颜色等特征，使用光学显微镜观察菌体形态。

1.6.2 菌株分子生物学鉴定

将筛选出的解磷菌纯培养后送至农业农村部微生物肥料和食用菌菌种质量监督检验测试中心进行 ITS rDNA 和 16S rDNA 测序，并使用 MEGA 7 的 Neighbor-Joining 法构建系统发育树。

1.7 数据分析

利用 Excel 2013 整理数据及制图，采用 SPSS 27.0.1 对数据进行单因素方差分析，应用 Duncan’s 法进行显著性检验。

2 结果与分析

2.1 根际解磷菌的初筛

经 28℃初筛培养 7 d 后，发现有 3 个菌株能在 Ca₃（PO₄）₂ 无机磷平板上生长，同时产生解磷圈，将其分别编号为 JP01、JP03 和 PG62。培养过程中发现，菌株 JP01 培养第 3 d 可产生解磷圈，随着培养时间的增加，解磷圈逐渐增大，在第 6 d 达到最大值。菌株 PG62、JP03 虽也可产生解磷圈，但解磷圈比 JP01 小，表明其在固体培养基中的解磷能力不如菌株 JP01（图1）。

2.2 不同菌株解无机磷能力的测定

由图2 可知，不同菌株接种到无机磷培养基后，明显改变了培养液 pH 和有效磷含量。有效磷含量以接种菌株 JP01 显著最高，在第 4 d 时达到最大值，为 112.52 mg/L，与其他处理相比，分别增加了 1.33%、 1.35% 和 12.46%。另外两株供试菌株 JP03 和 PG62，有效磷含量虽低于 JP01 处理，但均显著高于未接种处理，表明其具有溶解难溶性磷酸盐 Ca₃（PO₄）₂ 的能力。培养液 pH 变化则表现为供试菌株的加入明显降低了培养液 pH，其中，接种 JP01 后的 pH 最低可降至 1.85。

注：不同小写字母表示在 0.05 水平差异显著。下同。

注：小写字母不同表示在 0.05 水平差异显著。下同。

2.3 不同菌株解有机磷能力测定

加入不同供试菌株后，有机磷培养基中有效磷含量和 pH 的变化见图3。在培养过程中，JP01 处理下有效磷含量均显著最高，培养至第 6 d 达到峰值，为 145.5 mg/L，其他两株菌处理后其有效磷含量均低于未接种处理，且两处理间无差异，由此可见，JP03 和 PG62 两株菌活化有机磷能力很差。培养液 pH 上，菌株 JP01 处理后的 pH 从 4.32（第 2 d）降至 1.60（第 6 d）；JP03 和 PG62 培养液 pH 则平缓上升。总体来看，培养液中有效磷含量越高，其 pH 越低，两者可能存在一定相关性，但具体机制有待进一步试验验证。

2.4 不同菌株解磷矿粉能力测定

从图4 可以看出，在液体磷矿粉培养基摇床培养时，3 株供试菌株随着培养时间的延长，pH 存在不同程度的先下降后上升的变化，有效磷含量呈现先上升后下降并趋于稳定的趋势。其中，JP01 和 JP03 的 pH 在培养第 4 d 时达到最低值，PG62 培养液的 pH 则维持平稳变化。与其他两株菌相比， JP01 的有效磷含量最高，在第 4 d 达到峰值（95.74 mg/L），随后趋于平稳。JP03 培养液中有效磷含量在第 4 d 后出现小幅度提高，第 6 d 时有效磷含量与 JP01 基本持平；而 PG62 则在第 2 d 后开始出现增长，在第 4 和 6 d 维持平稳水平，但有效磷含量始终低于其他两株解磷菌。

解磷菌对难溶性磷酸盐的溶解能力与菌种种类、磷酸盐类型密切相关。综上所述，JP01 菌株对于无机磷、有机磷和磷矿粉的溶解能力都是最优的，而且该菌株在溶解磷酸盐时培养液的 pH 均最低，但具体作用机理还有待进一步研究验证。

2.5 菌株的鉴定

2.5.1 形态学特征

黑曲霉 JP01 形态特征如图5 所示，JP01 在 PDA 平板上，28℃培养 3 d，直径为 2.5～3.5 cm。菌丝初白色，密实；老龄中心产孢区为棕黑色，绒状质地，背面无色。显微形态下，菌丝有隔，分生孢子串生，壁厚光滑。

苍白杆菌 PG62 形态特征如图6 所示，PG62 在 LB 平板上，37℃培养 1 d。菌落白色，光滑，湿润，边缘整齐。显微形态下，细胞杆状，革兰氏染色阴性。

杰氏假单胞菌 JP03 形态特征如图7 所示， JP03 在 LB 平板上，37℃培养 24 h。菌落米色，菌落圆形，隆起，光滑湿润，边缘不规则。显微形态下，细胞杆状，革兰氏染色阴性。

2.5.2 分子生物学鉴定

以菌体的基因组 DNA 为模板，用引物扩增 ITS 序列，PCR 产物经检测、纯化后直接测序，所得序列与 GenBank 数据库中的序列进行 BLAST 比较，应用 MEGA 7.0 构建系统发育树（图8）。经测序结果及进化树图谱综合分析，结果表明，菌株 JP01 的 ITS1/ITS4 序列与黑曲霉（Aspergillus niger） 的序列同源性最高，为 100%，结合形态特征鉴定结果，将解磷菌 JP01 鉴定为黑曲霉；PG62 的 16S rDNA 序列与苍白杆菌（Ochrobactrum haematophilum） 的序列同源性为 96%，结合形态特征鉴定结果，将解磷菌 PG62 鉴定为苍白杆菌； 经比对 16S rDNA 序列，JP03 与杰氏假单胞菌（Pseudomonas jessenii） 同源性为 98%，同时结合形态学鉴定，将 JP03 鉴定为杰氏假单胞菌。

2.6 盆栽试验

选取解磷效果最好的黑曲霉 JP01 进行玉米的促生试验，在常规管理 30 d 后，统计分析结果如表2 所示。接种黑曲霉 JP01 后，玉米幼苗的株高、茎粗、地上干重和地下干重均高于未接种处理（CK），分别增加 8.10%、3.80%、24.74% 和 41.72%，但株高和干重均低于磷活化剂处理。表明接种黑曲霉后，土壤中部分难溶性磷酸盐可以被分解为可供植物吸收利用的磷，对玉米的生长发育具有一定的促进作用。解磷真菌黑曲霉 JP01 对玉米幼苗的影响不仅表现在生物量上，也体现在植株全磷和土壤有效磷含量上。接种黑曲霉 JP01 的玉米植株全磷含量达到最大值，为 119.88 mg，而该处理下的盆栽土壤有效磷含量显著低于其他处理 （P>0.05），为 110.84 mg/kg。

3 讨论

解磷菌是一类将难溶性磷转化为能被植物吸收利用的可溶性磷的有益微生物^[16]。本研究中 3 株解磷菌在无机磷固体培养基上随着培养时间延长，溶磷圈直径也不断变化，最后增幅趋于平缓，这可能与培养基中难溶性磷酸盐含量、菌株代谢活性等有关^[17]。土壤作为植物和微生物生长的重要磷源库，解磷菌种类繁多，主要分为细菌、真菌和放线菌。目前国内外对于解磷细菌的研究较为深入，包括芽孢杆菌属、假单胞菌属、欧文氏菌属等，其中溶解磷酸三钙的巨大芽孢杆菌是较早发现、解磷效果最优、使用推广面积最多的细菌^[2]。解磷真菌较细菌而言，种类和数量都相对较少，但真菌的解磷能力一般要大于细菌^[18]，而且真菌的解磷性能也更稳定，部分细菌在多次传代后会逐渐丧失解磷能力，真菌则在数代后仍能保持一定的解磷能力^[19-20]。真菌的解磷效果一般是细菌的 10 倍，曲霉属和青霉属的解磷效果是目前研究较多的解磷真菌。本研究筛选出的 3 株解磷菌，包括两株细菌和 1 株真菌，分析它们的解磷特征后发现相较两株细菌，真菌黑曲霉 JP01 的解磷能力最优，与已有研究结果^[21-22]相似，解磷真菌黑曲霉 JP01 对不同类型磷酸盐的溶解能力存在差异，具体表现为卵磷脂 >Ca₃（PO₄）₂>磷矿粉。解磷真菌黑曲霉 JP01 对卵磷脂的最大溶解能力为 145.5 mg/L，溶解卵磷脂主要是通过各种磷酸酶来实现，说明黑曲霉 JP01 在代谢过程中可能会通过分泌植酸酶或磷酸酶来将有机磷酸盐转化为可被植物直接吸收利用的可溶性磷酸盐^[23-24]。

本研究还发现，供试解磷真菌黑曲霉 JP01 在液体培养过程中，最高有效磷含量通常伴随着其培养液 pH 显著下降，这与马文文等^[25]在东祁连山高寒地区筛选出的解磷菌液体培养基 pH 变化情况一致，说明培养液酸化可能是溶解难溶性磷酸盐的关键机制之一^[26]。有研究认为解磷菌溶解出的有效磷含量与 pH 呈负相关，但也有研究指出，微生物代谢时也会使培养介质的 pH 下降，所以微生物的溶磷量与 pH 之间并不存在显著的相关性^[18，27]。因此，对于本研究中存在的 pH 显著下降与有效磷含量变化的具体作用机制还有待进一步试验验证。

有研究表明，解磷菌具有提高土壤养分，促进作物生长的能力^[28-29]。本试验盆栽结果显示，从桃树根际土壤中筛选出的最优解磷菌黑曲霉 JP01 可提高玉米的株高、茎粗和地下部干重，此外，菌株发酵液提高了玉米植株全磷量，降低了土壤速效磷含量，表明接种黑曲霉使得植物生长和土壤速效磷发生变化，可能是由于解磷菌代谢产生的磷酸酶和各种酸类物质溶解了土壤中的难溶性磷酸盐^[30]，增加了很多可被植物吸收利用的磷酸盐，缓解了土壤中磷素的限制，从而促进植物的生长。

4 结论

本研究从桃树根际土壤中筛选出 3 株解磷菌，其中黑曲霉 JP01 解磷能力最优，在溶磷过程中，其培养介质 pH 显著下降；接种黑曲霉在一定程度上可以促进植株生物量累积，将土壤中难溶性磷酸盐转化为可被植物吸收利用的磷酸盐，在植物促生和微生物菌肥开发利用方面具有良好的潜力。

参考文献