兽药残留是指给动物使用药物后蓄积和贮存在细胞、组织和器官内的药物原形、代谢产物和药物杂质，包括兽药在动物性食品中和在生态环境中的残留^[1]。随着我国畜牧业向现代化、集约化和规模化的方向发展，兽用抗生素被大量用作畜禽动物饲料的添加剂和疾病治疗的药物^[2]。研究表明，兽用抗生素无法被畜禽动物完全吸收利用，45%～80% 给药量以兽药残留的形式随动物粪尿排出体外^[3]。畜禽动物粪便因含有丰富的有机质和营养元素而成为有机肥料的主要肥源，当含有兽药残留的有机粪肥被使用后，兽药残留不仅可以渗入到土壤、地表水和地下水中破坏环境系统^[4]，还会被植物根系吸收并在植物体内富集，进而通过食物链间接影响人类的身体健康^[5]。

磺胺甲噻二唑（SMT）是一种常见的磺胺类 （SAs）药物，SAs 是人工合成的具有对氨基苯磺酰胺结构的一类抗菌药物的总称^[6]。SAs 的广抗菌性和价廉易得使其作为兽用抗生素广泛应用于动物饲养和水产养殖^[7]。然而此药物在食品中残留的半衰期长，毒性较强，可引发过敏反应、变态反应、细菌耐药性、致畸及致变作用，甚至诱发癌症^[8]。目前测定有机肥中 SAs 残留的检测方法多为液相色谱-串联质谱（HPLC-MS）法。张玉换等^[9]建立了测定有机肥中 19 种 SAs 的 HPLC-MS 法，19 种 SAs 的检出限均在 6 μg/kg 以下。冷远鹏等^[10]以固相萃取作为快速净化技术，利用 HPLC-MS 实现了对有机肥中 14 种 SAs 的快速测定，方法检出限为 0.013～0.819 μg/kg。近年来多个相关的国家或行业标准相继颁布，进一步证实了该方法的可靠性。 2017 年发布的《有机肥中磺胺类药物含量的测定液相色谱-串联质谱法》（NY/T3167—2017）^[11]，明确规定了使用 HPLC-MS 法测定有机肥中 19 种 SAs 的细节要求。2021 年发布的《有机肥料中 19 种兽药残留量的测定液相色谱串联质谱法》（GB/T40462—2021）^[12]，详细描述了该方法测定包括 14 种 SAs 在内的 19 种兽药残留的操作规范。总的来说，HPLC-MS 法是标准方法规定的、经大量研究认可的测定肥料中 SAs 的首选方法。然而研究普遍仅对检测方法进行了优化，并未评估检测过程中的不确定度。

因此，本研究依据《有机肥料中 19 种兽药残留量的测定液相色谱串联质谱法》（GB/T40462— 2021）^[12]对有机肥料中的残留量进行测定，并参照《化学分析中不确定度的评估指南》（CNAS-GL006：2019）^[13]和《测量不确定度评定与表示》 （JJF1059.1—2012）^[14]对测量不确定度进行分析，以此探究不确定度的主要来源，以期提高后续检测结果的准确性，并为该方法在实际检测过程中的应用提供一定的科学基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂和材料

甲醇：色谱纯，费希尔技术有限公司；甲酸：色谱纯，麦克林生化科技股份有限公司；乙腈：色谱纯，费希尔技术有限公司；乙酸：优级纯，麦克林生化科技股份有限公司；柠檬酸：优级纯，国药集团化学试剂有限公司；磷酸氢二钠：优级纯，国药集团化学试剂有限公司；乙二胺四乙酸二钠（Na₂EDTA）：优级纯，北京化工厂有限责任公司；SMT 标准溶液：质量浓度为 100 μg/mL，阿尔塔科技有限公司；聚苯乙烯-二乙烯基苯（HLB） 固相萃取小柱：Waters Oasis PRiME HLB 60 mg， 3 mL；亲水聚四氟乙烯（PTFE）滤膜：0.22 μm，津腾实验设备有限公司。

1.2 仪器设备

高效液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子源，型号 6410，安捷伦科技（中国）有限公司；pH 计，型号 SevenMulti，梅特勒-托利多仪器（上海） 有限公司；高速离心机，型号 L530，湘仪仪器有限公司；分析天平，型号 Secura224-1CN，德国赛多利斯公司；固相萃取装置，型号 SBEQ-CG1416，德国 CNW Technologies GmbH 公司；漩涡振荡器，型号 SHA-C，常州国华电器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 溶液配制

柠檬酸溶液（0.1 mol/L）：准确称取 21.01 g 柠檬酸，用一级水稀释至 1000 mL；

磷酸氢二钠溶液（0.2 mol/L）：准确称取 71.63 g 磷酸氢二钠，用一级水稀释至 1000 mL；

Mcllvaine 缓冲溶液：1000 mL 柠檬酸溶液（0.1 mol/L）与 625 mL 磷酸氢二钠溶液（0.2 mol/L）混合，必要时用氢氧化钠或盐酸调节 pH 值至 4.00 ± 0.05；

Na₂EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液（0.02 mol/L）：准确称取 60.5 g Na₂EDTA 置于 1625 mL Mcllvaine 缓冲溶液中，溶解后用一级水稀释 5 倍；

乙腈-乙酸溶液：90 mL 乙腈 + 10 mL 乙酸；

甲酸水溶液（0.1%）：准确吸取 1 mL 甲酸，用一级水稀释至 1000 mL；

SMT 标准工作液：用甲醇稀释 SMT 标准溶液，配成质量浓度为 1μg/mL 的标准工作液。

1.3.2 样品前处理

提取：称取制备好的试样 2 g±0.02 g（精确至 0.001 g） 于 50 mL 离心管中，准确加入 5 mL Na₂EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液和 20 mL 乙腈-乙酸溶液，在振荡器上振摇 20 min，在 4000 r/min 转速下离心 10 min，取上清液用于兽药含量的测定。

净化：取 2 mL 上清液过 3 mL 固相萃取小柱，保持约每秒一滴的流速，准确量取 1 mL 流出液后过亲水 PTFE 滤膜（0.22μm），待测。

1.4 仪器测定

1.4.1 液相色谱条件

色谱柱：C18 柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）； 柱温：30℃；流速：0.4 mL/min；进样量：2 μL； 流动相：A 相为甲醇，B 相为甲酸水溶液（0.1%），梯度洗脱条件见表1。

1.4.2 质谱条件

离子源类型：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；喷雾电压：3800 V；离子源温度：350℃；干燥气流速：8 L/min；雾化气压力：35 psi。质谱检测条件见表2。

注：* 定量离子。

1.4.3 标准工作曲线的绘制

取有机肥料空白试样按样品前处理步骤处理，在洗脱液中加入 SMT 标准工作液，配置浓度为 0.010、0.020、0.050、0.100、0.150 和 0.200 μg/mL 的标准曲线工作溶液，用 HPLC-MS 法测定。以定量离子的峰面积为纵坐标，标准溶液质量浓度为横坐标，绘制基质匹配标准曲线。

1.5 测量数学模型

按照 GB/T40462—2021^[12]的测定方法及结果计算，被测物残留量，单位以 mg/kg 表示，按下式计算：

$\omega =\frac{{\rho }^{\mathrm{\text{'}}}\times A\times V}{A_s\times m}$

式中：

ρ′为基质标准工作溶液中被测物的质量浓度，单位为μg/mL；

A 为试样溶液中被测物的色谱峰面积；

A_s 为基质标准工作溶液中被测物的色谱峰面积；

V 为试样溶液最终定容体积，单位为 mL；

m 为样品质量，单位为 g。

1.6 样品测定的不确定度来源分析

根据实验方法和残留量计算模型，HPLC-MS 法测定有机肥料中 SMT 残留量的不确定度来源因果图如图1 所示。

2 不确定度分量的评定

2.1 标准溶液引入的不确定度评定

2.1.1 标准物质纯度引入的不确定度

由标准物质证书可知，SMT 标准溶液纯度为 99.0%，扩展不确定度为 ±5%（k=2），则因纯度引入的不确定度[u_rel（C₁）]为：

$u_{\text{rel}}\left(C_1\right)=\frac{5\mathrm{\%}}{2\times 99.0\mathrm{\%}}=0.0253$

2.1.2 标准工作液的配制引入的不确定度

用移液枪吸取 1 mL 标准溶液至 100 mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度，混匀，即 1 μg/mL 的混合标准工作液。根据《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006）^[15]，配制过程中所使用的移液器取矩形分布，玻璃器皿容量瓶取三角分布，温度变化取矩形分布，不确定度见表3。

如表3，标准工作液配制过程引入的相对不确定度[u_rel（C₂）]为：

$u_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(C_2\right)=\sqrt{u_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}^2\left(V_1\right)+u_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}^2\left(V_2\right)}=0.00756$

2.1.3 标准曲线配制过程引入的相对标准不确定度

使用标准工作液配置标准工作曲线，溶液配置浓度为 0.010、0.020、0.050、0.100 和 0.200 μg/mL。配制过程中使用了 1 mL（4 次）、5 mL（1 次）移液枪头和 10 mL（5 次）容量瓶，不确定度见表4。

按 A 类评定，标准曲线配制过程引入的相对不确定度[u_rel（C₃）]为：

$\begin{array}{c}{u}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(C_3\right)=\sqrt{u_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}^2\left(V_3\right)\times 4+u_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}^2\left(V_4\right)+u_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}^2\left(V_5\right)\times 5}\\ =0.0175\end{array}$

2.1.4 标准曲线拟合引入的相对标准不确定度

测量 5 个校准标准溶液，以峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，采用最小二乘法拟合而成的线性回归方程、测定数据及计算结果见表5。对试样平行测定 6 次，样品中 SMT 的平均质量浓度为：c=19.95μg/mL。

则由最小二乘法引入拟合的标准曲线引入的不确定度[u_rel（C₄）]为：

$u\left(c\right)=\frac{S}{b}\sqrt{\frac{1}{p}+\frac{1}{n}+\frac{(c-\stackrel{-}{c}{)}^2}{S_{cc}}}$

其中：

$\begin{array}{c}S=\sqrt{\frac{\sum _{i=1}^n{\left[A_i-\left(a+b{c}_i\right)\right]}^2}{n-2}}\\ S_{cc}=\sum _{i=1}^n{\left[c_i-\stackrel{-}{c}\right]}^2\\ \stackrel{-}{c}=\sum _{i=1}^n\frac{c_i}{n}\end{array}$

式中：S 为残差标准差；

a 为线性回归方程的截距；

b 为斜率；

p 为对试样溶液的测定次数；

A_i 为标准溶液第 i 个点测定的响应值（峰面积）；

（a+bc_i）为按回归方程计算得出的第 i 个点的响应值，即理论峰面积值；

n 为标准溶液浓度点；

c_i 为标准溶液第 i 个点的质量浓度，单位为μg/mL；

$\stackrel{-}{c}$为样品的平均质量浓度，单位为μg/mL。

按照上述公式计算得$\stackrel{-}{c}=76，S_{cc}=24123，S=108u（c）=0.653，u_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(C_4\right)=\frac{u（c）}{c}=0.0328$

综合标准物质、标准工作液配制、标准曲线配制、标准曲线拟合 4 个分量的不确定度，标准溶液引入的相对不确定度[u_rel（C）]为：

$\begin{array}{c}{u}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(C\right)=\sqrt{u_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}^2\left(C_1\right)+u_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}^2\left(C_2\right)+u_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}^2\left(C_3\right)+u_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}^2\left(C_4\right)}\\ =\sqrt{{0.0253}^2+{0.00756}^2+{0.0175}^2+{0.0328}^2}\\ =0.0455\end{array}$

2.2 样品制备引入的不确定度

2.2.1 样品称量过程引入的不确定度

采用万分之一天平称取 2 g（精确至 0.0001 g） 肥料样品，核查天平检定证书，其扩展不确定度为 ±0.5 mg，k=2，则称量引入的相对不确定度[u_rel （m₁）]为：

$u_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(m_1\right)=\frac{0.0005}{2\times 2.0000}=0.000125$

2.2.2 样品前处理引入的不确定度

样品前处理过程需要准确加入 5 mL Na₂EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液和 20 mL 乙腈-乙酸溶液，在振荡器上振摇 20 min，在 4000 r/min 转速下离心 10 min，取 2 mL 上清液过 3 mL 固相萃取小柱，保持约每秒一滴的流速，准确量取 1 mL 流出液后过亲水 PTFE 滤膜（0.22 μm），待测。此过程引入的不确定度见表6。

由表6可得样品前处理引入的不确定度 [u_rel（V _样）]：

$u_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(V_{\text{样}}\right)=\sqrt{u_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}^2\left(V_6\right)+u_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}^2\left(V_7\right)+u_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}^2\left(V_8\right)\times 2}=0.0115$

综合以上两个分量，样品制备引入的相对不确定度 u_rel（m）为：

$\begin{array}{c}{u}_{\text{rel}}（m）=\sqrt{u_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}^2\left(m_1\right)+u_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}^2\left(V_{\text{样}}\right)}\\ =\sqrt{{0.000125}^2+{0.00115}^2}=0.0115\end{array}$

2.3 测量重复性引入的不确定度

取加标样品重复检测 6 次，计算平均值（$\stackrel{-}{X}$） 及标准偏差[S（X）]如表7 所示。按 A 类评定，则样品重复测量引入的相对标准不确定度[u_rel（rep）] 为：

$u_{\text{rel}}\left(\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{p}\right)=\frac{S\left(X\right)}{\sqrt{6}\stackrel{-}{X}}=\frac{30.54}{\sqrt{6}\times 901.17}=0.0138$

2.4 回收率引入的不确定度

对 6 份平行加标样品溶液进行测定，计算平均添加回收率（$\stackrel{-}{R}$）及回收率标准偏差[S（R）]列于表7，按 A 类评定，则回收率引入的相对标准不确定度[u_rel（R）]为：

$u_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(R\right)=\frac{S\left(R\right)}{\sqrt{6}\stackrel{-}{R}}=\frac{3.35}{\sqrt{6}\times 92.09}=0.0149$

2.5 仪器测定引入的不确定度

根据检测使用的 HPLC-MS 的校准证书，该仪器测定峰面积的重复性为 2.4%，则该仪器测定引入的相对标准不确定度[u_rel（I）]为：

$u_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(I\right)=\frac{2.4\mathrm{\%}}{\sqrt{6}}=0.0139$

2.6 合成相对标准不确定度

根据以上不确定度评定过程，得到各相对标准不确定度分量（表8），按下式计算合成相对标准不确定度 u_rel（X）。

则合成相对标准不确定度为：

$\begin{array}{c}{u}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(X\right)=\sqrt{u_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}^2\left(C\right)+u_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}^2\left(m\right)+u_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}^2\left(rep\right)+u_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}^2\left(R\right)+u_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}^2\left(I\right)}\\ =\sqrt{{0.0455}^2+{0.0115}^2+{0.0138}^2+{0.0149}^2+{0.0139}^2}\\ =0.0530\end{array}$

实验测定 SMT 的残留量为 189.82 mg/kg，则合成标准不确定度[u（X）]为：

$\begin{array}{c}u\left(X\right)=u_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(X\right)\times c=0.0530\times 189.82mg/kg\\ =10.06mg/kg\end{array}$

2.7 扩展不确定度

假设测量有机肥料 SMT 残留量的值分布为正态分布，在 95％置信水平下，包含因子 k 取值 2，扩展不确定度（U）为：

$U=u\left(X\right)\times k=10.06\times 2=20.12\mathrm{m}\mathrm{g}/\mathrm{k}\mathrm{g}$

2.8 测量不确定度报告

肥料样品中 SMT 残留量报告形式，即测定结果表述为：

$X\left(\mathrm{S}\mathrm{M}\mathrm{T}\right)=(189.82\pm 20.12)\mathrm{m}\mathrm{g}/\mathrm{k}\mathrm{g},k=2$

3 结果与分析

根据图2 中各不确定度分量的评定结果，可以看出标准溶液引入的相对标准不确定度最大，其他 4 个不确定度分量引入的不确定度较小。根据 2.1，标准溶液引入的不确定度包括标准物质纯度、标准工作液配制、标准曲线配制和标准曲线拟合 4 个分量，其中影响不确定度的主要因素是标准曲线拟合，其次是标准物质纯度和标准曲线配制，标准工作液配制对不确定度的影响最小。

针对上述影响不确定度的 3 个主要因素，可通过控制以下几个环节减小不确定度，完善该方法的质量控制体系。第一，标准曲线拟合过程中应根据待测样品含量和仪器检测性能，配制合适梯度浓度的标准溶液来拟合工作曲线；第二，使用纯度更高的标准物质；第三，标准曲线配制过程中尽可能减少逐级稀释过程，严格规范实验人员的操作。

4 结论

本文依据《有机肥料中 19 种兽药残留量的测定液相色谱串联质谱法》（GB/T40462—2021）对使用 HPLC-MS 法测定有机肥料中 SMT 残留量引入的不确定度进行评定，待测肥料样品中 SMT 残留量以其扩展不确定度的形式表示为（189.82±20.12） mg/kg，（k=2）。从评定结果可知影响不确定度的主要因素是标准曲线拟合，其次是标准物质纯度和标准曲线配制，后续实验过程中可通过选择合适梯度浓度的标准溶液来拟合工作曲线、使用纯度更高的标准物质、减少逐级稀释过程等减小不确定度，进一步提高检测结果的可靠性和准确性。该评定方法可为使用 HPLC-MS 法测定有机肥料中 SMT 残留量及结果判定提供参考。

参考文献