微型月季（Rosa chinensis var. minima）根系浅、花朵小巧、株型矮小，近年来，广泛应用于室内装饰、室外花坛^[1]，市场需求量日益增加。在目前栽培生产中，节约成本、提高肥效、减少肥料浪费是实现精准、轻简高效栽培的必备条件。氮是植株生长发育的必需营养元素，参与体内叶绿素、蛋白质等物质的合成，在光合作用中起关键作用。适量氮肥可以缩短微型盆栽月季的生长周期；但过量氮肥会抑制花芽分化，延长营养生长阶段^[2]，严重时会产生烧根、烧苗等情况，降低肥效，造成环境污染。因此，实时监测植株氮素营养变化，精准估测氮素营养含量尤为重要。

植物的营养状况可以根据植物的外观来评估，研究表明，植株生长旺盛，叶子深绿色，代表生长发育过程中氮素供应充足^[3]。月季的叶片氮状态可以反映植株的生理状况^[4]，叶片叶绿体中含有约 70% 的叶片氮，叶片叶绿素含量和氮含量密切相关^[5]，因此，植物氮状态可反映在叶片颜色上。所以，对植物叶片颜色进行分析是诊断氮素潜在不足或过量的简易方法^[6]。而传统的植物氮素营养诊断方法多在实验室进行，取大量的样品利用化学分析方法测定其中所含的氮含量，再对植株进行诊断。此诊断方法不仅浪费样品，耗费时间，且无法实时监测植株氮素营养情况。为此，有学者开发了一种叶绿素计，通过测量叶片在两个不同波长区域（650 和 940 nm）的吸光度生成一个叶绿素含量相对值（SPAD 值），利用 SPAD 值间接反映植物叶片的叶绿素含量和氮含量。近些年， SPAD 值与叶绿素含量和叶片氮含量的关系不仅在大田作物马铃薯^[7-9]、小麦^[10-11]、玉米^[12]、水稻^[13-14]上被研究，还被应用在苹果^[15]、西瓜^[16] 等水果，以及黄瓜^[17]、油菜^[18]、番茄^[19-20]等蔬菜上。Markwell 等^[21]的研究表明，叶片 SPAD 值与叶绿素含量、单位干重叶氮含量存在显著相关性，因此，可用 SPAD 值预测叶绿素含量、氮含量等指标，甚至预测叶绿素含量的模型相关系数可达 0.94^[22]。但是，SPAD 值也易受多种因素的影响。生育期、叶片层位、施氮量不仅影响 SPAD 值的变化，还影响着 SPAD 值与氮含量之间的相关性^[23]。

微型盆栽月季水肥需求高，目前的水肥管理多为经验式粗放管理，无法精准判断生长营养情况。利用 SPAD 氮饱和指数可以评估氮素营养丰缺诊断指标^[24]，判断各生育时期临界氮浓度，但目前关于 SPAD 氮饱和指数的研究主要在大田作物上^[25]，观赏植物上的研究较少。本研究以 4 个不同微型盆栽月季品种为试验材料，分析不同氮水平处理下植株营养生长指标的变化及不同生育期、不同层位叶片 SPAD 值与氮含量之间的相关性，筛选出不同生育期合适的叶片层位，构建微型盆栽月季利用叶片 SPAD 值估测叶片氮含量的模型，并比较单一品种检测模型与多品种混合检测通用模型的优劣势，构建 SPAD 氮饱和指数评估方程，探索微型月季氮素实时诊断，为氮素快速诊断提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

本试验于 2021 年 3 月至 12 月在中国农业科学院蔬菜花卉研究所云南基地（玉溪紫玉花卉产业有限公司，34°19′N，102°30′E）进行，地处低纬高原，属亚热带湿润季风气候，冬夏短春秋长，年内温度变化差异不大，年均温约 16℃，年平均日照时数约 2200 h。

1.2 试验设计

供试微型盆栽月季品种为‘Juicy Terrazza’ ‘Cinde rella’‘Ro se Terrazza Pi sce’‘Apollo Jewel’，以苗龄 30 d 的扦插苗为试验材料，每盆 5 株，种植基质为泥炭∶蛭石（V∶V）=3∶1，全氮 1.23 mg·L^-1，全磷 25 mg·L^-1，全钾 155 mg·L^-1。本试验采用潮汐式管道无土栽培灌溉系统，管道离地 77 cm，管径 10 cm，在管道上开孔放置 110 mm 的花盆，株距 11 cm，行距 9.5 cm，将配置好的营养液利用水泵打入管道中进行循环，每两天施加一次营养液，直至植株达到盛花期。其中营养液的氮浓度设置 4 个水平，分别为 0 mg·L^-1 （N1）、70 mg·L^-1（N2）、140 mg·L^-1（N3）、 210 mg·L^-1（N4），其中 N4 处理为高氮处理，其他元素恒定。每个处理设置 3 次重复，每次重复 28 盆。将测定的数据一部分用来构建模型，剩余数据用作模型验证样本。根据市场需求，为使月季盆型丰满，花头数多，在植株第一次现蕾后需要摘心。分别在摘心时（S1 时期）、摘心后单株长出 5～6 片叶片时（S2 时期）、初现蕾时（S3 时期）、盛花期（S4 时期）进行叶片分层测定生长发育相关的指标。S1 和 S2 时期，从植株第一片完全展开复叶开始，每两片复叶作为一层，分为上、下两个层位；S3 和 S4 时期，每三片复叶为一个层位，分为上、中、下三层；由于 N1 处理下的微型盆栽月季植株生长势较差，在 4 个时期均是以每两片复叶作为一个层位进行取样。

1.3 测定项目与方法

原位测定 SPAD 值与其他营养生长指标，测定后立即从距离基质 1 cm 处剪取植株测定鲜重，烘干测定干重，收取所有烘干叶片进行磨碎、测定叶片氮含量。

1.3.1 生长指标测定

生长指标包括株高、茎粗、叶片数、叶片厚度、叶面积和干、鲜重。原位测定株高、茎粗、叶片数、叶片厚度和叶面积。其中，从基质表面向上用直尺测定垂直株高；在距离基质表面 1cm 处用游标卡尺（DL91150，浙江得力）测定茎粗；从距离基质表面 1 cm 处起将植株上所有完全展开叶的数量记为叶片数；利用手持式激光叶面积仪（CI203，美国 CID）夹取叶片基部，匀速向上抽取仪器直至离开叶片，测定叶面积；叶片厚度使用多功能植物测量仪 MultispeQ（MI48823，美国）测量植株由上至下第 4 片完全展开的复叶，固定选取顶端小叶片中部较宽的部位。测定完上述指标后，立即从距离基质 1 cm 处剪取植株，利用天平测定重量即为鲜重。测定鲜重后，放入 105℃下的烘箱中杀青 30 min，降温至 70℃烘干至恒重的重量，记为干重。

1.3.2 叶片 SPAD 值测定

用多功能植物测量仪 MultispeQ 测定月季从上层至下层位的 SPAD 值，固定选取复叶顶端小叶片中部较宽的部位，各层位随机测定 15 个复叶，求平均值作为该层叶片的 SPAD 值。

1.3.3 叶片氮含量测定

根据《植物中氮、磷、钾的测定》（NY/T2017— 2011）的要求测定样品中的全氮含量，按照《食品安全国家标准食品中多元素的测定》（GB 5009.268—2016）中氮含量的消化方法对样品进行消化，对干样进行粉碎、过筛，然后称取 0.2 g 样品干粉，进行浓硫酸消煮，再用凯氏定氮仪测定氮含量。

1.3.4 SPAD 氮饱和指数

设置 N1、N2 和 N3 处理作为被测氮素小区， N4 处理为氮素饱和小区，公式为：

SPAD 氮饱和指数 = 被测氮素小区 SPAD 值 / 氮素饱和小区（高氮区）SPAD 值

1.4 数据分析

利用 Excel 2016 对数据进行整理，通过 SPSS 22.0 对整理数据进行单因素方差分析（多重比较用 Duncan 检验）和相关性分析，利用 Origin 2018作图。

1.4.1 偏差率

对叶片 SPAD 值与单位干重叶片氮含量进行线性回归与非线性回归分析，选取拟合最优（R² 最大）的回归方程作为预测模型，同时将相应的 SPAD 值带入方程，计算叶片氮含量预测值，再与实测值计算偏差率，公式为：

$\begin{array}{c}D=\left(P_{\text{实测值}}-P_{\text{预测值}}\right)/P_{\text{实测值}}\times 100\%\\ AD=\sum \left|D\right|/n\end{array}$

式中：D 表示偏差率，P 表示微型盆栽月季叶片氮含量，AD 表示平均偏差率，$\left|D\right|$表示偏差率绝对值， n 表示指标个数。

1.4.2 预测的均方根误差

均方根误差（RMSE）通过预测值和实测值进行计算，公式为：

$RMSE=\sqrt{\frac{1}{n}\sum _{i=1}^n{\left(P_{\text{实测值}}-P_{\text{预测值}}\right)}^2}$

2 结果与分析

2.1 不同施氮水平与不同生长发育时期对微型盆栽月季植株营养生长的影响

由图1 可知，在不同施氮水平下，4 个不同微型月季品种在整个生长发育时期的株高、茎粗、叶片厚度、叶面积及干、鲜重等性状指标的变化趋势基本相似，且绝大多数性状指标在不同施氮水平间和不同生长发育时期间均存在一定的差异。在同一生长发育时期条件下，N1 处理下的绝大多数性状指标均低于其他处理；而 N2、N3 和 N4 处理间，尽管株高、茎粗、叶面积均差异不明显，但叶片厚度却表现出较大的差异；S2～S4 时期的叶片干、鲜重在 N2、N3 和 N4 处理间也表现出明显的差异。在整个生长过程中，N1 处理下植株随着生育期的推进，干、鲜重变化不大，其他处理则在植株生殖生长阶段干、鲜重呈快速增长，缺氮会严重影响植株的生长发育。

2.2 不同施氮水平与不同生长发育时期对微型盆栽月季叶片氮含量的影响

由图2 可知，微型盆栽月季叶片的氮含量在不同的施氮处理间和不同的生长发育时期间均存在显著差异。在整个生育期中，S2 和 S3 时期的整株叶片氮含量较高。随着生育期的推移，在 S4 时期，整株叶片氮含量呈现下降趋势。不同的氮素供应水平对整株叶片氮含量影响显著，N1 处理下的整株叶片氮含量显著低于其他处理下的叶片氮含量；随着施氮量的增加，植株的整株叶片氮含量会先上升后逐渐趋于平稳。

2.3 不同施氮水平与不同生长发育时期对各层位叶片 SPAD 值的影响

从图3 可以看出，4 个不同品种在整个生长发育时期叶片 SPAD 值变化趋势基本一致，且各层位的叶片 SPAD 值变化趋势也基本类似。在每个生长阶段，不同氮素水平均显著影响了微型月季上下层叶片的 SPAD 值。在整个生育期，N3、N4 处理下的叶片 SPAD 值基本上都高于 N1、N2 处理下的叶片 SPAD 值；其中，N1 处理下的叶片 SPAD 值最小。总体来讲，叶片 SPAD 值是随着施氮量的增加而上升的，但当施氮量超过一定水平后，SPAD 值随着施氮量的增加而趋于平稳或略呈下降趋势。此外，在各生育期不同层位的叶片 SPAD 值也存在显著差异，在 S1～S3 时期，下层叶片 SPAD 值高于其他层叶片 SPAD 值，而在 S4 时期，上层叶片 SPAD 值高于其他层位，以上表明层位也会影响植株叶片 SPAD 值大小。因此，不同施氮水平、不同生长发育时期和不同叶片层位均会显著影响微型盆栽月季的叶片 SPAD 值。

2.4 不同层位叶片 SPAD 值与全氮含量的相关性

对微型盆栽月季不同层位的 SPAD 值与叶片氮含量进行相关性分析（表1）。各层位叶片的 SPAD 值与叶片氮含量呈正相关，相关系数均大于 0.7，且均达到显著水平（P ﹤ 0.05），说明两者关系紧密，相关性强，可以利用 SPAD 值估测叶片氮含量。

2.5 微型盆栽月季叶片氮含量单品种回归模型构建及评价

将各生育期不同层位的微型盆栽月季叶片SPAD 值与单位干重叶片氮含量进行线性和非线性回归分析（回归方程中自变量 x 表示叶片 SPAD 值，因变量 y 表示单位干重叶片氮含量），通过拟合度，最终选出决定系数最大的模型，确定每个品种在各生育期的最佳测定叶片层位及最优模型 （表2）。由此可见，生长发育时期、叶片层位、品种都会对构建的模型产生影响。综合来看，在 S1、 S2、S3 时期基本上最佳测定叶片层位为下层，而在 S4 时期最佳测定叶片层位为中层。且微型盆栽月季在不同生长发育时期构建的最优函数关系模型也不同，基本是指数函数关系模型和二次项函数关系模型。每个品种各生育期的方程拟合度均达到极显著水平，可以用来预测微型盆栽月季叶片氮含量。为进一步判断回归模型的准确度，根据偏差率公式对微型盆栽月季的各个最优估测模型进行偏差率计算（表3），不同生长发育时期所建回归模型估算偏差不同。根据‘Juicy Terrazza’‘Cinderella’ 和‘Rose Terrazza Pisce’在 4 个生长发育时期的估测模型估算氮含量时，平均偏差率均低于 10%，标准差低于 3 mg·g^-1，RMSE 低于 1～3.04。‘Apollo Jewel’ 在 S2 时期估算平均偏差为 12.29%，标准差 3.60 mg·g^-1，RMSE 为 3.66；而在 S1、S3 和 S4 时期估算平均偏差为 4.67%～8.33%，均低于 10%，标准差为 0.98～2.46 mg·g^-1，RMSE 为 0.99～2.46。因此，在这 4 个品种上按照生长发育时期建立的最优模型均可以用来估算本品种在该时期的叶片氮含量。

注：图柱上不同小写字母表示同一时期氮处理间差异显著（P<0.05）。

注：图中不同小写字母表示同一层位氮处理间差异显著（P<0.05）。

由于不同品种建立的最优氮含量估测模型选取的函数不一致，参数也具有差异。所以当利用基于某单一品种建立的最优方程去估算其他品种的氮含量时，估测结果会出现偏差，估测效果见表4。异品种估测模型偏差率可达 4.14%～69.21%，表明利用单一品种建立的模型预测其他品种的氮含量会加大估算偏差，降低模型准确度和稳定性。因此，在基于 SPAD 值估测微型盆栽月季氮素营养时，用单一品种建立的最优模型在其他品种上的通用性较差。

2.6 微型盆栽月季叶片氮含量综合回归模型构建及评价

由于利用单一品种建立的模型估测其他品种叶片氮含量效果较差，因此，将 4 个微型盆栽月季品种各层位 SPAD 值与氮含量数据混合，建立各生长发育时期基于 SPAD 值估测叶片氮含量的最优综合模型（图4）。S3 时期最优模型为幂函数模型，决定系数达 0.8782；而其他时期最优模型为二次项函数模型，拟合度达到显著水平（P<0.05）。不同叶片层位影响 SPAD 值与叶片氮含量的相关性，S1 与 S2 时期最优测定层位是下层叶片，S3 和 S4 时期最优测定层位是上层叶片。

根据最优模型确定各个时期的叶片层位，另外测定已确定层位叶片的 SPAD 值代入综合模型，进行验证（图5）。在各生育期建立的模型在估测精度和跟踪叶片 SPAD 值动态变化上表现良好， RMSE 为 1.15～1.61，标准差为 3.56～6.16，平均偏差率均低于 15%。总体上，基于 SPAD 值的微型盆栽月季氮营养综合模型相对于单一品种模型具有较好的通用性。

2.7 微型月季 SPAD 氮素饱和指数与叶片氮含量相关性分析

计算各时期估测叶片氮含量最优层位叶片的 SPAD 氮素饱和指数，并且与叶片氮含量进行相关性分析（ 表5）。在 5 种回归方程中，各生育期 SPAD 氮素饱和指数与叶片氮含量之间均为多项式模型相关性较高。S1 时期多项式回归方程为 y=42.348x²-27.922x+18.697，R² 达 0.752；S2 时期多项式回归方程为 y=30.794x²-4.2413x+11.637，R² 达 0.656；S3 时期多项式回归方程为 y=-16.651x² + 70.558x-21.772，R² 达 0.670；S4 时期多项式回归方程为 y=31.489x²-19.456x+17.609，R² 达 0.762。表明多项式相较于其他 4 种回归方程更能指导微型月季氮素诊断。

注：* 表示相关显著（P<0.05），** 表示相关极显著（P<0.01）。

3 讨论

3.1 氮素对微型盆栽月季生长的影响

氮素是植株生长必不可少的营养元素，施氮量对微型盆栽月季的营养生长影响显著。本研究设置了 4 个氮肥水平分别浇灌微型盆栽月季，结果表明，氮素对微型盆栽月季的营养生长具有促进作用，植株的生物量随施氮量的增加而增加。微型盆栽月季在不同生长发育时期所需氮量不同。其中，在 S2、 S3 时期，植株萌芽阶段和快速生长阶段，不同施氮处理下的微型盆栽月季生长差异最大，表明此时对氮的需求最为敏感。此时随着施氮量的增加，微型盆栽月季的株高、茎粗、叶面积都有提高。但植株对氮的吸收具有临界点，‘Rosa Terrazza Pisce’在 S2 时期至 S4 时期，N4 处理下的植株叶片均薄于 N3 处理下的叶片，这可能是由氮肥施入量超过植株的临界点所导致。适量的氮肥会促进植株营养生长，但是当施加的氮肥超过一定量后，植株对氮素的吸收呈现饱和趋势，可能会导致植株叶片变薄、叶面积增加等现象。在 S2～S3 时期，N2～N4 处理下的植株片厚度基本呈上升趋势，而在 S3～S4 时期则呈略下降趋势，生长前期植株的叶片厚度随氮肥的施入而增加，而随着植株体内氮素累积，成熟叶片出现氮饱和，反而随着氮含量的提高而变薄，与 Li 等^[26]的研究发现一致。

3.2 氮素和层位对叶片 SPAD 值的影响

氮在植物体内具有流动性，垂直分布的特性致使植物叶片内生理生化反应具有空间异质性^[27]。 SPAD 值可以间接反映植株的氮营养情况，不同的叶片层位会对叶片 SPAD 值产生显著影响。本研究表明，在萌芽阶段和快速生长阶段，微型盆栽月季下层叶片的 SPAD 值大于上层叶片，可能是因为氮素从下往上运输，基部的 SPAD 值较大；而在生殖生长阶段，上层叶片 SPAD 值大于下层叶片的 SPAD 值（图3），这与欧阳杰等^[27]研究一致，可能是由于上层叶片氮含量的增加减缓了叶绿素的降解速度，或者因为在 S4 时期，微型盆栽月季下层叶片进入衰老期，老叶出现黄化情况，氮素营养逐渐向上层新叶转移，下层叶片叶绿素含量下降，最终导致下层叶片 SPAD 值偏低^[28]。除叶片层位对叶片 SPAD 值显著影响外，施氮水平也对叶片 SPAD 值产生显著影响。植物在遭受胁迫时，叶绿素含量会迅速下降。N1 处理下的微型盆栽月季叶片 SPAD 值始终极显著低于其他处理，但叶片 SPAD 值并不是随着氮素的增施而一直增加，而是在增施到一定量后，SPAD 值呈现下降趋势。‘Rose Terrazza’ 和‘Apollo Jewel’ 在 S1 和 S3 时期，N3 处理下 SPAD 值达到最大值，N4 处理下的反而略有下降。可能是因为植物正处于氮素营养饱和状态，此时氮肥的增施导致叶片总氮含量反而下降， SPAD 值也随着降低^[21]。

3.3 不同层位叶片 SPAD 值差异

本研究结果表明，微型盆栽月季叶片 SPAD 值与叶片氮含量之间存在显著相关性，构建的最优函数关系模型决定系数高达 0.719～0.982，且不同品种、不同生育期构建的最优模型函数不同，其中以多项式和指数模型函数为主，且各模型系数具有差异，决定系数不同，这与张银杰等^[22]在玉米上的研究结果一致（表2）。前人在柠檬^[29]、大白菜^[30]和水稻^[31]上均依据叶片 SPAD 值建立了氮估测模型，且模型的决定系数均较高。由此可见，可以基于叶片 SPAD 值估测植物氮素营养状态。不同层位的叶片 SPAD 值与叶片氮含量相关性存在差异，Yuan 等^[13]研究表明水稻的第四片完全展开叶可以评估氮素营养状况。党蕊娟等^[32]在玉米中发现上层叶片与叶片氮含量相关性最高，利用上层叶片检测氮素营养最准确。本研究同样发现在不同生育期估测叶片氮含量的最佳叶片层位不同，如在S1、S2 时期，利用下层叶片 SPAD 值估测叶片氮含量最为准确，而在 S3、S4 时期则是中上层叶片估测结果更为准确（表1），这可能是因为前期植株在萌芽阶段和快速生长阶段吸收的氮素未达到临界点，且受到氮素运输的影响，下层叶片更能体现植株体内氮素含量。而在现蕾期和盛花期下层叶片对氮素的吸收已达到饱和，此时中上层叶片则能体现氮含量的差异。因此，在各生长发育时期选择适合的测定层位有利于增加估测氮素营养的准确度。

3.4 基于 SPAD 值氮素营养诊断

由于植物各品种之间的遗传差异，各品种具有不同的生理特性，且 SPAD 与叶片氮含量之间的关系易受叶片特征的影响，因此一般情况下对不同品种建立不同的回归模型^[33]。但是，这种方法需要建立大量模型，增加成本，维护不方便。因此，建立基于 SPAD 值的微型盆栽月季氮素营养估测通用模型有助于推广、生产使用。周丽丽等^[34]在研究玉米叶片氮含量诊断时，比较了异品种模型和综合模型，虽相较本品种数据建立的模型加大估算偏差，但异品种模型优于综合模型。在本研究中，微型盆栽月季的异品种模型与综合模型相较于本品种模型，估算偏差增加，模型稳定性及准确度降低，但综合模型的决定系数也可达 0.68～0.88，估算偏差为 9.97～14.99，RMSE 为 1.15～1.61，可以用于植株叶片氮营养诊断（图4 和图5）；相对于异品种模型，综合模型减小了品种差异对预测模型稳健性的影响，具有更好的通用性。除基于 SPAD 值建立估测模型外，还建立了 SPAD 氮素饱和指数方程，得出利用多项式回归方程估测较为准确。已有学者提出利用氮饱和指数评估植物氮素水平的临界值，将 0.95 作为临界氮饱和指数，当氮饱和指数小于等于 0.95 时，考虑氮素供应不足，应结合更多因素，适当增加氮肥施入量，提高氮肥利用率^[24]。本研究只选用了 4 个微型盆栽月季品种建立了叶片氮含量的估测综合模型，若需要进一步提高综合模型的精确度和稳定性，仍需要补充更多的品种作为试验材料。在对氮饱和指数的研究中，若想获得更为可靠的临界氮素水平，还需根据所得方程设置阈值，并利用实时监测试验进行更深层分析。

4 结论

氮素营养是微型盆栽月季的营养生长必需的营养元素，随着氮肥的增加，营养生长指标与叶片 SPAD 值均呈先增加后逐渐趋于平稳的趋势。叶片 SPAD 值与叶片氮含量之间显著相关，且不同层位的叶片 SPAD 值与叶片氮含量的相关性存在差异。基于叶片 SPAD 值建立的微型盆栽月季叶片氮素估测综合模型优于单一品种构建的模型。在 S1 和 S2 时期均利用下层叶片的 SPAD 值构建了叶片氮素估测最优综合模型，分别为 y=0.0009x² + 0.6115x+0.8047 和 y=0.002x² +0.7118x+2.3382，而在 S3 和 S4 时期均利用上层叶片的 SPAD 值构建了叶片氮素估测最优综合模型，分别为 y=0.1279x^1.4938 和 y=-0.0015x² +0.5204x+3.7738。综上所述，氮饱和指数利用多项式方程对微型月季氮素诊断更为准确。

参考文献