磷在植物生长代谢过程中发挥着重要作用，是植物生长不可或缺的大量元素之一。耕地土壤中磷含量丰富，但其中 95% 的磷元素均以无效的结合态磷的形式存在^[1-5]。近些年，磷肥的大量施用虽然在一定程度上满足了作物需求，但同时也造成了土壤中难溶态磷素的大量积累，引起了资源浪费和环境污染^[6-7]。在当前我国“减肥增效”的背景下，有效活化固定于土壤中的无效磷，提高土壤磷素有效性，减少磷肥施用量，是农业持续稳产高产的需要，也是节约磷资源、减少环境污染的迫切需求。

溶磷菌或解磷菌是一类通过自身分泌代谢产物溶解无机磷酸盐或是矿化土壤有机磷将植物难以吸收的磷素状态转化为植物易于吸收的有效态磷的微生物^[7]，分为溶磷细菌、溶磷真菌和溶磷放线菌。据统计，溶磷细菌占溶磷菌总量的 1%～50%，占土壤可培养细菌的 40% 左右^[8-9]，主要有芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia）、不动杆菌属 （Acinetobacter）、埃希氏菌属（Escherichia）、肠杆菌属（Enterobacter）、泛菌属（Pantoea）、沙雷氏菌属（Serratia）、红球菌属（Rhodococcus）、根瘤菌属 （Rhizobium）、硫杆菌属（Thiobacillus）等^[10]。溶磷菌与磷素活化及周转循环密切相关。因此，筛选高效的溶磷菌并应用于农业生产，不仅为微生物肥料的研制提供菌种资源，同时对提高磷肥利用率和实现农业绿色发展具有重大意义。

本研究拟利用前期从玉米根际筛选获得的高效溶磷菌 FD11（普瑞斯特氏菌 Priestia sp.）和 CH07（阿氏芽孢杆菌 Bacillus aryabhattai）制成溶磷菌剂对盆栽玉米进行灌根试验。分析溶磷菌剂施用条件下玉米幼苗的生长特性、根际土壤中氮、磷、钾有效养分以及不同形态磷含量的变化，并利用高通量测序技术分析其对玉米根际土壤细菌群落结构和多样性的影响，综合评价溶磷菌 FD11 和 CH07 的促生效应，为深入探究溶磷菌的促生机制和微生物肥料开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌剂：溶磷促生菌 FD11（普瑞斯特氏菌 Priestia sp.）、CH07（ 阿氏芽孢杆菌 Bacillus aryabhattai），由养分循环与耕地保育安徽省重点实验室前期在土壤中筛选获得。EM 菌剂为市售商业化菌剂产品，该菌剂由多个菌种混合而成，主要菌种为乳酸菌、酵母菌、光合菌、枯草芽孢杆菌，活性菌含量为 2×10⁸ CFU/mL。供试菌株 FD11、 CH07 分别活化后，接种于 LB 液体培养基中摇床振荡培养 24 h，4℃、5000 r/min 离心 10 min 后，弃去上清以无菌水重悬菌体、调节 OD600 值为 1.0，即为 CH07 和 FD11 菌剂。各菌剂用自来水稀释 50 倍后浇灌。

供试土壤：试验土壤采集地点位于安徽省农业科学院试验与示范基地（115°35′21″E， 33°15′0″N），经去除砾石及植物枯枝碎屑后备用。原始土壤基本理化性质：pH 7.67，有机质 18.67 g/kg，全磷 0.78 g/kg，全氮 1.39 g/kg，有效磷 18.65 mg/kg，速效钾 151.41 mg/kg。

供试玉米：品种为“中农甜 488”。

1.2 试验设计及样品采集

试验于 2021 年 8 月 17 日至 10 月 26 日在安徽省农业科学院生态科技园进行。盆栽用盆规格为 φ34 cm×23 cm，土壤过 2 mm 筛按每盆 10 kg 土壤（换算成干重）装盆。盆栽试验设 4 个处理：空白对照（CK）、CH07 灌根处理（CH07）、FD11 灌根处理（FD11）、EM 菌剂灌根处理（EM），每种处理设 6 个重复，共计 24 盆。玉米种子表面消毒后，用无菌蒸馏水冲洗 3 次，转入 25℃恒温箱中催芽后，每盆播种 2 粒玉米种子，出苗后保留 2 株生长均匀一致幼苗。菌液采用灌根法，每隔 2 日浇 1 次，每次 20 mL，CK 采用 20 mL 无菌水代替。盆栽日常管理均按照常用方法，保持土壤湿度在 65%～75%，整个生育期未添加任何营养物质。

在玉米生长第 70 d 时收获玉米，进行玉米植株生长指标测定及其根际土壤取样。参照 Courchesne 等方法^[11]进行玉米根际土壤的采集，将玉米植株连根带土挖出，用手轻抖根系，收集抖下来的土壤分成两份，一份土壤样品置于-80℃用于根际土壤总 DNA 提取，另一份土壤样品自然风干后过筛用于土壤理化性质的测定。

1.3 植株生长指标及根际土壤养分含量测定

玉米幼苗取样后经清水洗净，用滤纸吸干表面水分，分成地上和地下部分。地上部分，测定玉米的株高、茎粗。玉米植株 105℃下杀青 30 min，65℃ 烘干至恒重测定地上部干重；地下部分，使用根系扫描仪（REGENT INSTRUMENTS LA2400）扫描根系制作图片，并记录总根长、根系总表面积、根系直径、根体积及根尖数等数据。根际土壤氮、磷、钾有效养分含量的测定方法^[12]：碱解氮测定采用碱解扩散法，有效磷测定采用 NaHCO₃ 浸提-钼锑抗比色法，速效钾测定采用乙酸铵浸提-火焰分光光度法。土壤磷分级测定采用改进的 Hedley 磷素分级方法^[13-15]。

1.4 玉米根际土壤总 DNA 的提取和 PCR 扩增

根际土壤 DNA 经 DNA Isolate Kit 提取并纯化后，对细菌 16S rRNA 基因的 V3-V4 区段基因进行 PCR 扩增及测序分析，细菌 16S rRNA 基因 V3-V4 区段扩增引物为 515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′） 和 806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。并采用 Illumina-MiSeq 平台进行 Paired-end 测序。

1.5 数据分析

选择 97% 相似度 OTU 进行多样性指数计算； 结合 R 语言相关软件绘制细菌群落结构组分图；采用 SPSS 22.0 软件进行数据统计分析，图表中数据为平均值 ± 标准差；微生物群落与环境变量之间的关系研究采用冗余（RDA）分析方法，所有原始数据均进行对数转换，变量的显著性经过 Monte Carlo 检验，软件选用 R 4.0。

2 结果与分析

2.1 施用溶磷菌剂对玉米幼苗生长及根际土壤氮、磷、钾有效养分含量的影响

生长指标测定结果显示（表1），施用微生物菌剂对玉米幼苗均表现出不同程度的促进作用。 FD11、CH07 处理显著地促进了幼苗地上部的生长，相较于 CK，FD11 处理玉米株高、茎粗分别增长了 31.88% 和 36.39%。EM 菌剂促进了玉米植株生长，但效果未达显著水平。施用 FD11、CH07 及 EM 菌剂促进玉米幼苗地上部干重的增加，较 CK 分别增加了 104.00%、99.2% 和 20.80%，以 FD11 菌剂处理增加的幅度最大。

注：表中数据为平均数 ± 标准差；同列数值后不同字母表示处理间差异达到 5% 显著水平。下同。

经不同菌剂灌根后，玉米根际土壤的碱解氮、有效磷及速效钾含量均有不同程度的提高（表1）。其中，菌剂 FD11、CH07 和 EM 处理的有效磷含量均有所增加，相比 CK 分别提高 107.67%、57.64% 和 7.18%； 速效钾分别提高 5.77%、11.67% 和 2.53%，碱解氮分别提高 21.90%、20.91% 和 0.66%。据此推断，本次试验中菌剂施入土壤促进了土壤磷素的矿化及钾素释放，加速了氮素循环，提高了土壤速效养分的含量。

2.2 施用菌剂对玉米幼苗根系的影响

作物地上部产量增加和品质提高离不开根系对土壤中养分的吸收。经不同菌剂灌根后，玉米幼苗的各项根系指标较 CK 均有不同程度的提高（表2、图1），其中，FD11 处理玉米根系的总根长、总表面积、根体积及根尖数均高于 CH07 与 EM 菌剂。与 CK 相比较，FD11 处理的幼苗总根长、根系总表面积、根系平均直径、根体积及根尖数分别增加了 41.26%、46.85%、31.91%、94.05% 及 44.58%。

2.3 施用菌剂对玉米根际土壤磷组分的转化

H₂O-Pi（Pi 为无机磷）、NaHCO₃-Pi、NaHCO₃-Po （Po 为有机磷）属于易被植物吸收利用的活性磷源。研究表明：溶磷菌 FD11 与 CH07 显著提高了土壤 H₂O-Pi 含量（P<0.05），不同菌剂处理间差异显著，EM 菌剂与 CK 无显著性差异；菌株 FD11 与 CH07 均显著增加了土壤 NaHCO₃-Pi 含量，FD11 处理 NaHCO₃-Pi 含量显著高于其他处理；FD11、CH07 及 EM 菌剂不同程度地提高了 NaHCO₃-Po 含量，其中，FD11 处理 NaHCO₃-Po 的含量最高（155.79 mg/kg），不同菌剂处理间差异不显著（图2）。

NaOH-Pi 和 NaOH-Po 属于中等活性磷源。研究表明：施用微生物菌剂不同程度地提高了土壤中 NaOH-Pi 和 NaOH-Po 含量。FD11 处理 NaOH-Pi 的含量最高（124.44 mg/kg），与 CH07 处理无显著性差异；不同处理 NaOH-Po 的含量由高到低依次为 CH07>FD11>EM>CK（图2）。

HCl-Pi 和 Residual-P 是低活性且不易被植物吸收利用的稳定性磷源。研究表明：施用微生物菌剂降低了土壤 HCl-Pi 含量。不同处理 HCl-Pi 含量从小到大依次为：CH07<EM<FD11<CK，其中 CH07 与其他处理差异显著；FD11 显著降低了土壤 Residual-P 含量， FD11、CH07 处理间差异不显著（图2）。

注：柱上不同小写字母表示不同处理间差异显著（P<0.05）。Pi、Po 分别表示无机磷、有机磷。下同。

2.4 施用溶磷菌剂对玉米根际土壤细菌多样性及群落结构的影响

施用菌剂改变了玉米根际土壤细菌 Shannon 指数、Chao 指数和 Ace 指数，但各处理间差异未达显著水平（表3）。在土壤细菌门分类学水平下，变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门 （Acidobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门 （Actinobacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、芽单胞菌门（Gemmatimonadete s）、绿弯菌门 （Chloroflexi）、Candidate_division_WPS-1、浮霉菌门 （Planctomycetes）、Candidatus_Saccharibacteria、蓝藻门 （Cyanobacteria_Chioroplast）、厚壁菌门（Firmicutes）等 12 个门为玉米根际土壤优势细菌类群（图3），在 FD11、CH07、CK 和 EM 处理中分别累计占各自细菌总数的 93.47%、91.76%、88.45% 和 88.05%。

施用溶磷菌 FD11、CH07 影响了玉米根际土壤细菌的群落结构。在细菌门水平上，变形菌门、拟杆菌门、放线菌门、蓝藻门、厚壁菌门菌群的丰度明显增加，酸杆菌门、疣微菌门、芽单胞菌门、绿弯菌门菌群丰度降低；在细菌目水平上， Sphingomonadales、Actinomycetales、Xanthomonadales、 Candidatus_ Saccharibacteria、Chloroplast、芽孢杆菌目（Bacillales）、蛭弧菌目（Bdellovibrionales）所占比例有所增大。Gp4、Gp6、Gp7、Gemmatimonadales、 Myxococcales、WPS-1、Anaerolineales、Planctomycetales、 Acidimicrobiales 相对丰度则有所降低。其中，与 CK 相比较，FD11、CH07 处理中蛭弧菌目丰度增加幅度分别为 930.18%、140.12%，芽孢杆菌目丰度增加幅度分别为 337.08%、140.54%；在属水平上，FD11、 CH07 处理还出现了一些特有的细菌类群：不动杆菌属（Acinetobacter）、假单胞菌属（Pseudomonas）、海洋杆菌属（Pontibacter）、鞘氨醇单胞菌属 （Sphingobacterium）、节杆菌属（Arthrobacter）。显然，施用溶磷菌剂改变了玉米根际土壤中细菌的群落结构。

2.5 土壤特性、土壤磷组分与土壤细菌群落的相关性

土壤磷组分与细菌多样性 RDA 分析表明 （图4a）：土壤细菌的 Shannon 指数与 NaOH-Pi、 NaOH-Po 显著正相关，与土壤 HCl-Pi、Residual-P 显著负相关；Chao 指数与土壤 HCl-Pi 显著正相关（P<0.05）。土壤磷组分与细菌群落结构的 RDA 分析显示（图4b），不动杆菌属、鞘氨醇单胞菌属 （Sphingobacterium）、Streptophyta、假单胞菌属、海洋杆菌属、节杆菌属相对丰度与土壤有效磷、NaOH-P 和 NaHCO₃-P 显著正相关，但与土壤稳定性磷组分（HCl-Pi 和 Residual-P） 显著负相关（P<0.05），菌剂 FD11、CH07 施入土壤促进了这些功能菌群丰度的增加，间接促进了稳定性磷组分（HCl-Pi、 Residual-P）向活性磷组分（H₂O-Pi、NaHCO₃-P）和中等活性磷组分（NaOH-P）的转化，加速了磷素循环。

3 讨论

3.1 施用溶磷菌剂对土壤速效养分及玉米幼苗生长的影响

土壤中的磷元素通常以难溶性磷酸盐的形态存在，溶磷菌或解磷菌通过分泌有机酸或磷酸酶直接矿化和溶解难溶性磷，活化磷素，促进植物对磷素的吸收^[16-20]。郜春花等^[21]施用自行研制的解磷菌剂，提高了土壤的有效磷含量，同时对作物表现出明显的增产效应。本研究得到类似的结论，本次溶磷菌剂灌根的盆栽试验表明，与不施菌剂相比较，施用菌剂 FD11 及 CH07 的土壤有效磷分别提高了107.67%、57.62%，市售 EM 菌剂处理的土壤有效磷含量也有提高，但作用不显著。说明微生物菌剂尤其是溶磷菌 FD11、CH07 溶解释放了更多可溶态的磷素供作物吸收。溶磷菌 FD11、CH07 定殖于土壤，可促进有效磷的释放和土壤库中有效磷的积累。同时，有研究表明溶磷菌还可与作物根际微生物菌群相互作用，促进土壤有机质的矿化^[22-24]，本研究中的溶磷菌剂对土壤有机质的作用可以在后期试验中进一步确定。溶磷菌剂的施用提高了土壤有效养分含量，改善了玉米根际的生态环境。

溶磷菌不仅能提高土壤有效磷含量，而且对植物的生长发育、抵抗病害等方面皆具有正向影响^[24-25]。本试验中，3 种微生物菌剂均不同程度地促进了玉米根系的生长发育，其中 FD11、CH07 处理的玉米根长、根表面积、根体积均较 CK 显著增加。施用 FD11、CH07 和 EM 菌剂处理的玉米幼苗地上部干重较 CK 分别增加了 104.00%、99.52% 和 20.80%。说明本研究施用的溶磷菌剂能促进根系变长、变粗及毛细根的生成，进而促进玉米根系对营养元素的持续吸收，提升养分利用效率，促进了玉米植株生长。这与武志海等^[23]、萧利珠等^[25]通过施加溶磷菌促进植物根系生长的结果类似。探究其促生机理：一方面，可能菌剂本身通过酸解、酶解、释放质子等方式改变了土壤理化性质，促使土壤中固定态磷钾的溶解和释放，为玉米幼苗提供了有效养分。同时，前期试验发现溶磷菌 FD11、CH07 还能分泌植物促生激素吲哚乙酸 （IAA），促生激素对玉米幼苗的生长也发挥了积极作用^[9，26-27]。再者，菌剂中的功能菌株与玉米根际土壤中的土著微生物菌群及根系分泌物相互作用，进一步增加了根际有效养分的释放，促进了根系的生长。同时，微生物代谢物促进作物对养分的吸收同时还与玉米根系分泌物相互作用，对玉米的根系形成物理防护，减少了外界对根的伤害^[28]，增强了玉米根系对水分及养分的吸收效率，促进玉米植株的生长发育。所以，菌剂 FD11、CH07 表现出的促生作用是菌剂本身的特性及其与土壤、植物相互作用的综合结果。

3.2 施用溶磷菌剂对玉米根际土壤磷素转化的影响

土壤中不同形态的磷可通过溶解、吸附、解吸、沉淀和微生物矿化等作用相互转化。溶磷菌可以通过溶解或矿化作用转化土壤磷组分，促进土壤中磷从无效态向有效态转化，提高土壤有效磷含量，促进植物生长发育^[29-30]。土壤中 H₂O-Pi、 NaHCO₃-P 是较活跃的磷素状态，容易被作物吸收利用^[15，29]。本研究中施用菌剂不同程度地提高了土壤中 H₂O-Pi 和 NaHCO₃-P 的含量，其中，FD11、 CH07 效果显著。菌剂施入土壤，分解土壤有机体，菌体细胞中的磷以微生物量磷的形式释放，而微生物量磷又是 NaHCO₃-P 的主要来源^[31]，因此，溶磷菌 FD11、CH07 的施用间接提高了 NaHCO₃-P 的含量。市售的 EM 菌剂是由乳酸菌、酵母菌、光合菌、枯草芽孢杆菌等多个菌种混合的促生菌剂，EM 处理的 NaHCO₃-P 含量低于 FD11、CH07 菌剂，可能因为该菌剂的菌种组成中具有溶磷作用的菌株含量不高或是其中功能菌的溶磷作用小于 FD11、CH07 菌株。与本研究结果相一致，较多研究者发现施用溶磷菌剂提高了土壤中 NaHCO₃-P 的含量^[29-31]，但也有研究表明溶磷菌降低了 NaHCO₃-Po 含量^[32]，这可能与功能菌本身的溶磷机制、菌株本身遗传特性及作物的栽培条件有关。

土壤中 HCl-Pi 和 Residual-P 是稳定性磷源，很难被植物吸收和利用。本研究结果表明，施用菌剂显著降低了 Residual-P 含量，CH07 菌剂显著降低了土壤中 HCl-Pi 和 Residual-P 含量。前期摇瓶培养发现，菌株 FD11、CH07 发酵液的 pH 值随着培养时间的延长而逐渐降低^[27]，推测 FD11、 CH07 菌株培养过程中分泌了酸性物质，该酸性物质溶解了土壤中稳定性磷源（HCl-Pi、Residual-P） 并转化成较高活性磷源（H₂O-Pi、NaHCO₃-P）或是中等活性磷源（NaOH-P），最终表现出土壤有效磷含量的提高。这项研究结果与李海云等^[33]研究发现溶磷菌分泌的有机酸可以分解土壤稳定性的磷源的研究结果相一致。至于 FD11、CH07 菌株在培养过程中分泌酸性物质的种类及具体机制有待进一步研究确定。

3.3 施用溶磷菌剂对玉米根际土壤细菌多样性及群落结构的影响

微生物菌剂施入土壤，其功能菌与土壤及作物根系相互作用，活化土壤中难溶性化合物，促进作物对养分的吸收，同时对植物根际的微生物也产生了影响^[34]。刘耀辉等^[15]研究发现接种溶磷菌对土壤细菌的群落结构和丰度产生了不同程度的影响，但对细菌的 α 多样性无显著影响。本研究得到相似的结果，玉米苗期施用溶磷菌 FD11 和 CH07，根际土壤细菌 α 多样性整体上保持相对稳定的状态，Shannon 指数、Chao 指数和 Ace 指数均与 CK 无显著差异。可见，菌剂施入土壤改变了部分土著细菌的丰度，但对根际土壤细菌整体多样性未表现出大的影响。这可能与菌剂本身的特性及功能菌在土壤中定殖时间的长短有关。

玉米根际土壤细菌的群落结构响应了溶磷菌剂的输入。变形菌门、拟杆菌门、放线菌门、蓝藻菌门、厚壁菌门菌群的丰度增加，酸杆菌门、疣微菌门、芽单胞菌门、绿弯菌门菌群丰度有所降低。溶磷菌 FD11 和 CH07 分别鉴定为普瑞斯特氏菌及阿氏芽孢杆菌，都属于芽孢杆菌的类群。施入的 FD11 和 CH07 定殖于根际土壤，增加了芽孢杆菌目的丰度。此外，施用 FD11、CH07 菌剂的玉米根际土壤中检测到 5 个特有的细菌属（不动杆菌属、鞘氨醇单胞菌属、假单胞菌属、海洋杆菌属、节杆菌属）。有研究表明不动杆菌属、节杆菌属可分泌胞外酶，具有较高的碱性磷酸酶活性^[35]。据此推测，玉米根际增加的不动杆菌属及节杆菌属细菌通过酶解作用溶解了土壤中不溶性磷素，提高土壤中有效磷的含量。另外，鞘氨醇单胞菌属菌株既可将难溶性磷酸盐转化为可溶性磷，又可产生 IAA、 ACC 脱氨酶、铁载体等，具有显著的促生特性^[36]。本研究溶磷菌处理的土壤中具有转化磷素及促生功能的相关菌群丰度提高，也可能是土壤有效磷提高及玉米根系生长的主要原因之一。

3.4 土壤理化特性、磷组分及细菌多样性的相关性

施用微生物菌剂有利于提高土壤中功能菌群的丰度，减少病原菌的数量，促进土壤生态系统健康良性循环^[37-38]。溶磷菌剂施入土壤，功能菌在植物根部表皮或根际土壤中定殖，通过酸解、螯合、交换反应等方式将土壤中难溶性的磷转化为可溶性的磷；或诱导土壤中的有益微生物矿化土壤有机磷、释放钾素、固定氮素，从而提高土壤中有效养分的含量^[39-40]。

芽孢杆菌目属于厚壁菌门芽孢杆菌纲，是一类重要的微生物菌种资源，它们分泌的有机酸可以溶解土壤中难溶性磷酸盐，提高土壤有效磷含量^[41]。本研究中施用溶磷菌剂后土壤中芽孢杆菌目丰度显著提高，可能是功能菌芽孢杆菌目菌株 FD11 及 CH07 在土壤中有了很好的定殖，这点可以在后期的试验中进一步分析确定。另外，FD11 和 CH07 处理的变形菌门显著提高，变形菌门能固定大气中的氮素^[40]，因此，FD11 溶磷菌剂的施用间接促进了变形菌门对氮的固定，进而表现出土壤速效氮含量的提高。

本研究中，土壤细菌不动杆菌属、假单胞菌属、海洋杆菌属、鞘氨醇单胞菌属、节杆菌属与 HCl-Pi 和 Residual-P 显著负相关，与 NaHCO₃-Po 显著正相关。在物质循环中，可能是鞘氨醇单胞菌等菌属的细菌将 HCl-Pi 和 Residual-P 转化成其他形态的磷，所以表现出 FD11 和 CH07 处理土壤 H₂O-Pi、NaHCO₃-P、NaOH-Pi 含量的提高和 HCl-Pi、Residual-P 含量的降低。另一方面，不动杆菌、节杆菌等菌属的细菌具有较高的碱性磷酸酶活性，能溶解无机磷和有机磷，促进作物生长^[35]。不动杆菌和节杆菌属丰度的提高促进了磷酸酶活性的增加，加速了矿质磷的溶解，释放出更多的磷酸根离子，从而间接促进了土壤磷组分由稳定性状态向活性或中等活性状态的转化，最终提高了土壤中有效磷的含量。因此，溶磷菌 FD11 和 CH07 施入土壤，改变了细菌的群落结构，加速了土壤养分循环，提高了土壤速效养分的含量。

4 结论

溶磷菌剂 FD11、CH07 以灌根的方式施入土壤，提高了土壤有效磷、碱解氮和速效钾的含量，显著提高了玉米幼苗根系总根长、总表面积、总体积和根尖数，促进玉米根系对营养的吸收。溶磷菌剂间接改变了玉米根际土壤细菌的群落结构，诱导功能菌群将土壤中稳定性磷素形态转化为活性磷素形态，加速了土壤磷素循环，促进了玉米幼苗的生长。

参考文献