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植物根际促生菌（PGPR）是一类定殖于植物根际、对植物生长起促进作用的细菌，具有加速营养物质吸收利用、防治植物病害和应对非生物胁迫的能力[1]。最新的研究表明，PGPR 可以调节作物对养分的吸收利用[2]或产生植物生长调节物质[3-4] 等直接或间接促进农作物的生长。同时，农作物也可以通过分泌各种代谢产物来影响 PGPR，农作物的代谢产物与 PGPR 之间的相互作用在一定程度上也会影响农作物的生理状况[5-6]。目前，已经鉴定出多种 PGPR，其中的芽孢杆菌因抗逆性强而备受关注，芽孢杆菌可分泌大量的酶、有机酸等活性物质促进复杂有机物的分解，使作物对营养物质的吸收利用更加高效[7]，因此，芽孢杆菌被广泛应用于微生物肥料产品中。
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海南省是我国橡胶树的主要种植区域，自 20 世纪 50 年代大面积种植橡胶树以来，持续且高强度的人为管理措施，扰动了天然橡胶林的土壤微生物多样性，使得橡胶人工林出现土壤养分失衡、土壤酸化等一系列问题[8]。有研究表明，不合理的人为管理措施导致海南橡胶园所在区域的土壤综合肥力处于中等偏下水平[9]，土壤有机质和有效磷含量已不能满足研究区橡胶树正常生长的需要[10-11]。因此，通过施用微生物菌剂，改善土壤微生态环境，实现海南橡胶种植产业的健康可持续发展势在必行。本研究对橡胶树 0～20 cm 土层的根际土壤微生物进行分离，以期筛选出具备高效促生能力兼具溶磷效果的促生菌株，并通过发芽试验和盆栽试验验证其促生效果，为微生物肥料的开发应用提供宝贵的菌种资源和理论依据，也为微生物肥料的应用和推广提供指导。
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1 材料与方法
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1.1 培养基配方
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LB 培养基：氯化钠 10 g、蛋白胨 10 g、酵母粉 5 g（固体培养基再加琼脂 15 g）、蒸馏水 1000 mL、 pH 7.0～7.2。
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PDA 培养基：马铃薯 200.0 g、葡萄糖 20.0 g、琼脂 18.0 g、蒸馏水 1000 mL。
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无机磷培养基：磷酸三钙 5.0 g、葡萄糖 10.0 g、碳酸钙 5.0 g、硫酸铵 0.5 g、氯化钠 0.3 g、七水合硫酸镁 0.3 g、氯化钾 0.3 g、硫酸锰 0.03 g、七水合硫酸亚铁 0.03 g、蒸馏水 1000 mL、pH 7.0～7.2。
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有机磷培养基：无机磷培养基基础上再加 0.3 g 卵磷脂。
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CAS 检测培养基：CAS（上海麦克林生化科技有限公司）60.5 mg、十六烷基三甲基溴化铵（北京索宝来科技有限公司）72.9 mg、1 mmol·L-1 FeCl3·6H2O（10 mmol·L-1 HCl 配制）10 mL、0.1 mol·L-1 磷酸盐缓冲液 50 mL、琼脂 9.0 g、蒸馏水 940 mL。
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1.2 促生功能菌的筛选
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1.2.1 菌株的分离纯化
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于海南省乐东黎族自治县选取橡胶园长势旺盛的橡胶树，按五点采样法取 0～20 cm 根际土壤。称取根际土 10 g 加入装有 90 mL 无菌水的三角瓶中，随后将三角瓶置于摇床上 180 r·min-1、28℃ 振荡 30 min，静置 2 h，直至液体分层，取上清液分别稀释 10-2～10-6 梯度，得到浓度为 10-2～10-6 g·mL-1 的菌悬液，采用稀释涂布平板法分离纯化。
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1.2.2 产吲哚乙酸能力测定
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将分离纯化后的菌株接种于含质量浓度为 100 mg·L-1 的 L-色氨酸的 LB 液体培养基中，在 28℃、180 r·min-1 条件下摇床培养 24 h。
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（1）定性测定：在白色陶瓷板上滴加 50 μL 菌悬液，同时加入等量 Salkowski 显色液（50 mL 35%HClO4+1 mL 0.5 mol·L-1 FeCl3），混匀，于室温、避光条件下放置 30 min 后进行观察，若产生红色反应则说明有吲哚乙酸（IAA）的产生。
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（2）定量测定：于 10000 r·min-1 的条件下将 10 mL 菌悬液离心 10 min，取上清液，同时配置浓度依次为 0、10、20、30、40、50、60 mg·L-1 的 IAA 标准溶液，上清液、IAA 标准液按 1∶1 的体积比与 Salkowski 显色液混合，避光静置 30 min，测定其 OD530 值，根据标准曲线计算各菌株的产 IAA 能力。
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1.2.3 溶磷能力检测
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用接种环挑取单菌落接种于 LB 液体培养基的三角瓶中，于 28℃、180 r·min-1 振荡培养 24 h 获得接种液。取 5 mL 接种液分别接种至无机磷培养基和有机磷培养基中，28℃、180 r·min-1 摇床培养 72 h 后，取 15 mL 培养基在 10000 r·min-1 条件下离心 10 min，并取上清液用钼锑抗比色法测定有效磷含量[12]。
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1.2.4 铁载体定性检测
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将纯化得到的单菌落点接种在 PDA 培养基上，在培养箱中于 28℃ 条件下培养 5 d。待灭菌后的 CAS 检测培养基冷却至 40℃左右时，将其按照每个平板 10 mL 倒入 PDA 培养基平板中，放置 1 h 观察每个平板是否出现黄色或橙红色晕圈，若出现黄色或橙红色晕圈代表有铁载体产生。
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1.2.5 蛋白酶定性检测
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将灭菌后的 LB 培养基冷却至 50℃，将脱脂牛奶按体积比 10% 的比例加入 LB 培养基中，混匀后倒入培养皿，即得到蛋白酶检测培养基。将活化后的菌株接种到蛋白酶检测培养基表面，28℃下培养 48 h，观察是否有溶解圈出现。
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1.3 菌株鉴定
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1.3.1 形态学鉴定与生理生化指标鉴定
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将高产促生活性物质的菌株采用四区划线法接种到牛肉膏蛋白胨培养基中，30℃培养 48 h 后观察菌种的形态，并革兰氏染色、好氧性、接触酶、甲基红、V-P、淀粉水解、明胶水解、硝酸盐还原、柠檬酸盐利用等生理生化指标鉴定，试验方法均参照《常见细菌系统鉴定手册》[13]。
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1.3.2 16S rDNA 序列鉴定
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将分离筛选得到的促生菌株接种于 LB 固体培养基表面，培养 24 h 后，挑取 1 个新鲜单菌落置于 1.5 mL 离心管中，加入 10 μL S2 裂解液（购自北京擎科生物技术有限公司），振荡混匀，室温静置 20 min，随后稀释 20 倍，振荡混匀，12000 r·min-1 离心 2 min，取上清液作为模板，扩增引物为细菌通用引物 27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′） 和 1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′） 进行聚合酶链式（PCR）扩增。反应体系：15 μL 2×EasyTaq SuperMix、1.5 μL 27F（10 μmol·L-1）、 1.5 μL1492R（10 μmol·L-1）、5 μL 模板、7 μL ddH2O。扩增酶：code#AS11。PCR 反应条件：94℃ 5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 90 s，循环 35 次，延伸 72℃ 7 min，4℃ 保存。系统发育分析时排除碱基缺失位点，采用 Neighbor-Joining 法，用 Mega5.0 构建供试菌株与参比菌株之间的系统发育树。
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1.3.3 全基因组测序
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将 S03 菌株接种于 LB 液体培养基中，在 28℃、200 r·min-1 条件下摇床培养 24 h，4000 r·min-1 离心 15 min 收集菌体，委托北京擎科生物技术有限公司完成全基因组测序。
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1.4 种子发芽试验
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将活化的 S03 菌株接种于 LB 液体培养基中，28℃、180 r·min-1 下摇瓶培养 30 h，得到菌悬液，采用平板计数法检测菌悬液的有效活菌数，然后用 LB 液体培养基将菌悬液浓度稀释为 1×108 cfu·mL-1 的菌液备用。
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将小油菜种子（Brassica napus L.）用 75% 酒精浸泡 5～10 min 进行表面消毒，用无菌水洗涤 4 遍。每个处理添加 10 mL 培养液，倒入装有双层滤纸的无菌培养皿中，每个培养皿加入数量相等、相对饱满的种子（50 粒），各设 3 个重复。培养皿于 28℃恒温培养箱中培养 7 d。种子萌发试验设置水（CK）、LB 液体培养基（A1）、0.01 mL S03 菌液（A2）、0.1 mL S03 菌液（A3）、0.5 mL S03 菌液（A4）、1 mL S03（A5） 菌液共 6 个处理，每个处理各设 3 次重复。统计第 7 d发芽数，计算发芽率，并测量株高和根长。小油菜种子萌发以胚根伸出 1 mm 为标准，发芽率计算公式见式（1）[14]。
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式中，η 为发芽率，a 为第 7 d 发芽数，b 为种子总数。
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1.5 盆栽试验
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取长势均匀、生长状态良好的小油菜移栽至试验盆中，每盆 2 株，盆内缓苗 7 d，将制备好的菌液加至小油菜的根部，分别加入 10 mL LB 液体培养基（CK）、1 mL S03 菌液 +9 mL LB 液体培养基（B1）、5 mL S03 菌液 +5 mL LB 液体培养基（B2）、10 mL S03 菌液（B3），每个处理 3 次重复，随机放置在日照培养箱，根据情况每天施加等量水，并于 15 d 后进行第 2 次施菌（施菌量与施菌方法同第 1 次）。培养箱设置为昼（8： 00—18：00），温度 20℃，光照强度 5000 Lx；夜 （18：00—8：00），温度 16℃，关闭光照灯，相对湿度为 60%，培养 30 d 后测定小油菜叶片叶绿素、维生素 C（Vc）、植株全磷和土壤有效磷含量及根长、地上鲜重等指标。
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2 结果与分析
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2.1 菌株促生特性研究
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从采集的根际土壤中共筛选分离出 12 株菌株，将其分别命名为 S01～S12，对其进行促生能力验证，得到一株产 IAA、铁载体、蛋白酶和溶解无机磷能力好的菌株 S03，其产 IAA 能力为 45.73 mg·L-1，溶解无机磷的能力为 82.30 mg·L-1，产铁载体溶解圈直径为 38.50 mm，产蛋白酶溶解圈直径为 33.62 mm（表1）。
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2.2 菌株 S03 鉴定
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于 48 h 培养后观察菌株 S03 的情况（图1），其菌落呈乳白色，圆形且菌落较大。通过革兰氏染色在显微镜下观察发现，菌株 S03 为革兰氏阳性菌，长杆状，单个出现，生理生化特性见表2。将 16S rDNA 所得序列与 GenBank 数据库中的序列进行 BLAST 比较，应用 MEGA 构建系统发育树（图2），菌株 S03 与 NR 157736 的序列同源性最高，结合全基因测序结果，鉴定菌株 S03 为热带芽孢杆菌（Bacillus tropicus）。
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图1 菌株 S03 形态特征
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注：+：阳性反应；-：阴性反应。
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图2 菌株 S03 基于 16S rDNA 序列构建的系统发育树
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为进一步明确菌株 S03 的促生机制，本研究对其全基因进行了测序，测序组装后得到的基因组大小为 5420614 bp，碱基对 G+C 含量为 36.02%，编码基因总长度为 4587870 bp，编码基因平均长度为 810 bp，编码区总长度占全基因组的比例为 84.64%，采用 GeneMarkS 注释共预测出 5666 个基因，其中蛋白质编码基因 5345 个，RNA 基因 112 个，伪基因 209 个。其中，112 个 RNA 基因包括 rRNA 基因 （5S/16S/23S）15 个、tRNA 基因 91 个和 ncRNA 基因 6 个（表3）。碳水化合物酶活性分析显示，S03 染色体中含有 52 个编码糖苷水解酶的基因、55 个编码糖基转移酶的基因、16 个编码糖类酯解酶的基因、45 个编码碳水化合物结合相关酶的基因、2 个编码氧化还原酶的基因（图3）。同源聚类基因簇分析显示，S03 有 77.48% 的基因功能得到了注释，丰度较大的是参与氨基酸转运和代谢、转录的基因，分别有 399、391 个；其次是参与翻译、核糖体结构和生物生成的基因，有 309 个；碳水化合物转运和代谢、细胞壁 / 膜 / 包膜生物生成、无机离子转运和代谢的基因分别为 289、237 和 240 个；次级代谢物的生物合成、转运与代谢的基因有 101 个；2 个基因参与了非核糖体多肽的合成 （图4）。GO 数据库对比分析显示：S03 含有蛋白水解合成（GO：0006508）、嗜铁素生物合成（GO： 0019290）、几丁质酶（GO：0004568）、纤维素酶 （GO：0008810）、磷酸酶（GO：0016791）、磷代谢（GO：0006793）和生长素合成等相关的基因。以上分析暗示了 S03 具备产 IAA、铁载体、蛋白酶和溶磷等促进植物生长的特性。
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图3 热带芽孢杆菌 S03 的碳水化合物酶活性分析
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注：AA：氧化还原酶，CBM：碳水化合物结合相关酶，CE：糖类酯解酶，GH：糖苷水解酶，GT：糖基转移酶，PL：多糖裂解酶。
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图4 热带芽孢杆菌 S03 的同源聚类基因簇分析
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注：A：RNA 加工与修饰，B：染色质结构和动力学，C：能源生产和转换，D：细胞周期控制、细胞分裂、染色体分配，E：氨基酸转运和代谢，F：核苷酸转运和代谢，G：碳水化合物的转运和代谢，H：辅酶的运输和代谢，I：脂质运输和代谢，J：翻译、核糖体结构和生物生成，K：转录，L：复制、基因重组和修复，M：细胞壁 / 膜 / 包膜的生物生成，N：细胞运动，O：翻译后修饰、蛋白质周转、合子，P：无机离子转运和代谢，Q：次级代谢物的生物合成、转运和代谢，R：仅限一般功能预测，S：功能未知，T：信号转导机制，U：细胞内运输、分泌和囊泡运输，V：防御机制，W：细胞外结构，X：核结构，Z：细胞骨架。
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2.3 小麦种子发芽试验
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加入 S03 菌液后，各处理的种子萌发及生长情况如表4。除 A2 处理的根长，A2、A3、A4 处理的小油菜种子发芽率、株高、根长皆高于 CK 和 A1 处理，说明添加 S03 菌液能够促进小油菜种子的萌发，对小油菜幼苗的生长有促进作用，其中 A4 的油菜种子发芽率、株高、根长均最高，表明在 S03 菌液添加量为 0.5×108 cfu·mL-1 时，促进小油菜种子萌发和生长的效果最好。A5 处理的株高、根长略低于 CK 和 A1 处理，表明在 S03 菌液添加量为 1×108 cfu·mL-1 时，对小油菜种子的萌发有一定的抑制效果，并且抑制了小油菜的生长。
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2.4 菌株 S03 对小油菜生物性状影响分析
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由表5 可知，施用 S03 菌液可显著促进小油菜根系和地上部分的生长，与 CK 处理相比，施用 S03 菌液的处理根长分别提高 39.6%、31.2%、 27.9%，地上鲜重分别提高 18.88%、22.21%、 13.36%。B1、B2、B3 处理的小油菜植株全磷含量显著高于 CK 处理，而土壤有效磷含量显著低于 CK 处理，有效磷含量分别降低了 7.82%、7.06%、 5.47%，表明施用 S03 菌液后，土壤中部分难溶性磷酸盐可以被分解为可供植物吸收利用的磷，对小油菜的生长发育具有一定的促进作用，同时，提高了作物对磷的吸收利用能力。S03 菌液的施用不仅促进了小油菜的生长，增加小油菜生物量，而且还改善了小油菜的品质，B1、B2、B3 处理的 Vc 含量和叶绿素含量显著高于 CK 处理。
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3 讨论
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近年来，我国在根际促生菌的研究上取得了众多成果，为微生物肥料的开发应用提供了宝贵的菌种资源[15-16]。土壤磷主要以无机磷的形态存在，其中无机磷又以磷酸盐中的钙盐为主，因此细菌解磷酸三钙的能力可在一定程度上反映出细菌在土壤中解磷能力的强弱，筛选解磷酸三钙能力较强的细菌用于菌肥生产更适合推广应用[17-18]。本研究筛选得到一株热带芽孢杆菌 S03，溶解磷酸三钙的能力为 82.30 mg·L-1，但不能溶解有机磷，全基因组 GO 数据库对比分析发现菌株 S03 含有磷酸酶合成相关的基因，但却不具备分解有机磷的能力，这可能是由于 PGPR 的基因型和表型之间存在差异[19]。PGPR 提高了土壤中矿质元素的有效性，同时 PGPR 产生的 IAA 促进了植物根系的生长，植物根系更为发达，有利于植物从土壤中汲取营养和水分[20]。本研究盆栽结果显示，施用 S03 菌液显著促进了小油菜根系和地上部分的生长，根长和地上鲜重显著增加，此外，S03 菌株发酵液提高了小油菜植株的全磷含量，降低了土壤有效磷含量，表明施用 S03 菌液使得植物生长和土壤有效磷发生变化，可能是由于 S03 菌株繁殖过程中产生的磷酸酶和有机酸类物质加速了土壤难溶性磷酸盐的溶解，使得土壤中可被植物吸收利用的有效磷增加，从而促进植物的生长[21]。但在本研究中，S03 菌液添加量为 1×108 cfu·mL-1 时，对小油菜种子的萌发有一定的抑制效果，并且抑制了小油菜的生长，这可能是由于高浓度的 S03 菌液产生的 IAA 浓度过高，抑制了小油菜种子的发芽和生长，表明微生物菌剂的施用只有在适合的浓度才能发挥更好的作用[22]。
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热带芽孢杆菌 S03 是近年来报道的新菌株， Liu 等[23]从南海的淤泥中筛选得到 Bacillus tropicus N24T，采用多相分类学方法，将其首次鉴定成热带芽孢杆菌新种。Sucharita 等[24]从垃圾场土壤中筛选出一株可以分解低密度聚乙烯的热带芽孢杆菌，随后，Oladipupo 等[25]从南非德班筛选出一株高效降解五氯酚的热带芽孢杆菌，热带芽孢杆菌展现出其强大的生态修复功能。Shen 等[26]从广西地区的土壤分离得到一株热带芽孢杆菌，首次报道该菌具有耐盐、分泌角蛋白酶、降解羽毛的功能，但没有溶磷、产 IAA 和铁载体等根际促生的特征。目前，将热带芽孢杆菌应用于微生物肥料方面的研究较为少见，本研究确定了热带芽孢杆菌 S03 不仅能产 IAA、铁载体、蛋白酶等多种促生物质，还具备溶解无机磷的能力，能使作物更有效地吸收土壤中的磷元素，促进植物的快速生长，因此该菌株在微生物菌肥开发利用方面具有良好的应用前景。
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4 结论
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本研究筛选得到了一株具有优良促生效果的热带芽孢杆菌 S03，其产 IAA、铁载体、蛋白酶等促生物质，还具有溶解无机磷的作用，提高了农作物对磷等营养物质的吸收能力，促进农作物快速生长。施用 S03 菌液可显著促进小油菜的生长，增加叶绿素和 Vc 含量的积累，提高小油菜的产量和品质，在植物促生和微生物菌肥开发利用方面具有良好的潜力。
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摘要
为了筛选高效植物根际促生菌株，分析菌株促生应用潜力，为微生物肥料的研发提供宝贵的菌种资源。采集了海南省乐东黎族自治县的根际土壤，采用稀释涂布法分离筛选促生菌株，研究其产吲哚乙酸（IAA）、铁载体、蛋白酶、溶磷的能力，通过 16S rRNA 基因系统发育分析和全基因组特征对新分离菌株进行物种鉴定。分离得到一株产多种促生活性物质的菌株 S03，基于 16S rRNA 基因和系统发育树分析结果表明，新分离菌株 S03 与 NR 157736 热带芽孢杆菌（Bacillus tropicus）1A01406 亲缘关系最近，结合全基因测序结果，确定菌株 S03 为 Bacillus tropicus。Bacillus tropicus S03 基因组全长 5.42 Mb，碱基对 G+C 含量为 36.02%，共编码 5666 个基因。通过 GO 数据库对比分析，S03 具备促生物质（IAA、铁载体等）合成相关的基因。Bacillus tropicus S03 的促生潜力良好，IAA 产量为 45.73 mg·L-1，溶解无机磷能力为 82.30 mg·L-1，同时还具备产蛋白酶和铁载体的能力，Bacillus tropicus S03 菌液可以显著促进小油菜的生长，提高产量和品质。Bacillus tropicus S03 可以溶解无机磷，并产生 IAA、铁载体、蛋白酶等促生物质，具有良好的促生应用潜力。
Abstract
This research aimed to screen high-efficiency plant rhizosphere growth-promoting strains，analyze the potential of strains for growth-promoting applications，and provide valuable strain resources for the development of microbial fertilizers. The rhizosphere soil was collected in Ledong Li Autonomous county，Hainan province，and the probiotic strains were isolated and screened by dilution coating method to study their ability to produce indoleacetic acid（IAA），siderophore，protease and phosphorus solubilization，and the new isolates were identified to species by 16S rRNA gene phylogenetic analysis and genome characteristics. A strain S03 producing a variety of pro-life substances was isolated，and the results based on 16S rRNA gene and phylogenetic tree analysis showed that the new isolate S03 was most closely related to NR 157736 Bacillus tropicus 1A01406，and combined with the results of genome-wide analysis，strain S03 was identified as Bacillus tropicus. Strain S03 was 5.42 Mb which was composed of a circular chromosome of 5420614 base pairs without plasmid and with base pairs G+C content of 36.02%，5666 protein-coding sequences. Bacillus tropicus S03 possesses genes related to the synthesis of biomass（IAA，siderophore，etc. ）by comparative analysis of GO database. Bacillus tropicus S03 had good potential to promote growth，with IAA yield of 45.73 mg·L-1 and the solubilization capacity of inorganic phosphorus was 82.30 mg·L-1 ， and it also had the ability to produce protease and iron carriers. Bacillus tropicus S03 bacterial solution could significantly promote the growth of small rapeseed and improve the yield and quality. Bacillus tropicus S03 can dissolve inorganic phosphorus and produce probiotic substances such as IAA，siderophore and proteases，which have good potential for probiotic applications.