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磷是植物生长发育所需的重要元素之一，它的缺乏会明显限制作物的生长和产量。相较于额外添加无机磷肥，土壤中有机磷的充分利用具有更重要的实际意义[1]。在土壤中，有机磷通常占总磷的 40%～95%，植酸占有机磷的 50%～80%[2]。作为土壤中最丰富的有机磷，植酸可作为植物潜在的磷素营养来源[3]。植酸必须通过植酸酶将其逐步水解生成低级肌醇磷酸衍生物和无机磷酸后，才能被植物吸收利用[4]。
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植酸酶在土壤磷循环中发挥着重要作用[5]。同时，其稳定性和活力会受土壤蛋白酶作用、微生物降解、土壤颗粒吸附以及底物可用性等许多因素的影响[6]。Kedi 等[7]研究认为，微生物对植酸酶活性的影响是微弱的，对土壤样品进行高压灭菌处理可以探究外源性添加的植酸酶受生物分解作用的影响。George 等[8]研究发现，土壤吸附一方面可能使植酸酶降低对植酸盐的亲和力，从而降低酶的活性，另一方面吸附也可能是植酸酶在土壤中长期存在的必要条件。因此，植酸酶在土壤中抗微生物降解，并保持稳定酶活性是可能的。
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β-折叠桶植酸酶被认为是自然界最丰富的植酸酶，在土壤磷循环中起主导作用[9]。β-折叠桶植酸酶属于碱性植酸酶，最佳 pH 值在 6.0 到 8.0 之间，主要来源于芽孢杆菌属[10]。双功能域 β-折叠桶植酸酶（phyHT）属于典型的 β-折叠桶植酸酶，phyHT 具有严格的植酸特异性、抗蛋白分解、 Ca2+ 依赖性和高热稳定性，催化效率明显优于其他植酸酶[11]。这表明，phyHT 在土壤磷循环方面有重要的应用前景。
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本研究将 phyHT 添加到北方褐潮土中，检测酶的稳定性和抗微生物干扰表现，表征土壤理化性质、土壤有效磷含量以及植物生长状况的变化情况。旨在为外源性添加 phyHT 能够增加土壤有效磷含量，提高土壤磷素有效性提供理论依据。
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1 材料与方法
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1.1 试验材料
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1.1.1 PhyHT 蛋白溶液的获取
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本研究将实验室保存的重组质粒 pET-28b （+）-phyHT[12]，转化到大肠杆菌 BL21（DE3）宿主细胞，进行大量表达。用高伟等[13]专利中所示的透析方法对包涵体形式蛋白进行复性，获得单体 phyHT 蛋白溶液，酶活性为 62.11 U·mg-1。酶学特性：最适温度 37℃，0 到 45℃内有很强的热稳定性；最适 pH 8.0，中性和碱性环境下保持稳定[11]。
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1.1.2 土壤及植物样本
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供试土壤类型为北方褐潮土，采自北京市海淀区北京林业大学校内（40°0′5″N，116°20′28″E，海拔 50 m），采样深度为 0～20 cm，将其风干、除杂、过筛，并在室温下储存。基本理化性质为 pH 8.78、有机质 38.78 g·kg-1、铵态氮 78.59 mg·kg-1、有效磷 17.98 mg·kg-1、速效钾 122.49 mg·kg-1。
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试验使用的小麦（Triticum aestivum L.）品种是绿优 1 号，从当地农贸市场获得。
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1.2 土壤对 phyHT 活性的影响
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1.2.1 土壤微生物以及反应时间对 phyHT 活性的影响
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0.5 g的灭菌与非灭菌土壤样品中分别加入 5 mL 0.4 U·g-1 的 phyHT 蛋白溶液，于摇床上培养 1～24 h 后分别取 100 μL 的悬浊液和上清液，每个处理设置 3 次重复，通过硫酸亚铁-磷钼蓝法，测定 phyHT 的剩余酶活性。试验方法：100 μL 样品按 1∶4 的比例加入底物溶液中，在 37℃下反应 15 min，加入 500 μL 终止液停止反应。随后，加入 500 μL 钼酸铵-硫酸亚铁缓冲液显色，静置，离心，使用分光光度计在 700 nm 处测上清液的吸光度值。
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1.2.2 土壤温度及 pH 对 phyHT 活性的影响
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在 20～45℃下，将 0.5 g 的灭菌土壤中分别加入 5 mL 0.4 U·g-1 的 phyHT 蛋白（pH 8.0） 溶液，振荡 30 min 后取样，按 1.2.1 所示方法，分别测定土壤悬浮液和上清液中剩余的 phyHT 活性，获得酶活性-温度曲线。
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在最适温度（37℃）下，改变 phyHT-土壤反应体系的 pH 值为 5.0～9.0，获得酶活性-pH 曲线。
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此试验部分共设置 11个处理，每个处理 3次重复。
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1.3 PhyHT 对土壤有效磷含量及理化性质的影响
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5 g 的土壤样品与 50 mL phyHT 溶液（0～100 U·g-1） 置于 100 mL 锥形瓶中，共设置 0.0、 0.4、1.6、5.0、8.0、10.0、20.0 U·g-1 7 个处理，每个处理 3 次重复，恒温（37℃）振荡 12 h 后 45℃烘干，过 2 mm 筛备用。采用 0.5 mol·L-1 NaHCO3 溶液浸提样品，钼锑抗比色法[14]测定土壤有效磷含量。
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50 g 土壤与 phyHT 蛋白溶液（250 U·g-1）充分混合，对照则不加蛋白，两个处理均设置 3 个重复。置于常温（20℃）下，保持土壤田间持水量的 60%，培养 7 d 后收集、晾干，过 2 mm 筛，用于土壤理化性质分析。样品有机质含量采用重铬酸钾容量法—外加热法测定、铵态氮含量的测定采用 MgO-Devarda 合金蒸馏法、速效钾含量采用 NH4OAc 浸提，火焰光度法测定、CaCO3 含量采用气量法测定。以上具体实验操作步骤参照《土壤农化分析》[14]。采用郝红英等[15]方法通过分光光度计测定土壤中植酸含量。
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1.4 PhyHT 对小麦生长的影响
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用 1% 的次氯酸钠溶液对小麦种子表面消毒 30 s，然后用蒸馏水清洗 3 次。每盆 500 g 土壤，播种 50 粒小麦种子，播种深度为 2 cm。试验共设置 5 个处理：分别为对照 CK（仅浇水）、A（植酸钠 6.6 mg）、B（phyHT250 U·g-1）、C（ 植酸钠 6.6 mg+phyHT250 U·g-1）、D（KH2PO4 5.98 mg），每个处理 3 个重复。小麦生长室设置参数：昼、夜温度分别为 25、21℃，相对湿度 60%，光周期为 16 h。定期给幼苗浇水，于 20 d 后采集幼苗，用蒸馏水洗净，测定小麦根和芽的长度。将样品于 60℃ 烘干至恒重，分别测定小麦根和芽的干重。根据标准 NY/T2017—2011[16]中所述方法，测定幼苗根和芽组织中的磷含量。
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1.5 数据处理和统计分析
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数据用 Excel 2010 进行平均数及标准误差的计算、使用 origin 8.6 绘图。采用 SPSS 26.0 作单因素分析（α=0.05）。
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2 结果与分析
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2.1 添加时间和土壤微生物对 phyHT 活性的影响
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土壤微生物对 phyHT 活性造成的影响见图1。灭菌与未灭菌样品均未观察到悬浮液、上清液中 phyHT 的剩余酶活性存在明显的差异，这意味着 phyHT 的稳定性并不受土壤微生物的影响，这与 Kedi 等[7]报告的结论一致。
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如图1 所示，在湿润土壤中，phyHT 的相对酶活性随着时间的推移出现了明显下降。PhyHT 添加量为 0.4 U·g-1 时，上清液-phyHT 活性在 12 h 内迅速下降到 10% 以下后便趋于缓慢（图1b）。相较于上清液中 phyHT 的活性，土壤悬浊液-phyHT 活性下降趋势平缓，在 12 h 后保有 19.28% 的酶活性，且在 24 h 时仍保有 7.33% 的酶活性（图1a）。这表明，外源性添加的 phyHT 能够在土壤中维持一定的活性，行使催化功能。
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图1 phyHT 在土壤中的时间稳定性和抗微生物降解表现
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注：phyHT 为 β-折叠桶植酸酶。下同。
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2.2 土壤温度和 pH 对 phyHT 活性的影响
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酶活性-温度曲线见图2a，上清液、悬浮液中 phyHT 的剩余相对酶活性均随温度升高呈下降趋势。 PhyHT 在 20～40℃下能保持高的酶活性，环境温度高于 40℃，酶活性损失明显增加。因此，当土壤环境温度在 20～40℃时，添加 phyHT 可发挥其催化作用。
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由酶活性-pH 曲线（ 图2b） 可知，随着土壤 pH 值的升高，上清液、悬浮液中 phyHT 的相对酶活性变化呈现出一致的规律。即土壤 pH 为 6.0～9.0 时，phyHT 保持着较高酶活性，当试验体系 pH 为 8.0，与土壤自然 pH 相近时，phyHT 的剩余酶活性最高。这与 phyHT 属于碱性植酸酶，中、碱性环境下酶活性更优的特性相吻合。这表明， phyHT 在中、碱性土壤中均能保持高的酶活性。
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图2 土壤中 phyHT 的酶活性-温度（a）、酶活性-pH（b）曲线
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2.3 PhyHT 增加土壤中有效磷含量的效果
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如图3 所示，随着 phyHT 添加量的增加，土壤有效磷含量呈上升趋势。与对照相比，当 phyHT 添加量达到土壤含 1.6 U·g-1 蛋白时土壤有效磷含量显著高于对照（P<0.05），增加了 25.89%；当 phyHT 添加量达到 5.0 U·g-1 时，土壤有效磷增幅最大，达到 43.09%。之后，有效磷含量不再随着 phyHT 添加量的增加而显著增加。由此表明，外源性添加 phyHT 蛋白可提高土壤有效磷含量，其增长幅度与 phyHT 的添加量有关。
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图3 phyHT 添加量对土壤中有效磷含量的影响
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注：**、* 分别表示 0.01、0.05 水平上的显著差异，ns 表示无统计学意义。
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本研究测定了 phyHT 添加前后土壤化学性质的变化情况。结果如表1 所示，添加 phyHT 后，土壤 pH 由 8.78 下降到 8.16，电导率明显提高，CaCO3 含量减少了 3.55 个百分点，这有利于土壤中一些矿物质元素的水解；土壤植酸含量减少了 17.00%，有效磷含量增加了 22.52%，说明 phyHT 能有效水解土壤植酸，提高土壤磷有效性；土壤有机质含量增加了 10.54%，铵态氮含量增加了 18.38%，速效钾含量增加了 27.49%。由此表明，添加 phyHT 能够在一定程度上改善土壤化学性质，这有利于植物的生长。
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2.4 PhyHT 对小麦生长的影响
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如图4 所示，土壤中添加不同的磷素来源对小麦生长有不同程度的影响。添加 KH2PO4（D 处理）小麦生长情况显著优于 CK（P<0.05），这说明磷素是植物生长的一个主要限制因素。土壤中同时补充 phyHT 和植酸钠（C 处理）能明显促进小麦生长，显著提高小麦幼苗长度和干重（P<0.05）。A 处理小麦芽的长度和干重均显著高于 CK，说明补充的植酸钠底物被土壤中本身存在的植酸酶催化水解，释放有效磷。B 处理小麦芽的生长长度和干重均显著高于 CK（P<0.05）并且还显著高于 A 处理（P<0.05），表明外源性 phyHT 在土壤中保有的酶活性显著高于土壤自身存在的植酸酶，水解植酸盐的效率更高。从总体上看，在土壤中外源性添加 phyHT 能显著促进小麦生长。
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由图5 可知，土壤中添加不同磷素来源的小麦组，其芽、根组织中的全磷含量均显著高于 CK （P<0.05）。小麦组织全磷含量与其生长长度和干重并不成正比，虽然施加 KH2PO4 能有效提高小麦根部组织磷含量（图5），但是小麦生长还受诸如土壤有机质、铵态氮、速效钾等含量的影响。外源性添加 phyHT 能够在土壤中保持活性，在小麦生长过程中水解土壤植酸，使得土壤有效磷含量增加。不仅增强小麦对磷素营养的吸收，还显著提高了土壤中其他重要营养元素的含量。
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图4 phyHT 对小麦芽和根的生长长度（a）以及干重（b）的影响
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注：不同字母表示样本处理间有显著差异（P<0.05）。下同。
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图5 phyHT 对小麦芽和根组织中全磷含量的影响
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3 讨论
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土壤磷素营养的缺乏限制着农业的生产，缺磷的主要原因是土壤中有效磷的不足。土壤中的磷主要以有机态存在，其中植酸是主要形式。植酸酶可特异性水解土壤植酸，释放有效磷。研究表明，施加植酸酶可增加土壤中有效磷含量[17]，这与本研究的结果一致。外源性添加 phyHT 还改善了土壤理化性质，植物生长所需营养元素均有一定程度的提高（表1）。本研究进行的小麦盆栽试验结果表明， phyHT 能促进小麦生长，提高小麦植株中的磷含量。外源性 phyHT 水解土壤植酸、增加土壤有效磷含量的作用效果，主要与以下两因素有关。
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3.1 PhyHT 在土壤中的稳定性
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植酸酶的稳定性与土壤环境相关。研究结果显示，灭菌与未灭菌土壤分别添加 phyHT，其剩余酶活性均未显现明显差异，这可能是土壤的吸附作用使 phyHT 稳定存在。已有关于酶稳定性的研究认为，吸附作用使得植酸酶在加入土壤后被迅速固定，保护植酸酶免受土壤微生物降解[7-8]。在本研究中，试验 24 h 后外源性 phyHT 的剩余酶活性为 7.33 %（图1a），为应对复杂的土壤环境并显著提升 phyHT 的土壤稳定性，酶的固定化[18]将是重要的研究和应用方向。
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3.2 土壤植酸的可用性
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土壤植酸来源有植物合成、动物粪便、无机磷肥转化和污水污泥等[3]。虽然其来源丰富，但是土壤植酸的可利用性较低。本研究结果显示，外源性添加 phyHT 后，土壤植酸含量降低了 17.00%。在土壤中，植酸通过肌醇结构与土壤紧密吸附，与金属离子（Ca2+、Mg2+ 等）的络合作用以及与有机质的结合使其溶解度降低[19]。植酸的低溶解度限制了植酸酶的水解作用[20-21]。因此，提高植酸的溶解度是改善其与酶的亲和能力，提高土壤磷素有效性的关键步骤[18，22]。目前植酸盐溶解机制方面的研究还存在很大的空白，这将是以后研究的一个重要方向。
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4 结论
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外源性添加 phyHT，研究酶在土壤中的稳定性，酶对土壤有效磷含量、理化性质以及小麦生长状况的影响。得出以下结论：
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（1） 当土壤温度为 20～40℃、pH 为 6.0～9.0 时，phyHT 能不受土壤微生物影响，稳定存在 12 h 并高效发挥催化作用。
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（2）土壤添加 5 U·g-1 的 phyHT，12 h 后土壤有效磷含量增幅达到 43.09%。
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（3）添加 phyHT 后，土壤 pH 显著下降，电导率明显提高，CaCO3 含量减少了 3.55 个百分点。土壤有机质、铵态氮、速效钾含量分别增加了 10.54%、18.38% 和 27.49%。土壤植酸含量减少了 17.00%，有效磷含量增加了 22.52%。
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（4）phyHT 促进了小麦生长，幼苗生长长度、干物质积累量以及芽、根部组织全磷含量均显著增加。
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综上所述，本研究证明了外源性添加 phyHT 能有效水解土壤植酸，增加土壤有效磷含量，提高土壤磷素有效性，在一定程度上改善土壤化学性质并促进植物生长。
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摘要
农业生产中过度使用无机磷肥引发了土壤板结等一系列问题，因此有必要寻找一种替代的可持续的磷肥来源。土壤有机磷主要以植酸的形式存在，植物不能直接吸收和利用。植酸水解释放植酸磷可提供一个生态友好型的解决方案。通过向土壤中添加来自 Bacillus sp.HJB17 的双功能域 β- 折叠桶植酸酶（phyHT），研究其在土壤中的稳定性，探究 phyHT 提高土壤有效磷含量、改善土壤理化性质以及促进植物生长的作用效果。结果显示，在湿润土壤中，土壤微生物对 phyHT 影响很小，phyHT 可在较宽的温度（20 ～ 40℃）和 pH 值（6.0 ～ 9.0）范围内稳定存在 12 h 并发挥高效催化功能。外源性添加 phyHT 后：（1）土壤植酸含量减少了 17.00%，有效磷含量增加了 22.52%；（2）土壤 pH 下降，电导率上升，CaCO3 含量降低了 3.55 个百分点，土壤有机质、铵态氮和速效钾含量分别增加了 10.54%、18.38% 和 27.49%；（3）小麦幼苗生长长度、干物质积累量以及芽、根部组织全磷含量均显著增加。因此，外源性添加 phyHT 能够促进土壤植酸水解，增加土壤有效磷含量，提高土壤磷素有效性，同时，在一定程度上改善土壤理化性质，促进植物生长。
Abstract
Excessive use of inorganic phosphate fertilizers in agricultural production has triggered a number of problems such as soil slumping，and searching for alternatively sustainable phosphate fertility sources is necessary. Organic phosphate in soil exists mainly in form of phytate which plants cannot directly absorb and utilize. Releasing the phytate phosphorus using microbial phytase can provide an eco-friendly solution for sustainable phosphate fertility in agriculture. The method of present work was to add dual-domain β-propeller alkaline phytase（phyHT）from Bacillus sp. HJB17 to investigate its soil stability and test its effect on increasing the effective phosphorus content of soil，improving soil physical and chemical properties and promoting plant growth. The results showed that the soil microorganisms had little effect on phyHT，which was stable over a wide range of temperature（20-40℃） and pH（6.0-9.0）for 12 hours and functions as an efficient catalyst in moist soils. After exogenous addition of phyHT：（1）Soil phytate content was decreased by 17.00% and effective phosphorus content was increased by 22.52%；（2）Soil pH was decreased，the conductivity of soil was increased，CaCO3 content was decreased by 3.55 percentage point，and soil organic matter，ammonium nitrogen and available potassium content were increased by 10.54%， 18.38% and 27.49%，respectively；（3）Wheat seedling growth length，dry matter accumulation，and total phosphorus content of shoot and root tissues were significantly increased. Therefore，exogenous addition of phyHT can promote soil phytate hydrolysis，increase soil effective phosphorus content and improve soil phosphorus effectiveness，at the same time， it can improve the physical and chemical properties of the soil to a certain extent and promote plant growth.