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化肥农药为保障我国粮食安全和重要农产品有效供给发挥了重要作用，但过量施用产生的环境问题也越来越突出，成为全球广泛关注的热点之一。减轻化肥农药环境污染最直接有效的途径之一就是减少农田投入量，发展新型替代产品和绿色防控技术。寡糖现在作为一种生物刺激素，能够促进作物生长发育[1-2]，提升品质[3]，还可以增强作物的抗逆能力[4]，且具有相对安全、环保，资源丰富，制备简单等特点[3]。寡糖作为一种新型生理活性物质，未来具有广阔的应用前景。
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已有研究表明，寡糖可以通过诱导植物产生抗病相关的信号分子，从而促进抗病相关酶大量合成，增强植物抗病性[5-9]。纤维寡糖可以作为生物农药，通过有效诱导植保素的合成与积累，对植物的生长发育、外界环境胁迫等方面有着重要作用[10-11]。不同寡糖聚合度、作用部位及在植物体内的传导均存在一定差异，Hien 等[12]发现三糖、四糖、五糖及六糖促根生长活性非常显著。壳寡糖是一种天然产物壳聚糖降解后形成的低聚糖，近年来，很多关于壳聚糖在作物种植中的生物活性报道[13]。吴莉等[14]发现，在低温胁迫前“赤霞珠”葡萄叶片上喷施壳寡糖，可以使低温胁迫后叶片中可溶性糖和脯氨酸的含量提高，从而降低细胞的渗透势和冰点，增强叶片耐受低温的能力。王嘉欣等[15]研究表明，壳寡糖在作物中具有多种生理功能，包括提高叶绿素、脯氨酸含量，增强根系活力，降低丙二醛含量等。目前，关于寡糖与作物相互作用关系的研究，主要集中在植物接收寡糖信号后产生的生理反应以及各种寡糖制剂的种类、配比以及施用浓度等，关于寡糖施用所带来的其他变化研究相对较少。黄瓜是我国种植广泛的设施蔬菜之一，在丰富城乡居民“菜篮子”、增加菜农种植效益方面发挥着重要作用。
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本试验通过研究一种对黄瓜生长有促进作用的复合寡糖制剂[16]，探索复合寡糖的施用对于黄瓜叶片中叶绿素含量、植株内抗氧化酶活性产生的影响，探究复合寡糖在黄瓜生长体系中叶片、根系和根围土等各部位的微生物组成，以及复合寡糖的施用对于各部位营养元素的含量带来的影响，为未来新型高效复合寡糖制剂的使用提供研究基础。
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1 材料与方法
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1.1 试验设计
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试验在天津市宝坻区新庄（39°63′N，117° 16′E）的温室大棚进行。黄瓜选用当地主栽品种 ‘津绿 4 号’。于 2021 年 5 月 22 日移栽种植，试验设置 3 个处理，分别为清水对照（CK）、化学常规（PY）和复合寡糖（KP）。其中，PY 处理按大棚日常种植操作进行，在种植后 1 个月喷施烯酰吗啉（0.525 kg·hm-2 兑水 30 kg，山东先达化工公司）和普力克杀菌剂（1.35 kg·hm-2 兑水 45 kg，德国拜尔），10 d 后再次喷施 36% 春雷喹啉铜悬浮剂（1200 mL·hm-2 兑水 45 kg，放大镜铜喜）。KP 处理选用与日本合作研发的复合寡糖制剂果乐百颗（KROPICO，昭和电工株式会社，日本），其主要有效成分为 3 种寡糖，用水溶液稀释 1000 倍后使用。同期喷施自来水，所有制剂用量均为 1100 kg·hm-2。黄瓜苗于 5 月 22 日移栽，移栽前 1 d，黄瓜苗使用复合寡糖 1000 倍液浸根 24 h。定植后每间隔 7 d 使用复合寡糖 1000 倍液进行 1 次叶面喷施，喷施时间为上午 9：00，共进行 8 次，以滴水为度，处理前后 24 h 不浇水。3 个处理各设置 2 垄，30 棵 / 垄，株距为 10 cm，垄距为 45 cm，3 个处理 6 垄形成 1 个区域，共设置 3 个重复区域。重复区域之间设置隔离带，大棚面积约 467 m2。其他农事操作按照基地常规大棚管理要求进行。在黄瓜生长期内进行 3 次样品采集，分别在黄瓜种植后的盛花期（2021 年 6 月中旬）、盛果期（2021 年 7 月中旬）和拉秧期（2021 年 8 月中旬），采集植株的叶片、根系和距离根系周围 20 cm 的根围土样本。每次采样时，从各处理中随机选取 10 株长势基本一致的植株记为 1 个样本，每个处理设置 3 个重复。其中新鲜叶片用于进行现场叶绿素含量的测定，其余叶片、根系和根围土样品用液氮冷冻带回实验室，置于-80℃冰箱保存，用于后续黄瓜叶片中抗氧化酶活性和叶片、根系、根围土中微生物多样性等的检测与分析。在整个采样期间，共涉及 27 个样本，各样本处理及编号信息如表1 所示。
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1.2 产量取样
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CK、PY 和 KP 3 个处理区，黄瓜产量统计主要在生长期内的结瓜期进行，自黄瓜结瓜采摘开始至拉秧期止，50 d 左右，分成结瓜初期（6 月 25 日至 7 月 10 日）、结瓜盛期（7 月 11—31 日）和结瓜后期（8 月 1—15 日）3 个阶段，结瓜期内每个采摘日计算各处理区采摘黄瓜的重量，根据各处理区黄瓜实际植株数量，计算结瓜期内 3 个阶段各处理区黄瓜单株平均产量和结瓜期单株总产量，单株产量以 kg/ 株表示。
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1.3 叶绿素相对含量（SPAD）测定
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采用叶绿素活体测定仪 SPAD-502（柯尼卡美能达，日本），分别于盛花期、盛果期和拉秧期上午测定。测定时清理仪器接收窗并校准后，避开叶脉进行现场测定。
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1.4 酶活性测定
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超氧化物歧化酶活性、过氧化氢酶活性和过氧化氢酶活性测定使用生化试剂盒（购自苏州格锐思生物科技有限公司，货号分别为 G0101W、 G0105W、G0107W），具体试验操作方法按照试剂盒说明步骤进行。
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1.5 样本核酸提取和高通量测序
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使用 FastDNA® Spin Kit（美国 MP Biomedicals 公司）试剂盒提取样本中所有微生物基因组总 DNA，使用 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测微生物总 DNA 的质量，使用 NanoDrop 2000（ 美国 Thermo Scientific 公司）测定 DNA 纯度和浓度。
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以上述提取的微生物基因组总 DNA 为模板，各部位样本均使用携带 Barcode 序列的上游引物 338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′和下游引物 806R：5 ′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3 ′ 对 16S rRNA 基因 V3～V4 可变区进行 PCR 扩增。 PCR 产物用 AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）进行回收产物纯化后，用 Illumina 公司的 Miseq PE300 平台进行测序（上海美吉生物医药科技有限公司）。原始数据上传至国家生物信息中心－国家基因组科学数据中心的组学原始数据归档库（Genome Sequence Archive，GSA）[17-18]（GSA：CRA008956）。
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1.6 生物信息学分析
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使用 VSEARCH[19]（https：//github.com/torognes/ vsearch，Version 2.22.1）对双端原始测序序列进行序列合并、切除引物与质控，随后去除冗余序列。使用 USEARCH[20]（http：//www.drive5.com/usearch， Version 11.0.667）根据 97% 的相似度对质控拼接后的序列进行操作分类单元 OTU 聚类并剔除嵌合体。使用 USEARCH 计算 alpha 多样性指数和 beta 多样性指数，同时比对 Silva16S rRNA 基因数据库 （v138）进行 OTU 物种分类学注释，置信度阈值为 70%，并在不同物种分类水平下统计每个样本的群落组成。
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1.7 数据统计分析
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采用 Excel 365 对数据进行处理及数据可视化， SPSS 23.0 进行显著性分析。
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2 结果与分析
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2.1 复合寡糖施用改变黄瓜叶片叶绿素相对含量
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表2 显示，叶片 SPAD 随生育期推进表现为“缓慢下降”的趋势，同时复合寡糖处理（KP） SPAD 对比其他处理在盛花期到盛果期阶段下降较为缓慢。在关键生育期，复合寡糖处理（KP）对比其他处理能够显著提升 SPAD 6.14%～11.46%。盛果期复合寡糖处理（KP）对比清水对照（CK）增加幅度最大，增幅为 11.46%；化学常规处理（PY） 从盛花期后，SPAD 与清水对照（CK）无显著差异，表明两种处理的效果相似；盛花期、盛果期、拉秧期复合寡糖处理（KP）对比清水对照（CK） 分别显著提升 SPAD 6.24%、11.46%、6.14%。以上结果说明，复合寡糖处理（KP）能够显著提高叶片的 SPAD，其效果显著高于化学常规处理（PY），进而改善黄瓜盛花期后生长状况。
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注：同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。下同。
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2.2 复合寡糖施用引起黄瓜产量变化
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表3 统计了在黄瓜植株结瓜后，结瓜前期、盛期和后期 3 个时期内，3 个处理黄瓜单株平均产量以及生育期内单株总产量。可以看出，在结瓜期间，复合寡糖处理（KP）相较于清水对照（CK） 和化学常规处理（PY），其单株产量最高。且复合寡糖处理（KP）与清水对照（CK）相比，在结瓜前期、盛期和后期，其单株产量分别提升了 3.64%、7.37% 和 3.25%。由此可见，复合寡糖处理 （KP）施用寡糖后，黄瓜在结瓜前期就表现出了良好的生长势头，产量高于清水对照（CK），在结瓜盛期产量增长尤其明显，到后期，植株生长仍能保持优势，延缓衰老，保持增产优势。
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2.3 复合寡糖施用使得相关抗氧化酶活性改变
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2.3.1 超氧化物歧化酶活性的变化
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盛花期、盛果期和拉秧期 3 次取样结果表明 （表4），复合寡糖处理（KP）能够显著提高黄瓜叶片中超氧化物歧化酶活性 39.9%～81.5%。而在盛果期，化学常规处理（PY）和清水对照（CK）黄瓜叶片的超氧化物歧化酶活性无显著差异，表明两种处理表现出的效果相似，其原因可能是在生育中期，化学常规处理（PY）喷施的药剂可能会导致黄瓜叶片中超氧化物歧化酶活性下降，可能是由于生物体合成超氧化物歧化酶的能力有限，当不足以将杀菌剂刺激产生的超氧阴离子清除时就会导致超氧化物歧化酶活性下降[21]。综上所述，复合寡糖处理（KP）能够显著增加黄瓜叶片的超氧化物歧化酶活性。
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注：3 个处理区面积分别为 78 m2。CK、PY 和 KP 处理区黄瓜植株总株数在结瓜前期分别为 231、231 和 228 棵，结果后期分别为 220、220 和 214 棵。
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2.3.2 过氧化氢酶活性的变化
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由表5 可知，复合寡糖处理（KP）能够显著提升黄瓜叶片过氧化氢酶活性 8.4%～40.4%。说明复合寡糖处理（KP）能够在黄瓜主要生育期显著增加叶片中过氧化氢酶活性。
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2.3.3 过氧化物酶活性的变化
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由表6 可知，盛花期，复合寡糖处理（KP）黄瓜叶片的过氧化物酶活性与化学常规处理（PY）无明显差异，但与清水对照（CK）相比能显著提升过氧化物酶活性 1.19%～18.5%。盛果期，复合寡糖处理（KP）的叶片过氧化物酶活性与清水对照（CK）处理无显著差异，但对比化学常规处理 （PY）能显著提升活性 9.9%～11.9%。拉秧期，复合寡糖处理（KP）对比其他处理均能显著提升叶片过氧化物酶活性 7.3%～18.5%。以上结果表明，复合寡糖处理（KP）能够显著提高黄瓜生育后期叶片过氧化物酶活性。
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综上所述，超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶 3 种抗氧化酶活性随着生育期的推进整体呈逐步升高的趋势，抗氧化酶作为植物的一种保护酶，在植物的正常生长以及抗病抗逆性上都有重要的意义。本试验中，3 种抗氧化酶活性在复合寡糖处理（KP）下比清水对照（CK）均有显著提升，由此推测复合寡糖制剂处理（KP）能够维持护膜的稳定性，进而显著提升植物的抗逆性和抗病性。
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2.4 复合寡糖施用影响微生物多样性及群落组成
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2.4.1 微生物多样性的变化
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从叶片上微生物群落 Chao 1 指数（图1A）和 Shannon 指数（图1D）可知，盛花期复合寡糖处理 （KP）和化学常规处理（PY）的 alpha 多样性指数与清水对照（CK）间均存在显著差异，并且复合寡糖处理（KP）和化学常规处理（PY）叶片的微生物多样性要明显低于清水对照（CK），说明复合寡糖处理（KP）和化学常规处理（PY）在黄瓜种植的盛花期均在一定程度上降低了叶片的微生物多样性。在根系微生物 Chao 1 指数（图1B）和 Shannon 指数 （图1E）的分析结果中，各处理间也存在差异，但相对于叶片的分析结果来说差异已经不显著，并且各处理中的微生物丰度要高于叶片的微生物。根围土（图1C 和 F）中微生物的多样性在不同样品处理间均不存在显著差异，且各个根围土样本中的微生物丰度要远远高于根系和叶片。
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2.4.2 微生物群落组成的变化
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在叶片微生物群落中（图2A），优势属主要是鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas sp.）、甲基杆菌属 （Methylobacterium sp.）、假单胞菌属（Pseudomonas sp.）、根瘤菌属（Rhizobium sp.）、细杆菌属 （Microbacterium sp.）、芽孢杆菌属（Bacillus sp.） 和泛菌属（Pantoea sp.）。从图2A 可知，3 个处理中甲基杆菌属（Methylobacterium sp.）都是在盛果期采样时间点（CKLB、KPLB 和 PYLB）中的丰度有了增加，其中复合寡糖处理（KP）的增加幅度最大，并且在盛花期采样时间点（CKLA、KPLA 和 PYLA）对比中，复合寡糖处理（KP）中甲基杆菌属的丰度是 3 个处理组中最高的。在植株根系微生物群落组成中（图2B），丰度比较高的优势属是芽孢杆菌属、白色列契瓦尼尔菌属（Lechevalieria sp.）、假单胞菌属、根瘤菌属（Rhizobium sp.）、德沃斯菌属（Devosia sp.）、新鞘氨醇杆菌属 （Novoshpingobium sp.） 和链霉菌属（Streptomyces sp.）。与清水对照（CK）和化学常规处理（PY）相比，复合寡糖处理（KP）中白色列契瓦尼尔菌属的丰度明显增多，并且一直保持在比较稳定的水平。根围土微生物群落组成中（图2C），丰度最高的是芽孢杆菌属。值得引起注意的是，在清水对照（CK）中，随着黄瓜生长期的延长，芽孢杆菌属的丰度逐渐降低，而在复合寡糖处理（KP）和化学常规处理（PY）中，芽孢杆菌属的丰度也随时间延长相对降低，但幅度不大，基本维持在稳定水平。
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图1 叶片、根系和根围土壤各样本处理间的微生物多样性
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注：A、B 和 C 分别为叶片、根系和根围土样本的 Chao 1 指数；D、E 和 F 分别为叶片、根系和根围土样本的 Shannon 指数。
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图2 叶片、根系和根围土壤各样本组物种组成
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注：A、B 和 C 分别为叶片、根系和根围土样本属水平物种组成结果。
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3 讨论
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3.1 复合寡糖促进黄瓜生长
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在作物生长的过程中伴随着多种生理生化的响应，包括叶片叶绿素含量变化，光合性能和酶类物质活性改变等。
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叶绿素在作物生长发育过程是反映其光合能力的重要指标之一，直接参与作物光合作用中光能的吸收、传递和转化[22]。此试验中复合寡糖处理 （KP）比清水对照（CK）能够显著提升黄瓜关键生育期中的 SPAD，并且延缓黄瓜叶片随着生育期推进 SPAD 的降低，表明复合寡糖能够帮助叶片增强光能吸收，提高适应胁迫环境的能力，使光合作用正常进行。
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3.2 复合寡糖增强作物体内抗氧化酶活性
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抗氧化酶属于保护酶系统，为植物内源自由基清除剂[23]，有清除活性氧自由基使之保持较低水平的能力，同时维持细胞膜的稳定性和完整性[24]。随着作物生育期的推进，体内活性氧清除系统不足以抵消生成的活性氧会引起细胞膜氧化损伤[25]。本试验中复合寡糖处理（KP）能够显著提升盛花期、盛果期和拉秧期黄瓜叶片的抗氧化酶活性，说明在关键生育期复合寡糖提升抗氧化酶活性，及时清除了体内存在的活性氧，可以防止细胞膜过氧化作用，使氧自由基的产生和清除处于平衡，保护细胞膜免受伤害，进而提高植株的抗逆性，这与已有的研究成果相吻合[26]，但对于复合寡糖在作物生育期后期对抗氧化酶的具体作用有待进一步研究。总之，随着黄瓜生育期的推进，复合寡糖显著提升抗氧化酶活性的效果明显。
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3.3 复合寡糖影响黄瓜生长体系各部位的细菌群落组成
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与清水对照（CK）和化学常规处理（PY）相比，复合寡糖处理（KP）在盛花期采样获得的样本（KPLA）中，鞘氨醇单胞菌属的丰度有明显地提高。已经有研究表明，鞘氨醇单胞菌属可以分泌多种植物激素，从而对植物的生长有促进作用，并且可以促进植物在压力环境中的生长[27-29]。除此以外，叶片微生物组成在各个部位以及各个采样时间点具有显著差异的就是甲基杆菌属的丰度。近年来，已经有不少报道称甲基杆菌属可以分泌一些对植物生长有促进作用的代谢产物，在植物生长方面有很好的促进作用，并且在协助植物抗病方面有很好的效果[30-31]。复合寡糖处理的根系细菌群落组成中，白色列契瓦尼尔菌属丰度最高，但是目前关于该属的菌株与植物相互作用的研究较少，后面也值得进行白色列契瓦尼尔菌属与植物相互作用关系的深入研究。在复合寡糖处理的根围土细菌组成中，芽孢杆菌属丰度很高，该菌属是很好的生防菌，可以释放很多抗菌活性物质[32]，可以保障植物生长过程中对抗一些植物病原菌的侵袭。
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4 结论
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在黄瓜关键生育期，复合寡糖处理（KP）对比其他处理能显著提升叶片叶绿素含量，同时显著提升叶片抗氧化酶活性，表明在黄瓜生育期合理施用复合寡糖有利于提升黄瓜叶片叶绿素含量和植株体内的抗氧化酶活性，进而有效改善叶片光合作用和抗逆性，提高同化速率，进一步实现增产。
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3种不同处理对于黄瓜叶片、根系以及根围土微生物群落组成产生了不同的影响。复合寡糖处理（KP）和化学常规处理（PY）在施用初期明显有降低叶片微生物多样性的作用，同时在细菌分离水平上发现了在复合寡糖处理（KP）中存在一些对黄瓜生长以及抗病抗逆有益的细菌丰度的增加，表明复合寡糖在促进黄瓜生长方面发挥作用的原因有一方面就是通过改变细菌群落结构来实现的。
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摘要
植物刺激素寡糖具有提高作物抗逆作用、促进作物生长的功效。在黄瓜生长早期及生长期施用复合寡糖制剂，通过分析复合寡糖对植株光合作用特性、产量和黄瓜 3 个生长阶段植株叶片、根系及根围土微生物群落，阐明复合寡糖施用对黄瓜的增产增效作用。采用大棚小区试验，设置清水对照、化学常规和复合寡糖 3 个处理，于盛花期、盛果期和拉秧期分别采集黄瓜叶片、根系和根围土样本，测定各个采样时期黄瓜产量、叶绿素含量和抗氧化酶活性，进行高通量测序检测样本细菌群落结构和组成。复合寡糖的施用与清水对照相比，提高了单株黄瓜产量，使得每公顷的产量增加了 4.96%；显著提高了黄瓜叶片叶绿素的含量，复合寡糖处理对比其他处理能够显著提升叶片叶绿素含量的相对值（SPAD）6.14% ～ 11.46%；同时提高了叶片的超氧化物歧化酶活性 39.9% ～ 81.5%，提高了过氧化氢酶活性 8.4% ～ 40.4%，提高了过氧化物酶活性 1.19% ～ 18.5%。高通量测序分析结果表明，复合寡糖的施用提高了叶片微生物群落中鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas sp.）和甲基杆菌属 （Methylobacterium sp.）的丰度，它们均具有促进植物生长和协助植物抗病的效果。另外，复合寡糖提高了根围土的微生物群落中生防菌芽孢杆菌属（Bacillus sp.）的丰度。黄瓜生长早期及生长期施用复合寡糖，可以提高黄瓜产量和植株抗氧化酶活性，延缓植株衰老，同时提高植株生长体系中有益菌的丰度，可以为进一步深层次揭示复合寡糖的作用机制提供基础数据。
Abstract
Oligosaccharides，a kind of plant stimulating hormone，had the effects of improving crop stress resistance and promoting crop growth．To elucidate the effects of complex oligosaccharides application on increasing yield and efficiency of cucumber plants，the effects of complex oligosaccharides on plant photosynthesis characteristics，yield and the microbial communities in the leaves，roots，and soil around the roots of cucumber at three growth stages were analyzed after complex oligosaccharides preparations applied in the early and growth stages of cucumber．Using a greenhouse plot experiment，three treatment groups were set up：clear water control，chemical conventional treatment and complex oligosaccharide treatment．Cucumber leaves，roots，and soil samples were collected during the flowering，fruiting and seedling stages，respectively．Cucumber yield，chlorophyll content and antioxidant enzyme activity were measured at each sampling period，and high-throughput sequencing was performed to detect the bacterial community structure and composition of the samples．Compared with clear water control，the application of complex oligosaccharides increased the yield of cucumber per plant by 4.96%．The content of chlorophyll in cucumber leaves was significantly increased，and the relative value of chlorophyll content（SPAD）in the complex digosaccharide treatment was significantly increased by 6.14%- 11.46% compared to other treatments．At the same time，the activity of superoxide dismutase in the leaves was increased by 39.9%-81.5%，the activity of catalase was increased by 8.4%-40.4%，and the activity of peroxidase was increased by 1.19%-18.5%．The high-throughput sequencing analysis results showed that the application of complex oligosaccharides increased the abundance of Sphingomonas sp．and Methylobacterium sp．in the leaf microbial community，both of which have the effects of promoting plant growth and assisting plant disease resistance．In addition，complex oligosaccharides increased the abundance of biocontrol bacteria Bacillus sp．in the microbial community of the rhizosphere soil．The application of complex oligosaccharides in the early and growth stages of cucumber could increase cucumber yield and plant antioxidant enzyme activity，delay plant aging，and increase the abundance of beneficial bacteria in the plant growth system． It could provide basic data for further revealing the mechanism of action of complex oligosaccharides.