茶树是我国促进农村经济发展、解决“三农” 问题的重要经济作物之一，2021 年全国茶园总面积 326.4 万 hm^2[1]。叶用植物茶树需肥量大，茶园化肥过量施用、养分比例失调、施肥方式不合理等现象比较突出，导致土壤酸化、土壤肥力下降、土壤微生物菌群失衡等问题，有碍我国茶产业可持续发展^[2-3]。

土壤微生物以细菌、古菌和真菌为主，是土壤有机质和养分转化、循环的动力，具有分泌抗生素、分泌激素、拮抗病原物和促进植物生长等作用，但也含有一些不利于植物生长的微生物，其群落结构组成和生物量等可以反映土壤质量及肥力状况^[4-6]。相对于 16S rDNA、18S rDNA、rDNA ITS（Internal transcribed spacer，内转录间隔区）等扩增子测序技术存在覆盖微生物物种有限等缺陷，基于 DNA 的宏基因组测序技术无需分离培养微生物，可快速有效地获得整个微生物群落的基因信息，更加深入地研究微生物的群落结构、物种分类、基因功能等^[7-8]。利用该技术，马龙等^[9]研究发现，菜地有机肥替代部分化肥提高了土壤细菌和真菌丰度，降低了古菌丰度，改变了优势菌群组成。褐土玉米种植土壤长期配施有机无机肥，改变了细菌多样性及其优势菌门^[10]。在茶园中，一些研究分别利用 Biolog 微平板法^[11]、扩增子测序技术^[12]、磷脂脂肪酸方法^[13-14]分析了土壤微生物群落结构，发现有机无机肥配施能不同程度提高土壤微生物整体活性和丰富度。控释肥具有养分释放速率缓慢、释放期较长、利用率高等优点，茶园减施增效效果好^[15]。微生物有机肥含有有益微生物，施用该肥可调节樱桃园土壤中微生物群落组成，改善土壤健康^[16]。目前，对茶园微生物有机肥配施控释复合肥后土壤微生物群落结构季节性变化的影响还未明晰。为此，本研究利用宏基因组测序技术，以习惯施肥为对照，探究茶园微生物有机肥配施控释复合肥对土壤微生物群落组成和结构的季节性影响，旨在为充分利用微生物资源、提高茶树养分利用率等提供一定科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

2019 年 10 月至 2020 年 5 月，于贵州省思南县晨曦生态农业专业合作社茶园（海拔 970 m， 28°1′50″N，108°9′1″E）开展田间试验，茶树品种为 10 龄无性系‘福鼎大白茶’。

1.2 试验设计

本试验共设置 2 个处理，①习惯施肥（CF）：基肥（ 普通复合肥 1500 kg·hm^-2）+ 追肥（ 春茶催芽肥尿素 225 kg·hm^-2+ 夏茶追肥尿素 300 kg·hm^-2）+ 撒施，②微生物有机肥配施控释复合肥（MC）：基肥（微生物有机肥 1500 kg·hm^-2+ 控释复合肥 600 kg·hm^-2）+ 追肥（春茶催芽肥尿素 225 kg·hm^-2+ 夏茶追肥尿素 300 kg·hm^-2）+ 沟施。相较于 CF，MC 处理化肥减施量为 46.0%。基肥、春茶催芽肥、夏茶追肥分别于 2019 年 11 月 15 日、2020 年 3 月 2 日、2020 年 5 月 16 日实施。小区面积 333.5 m²，3 次重复，随机区组排列。在茶园施基肥前试验地土壤肥力见表1。

供试肥料：普通复合肥（N∶P₂O₅ ∶K₂O=15∶15∶ 15）、微生物有机肥（ 有机质 ≥ 60%，腐植酸 ≥ 20%，有效活菌数≥ 0.40×10⁸ ·g^-1，总养分含量 ≥ 5%，N∶P₂O₅∶K₂O=2∶1∶1）、控释复合肥 （N∶P₂O₅∶K₂O=22∶8∶12）、尿素（N 46.4%）。

1.3 样品采集

分别于 2019 年 11 月 14 日（CF1、MC1）、2020 年 3 月 1 日（C F2、MC2）、2020 年 5 月 15 日 （CF3、MC3）在施肥前取土样 3 次，采用“S”形五点采样法取 0～20 cm 土层的土壤样品。土样混合后采用四分法，取保留的土样过直径 2 mm 网筛去除杂质，装入 50 mL 无菌离心管，干冰保存运回实验室，置于-80℃冰箱保存备用。

1.4 土壤微生物群落宏基因组测定

采用 E.Z.N.A. ^® Soil DNA Kit（Omega Bio-tek， GA，USA）试剂盒，按照说明提取土壤总 DNA。利用 1% 琼脂糖凝胶电泳分析 DNA 的纯度和完整性，使用 Qubit ^® dsDNA 试剂盒（Life Technologies， CA，USA）精确定量 DNA 浓度。合格的 DNA 样品（OD260/280 为 1.8～2.0，DNA 总量 >1μg）利用 NEBNext® Ultra^TM DNA Library Prep Kit for Illumina（New England Biolabs，MA，USA）试剂盒构建双末端（Paired-end，PE）文库，采用 Agilent 2100 （Agilent Technologies，CA，USA）对文库的插入片段大小进行检测，使用 qPCR 方法对文库的有效浓度进行准确定量（有效浓度 >3 nmol·L^-1）。库检合格后，利用 Illumina HiSeq PE150（Illumina，CA， USA）平台进行宏基因组测序。

1.5 宏基因数据组组装、基因预测、基因相对丰度计算

使用 Readfq（V8.0） 去除原始数据中长度小于 50 bp、平均碱基质量值低于 20、含 N 碱基 >10 bp 以及与 Adapter 之间 Overlap 超过 15 bp 的 reads。经预处理后得到的有效数据（Clean data）使用 Megahit（V1.04）进行组装分析，将得到的 Scaffold 片段在 N 连接处打断，得到不含 N 的 Scaftig 片段，然后采用 SOAPdenovo（V2.04）进行组装，筛选出大于 500 bp 的 Scaftigs。采用 MetaGene Mark（V2.10）对筛选出的 Scaftigs 进行开放阅读框 （ORF）预测，过滤掉长度小于 100 nt 的片段。所得结果经 CD-HIT（V4.5.8）去冗余后，获得非冗余基因集，采用 Bowtie（V2.2.4），分别将每个样品的Clean data 与构建的非冗余基因集（Unigenes）进行比对，统计基因在对应样品中的丰度信息。

1.6 物种注释

使用 Diamond（V0.9.9.110）将 Unigenes 与数据库中抽提出的细菌（Bacteria）、古菌（Archaea）、真菌（Fungi）和病毒（Virus）序列进行比对，其后将最小期望的结果运用最近公共祖先（LCA）算法进行物种注释、确定物种信息，而获得各个样品在各个分类层级（界门纲目科属种）上的丰度信息和基因数目信息。

1.7 统计分析

利用 SPSS 20.0 对相关试验数据进行 Pearson 相关性分析、最小显著性差异法（LSD）多重比较分析。相关系数 0.7<|r| <1 表示高度相关，0.4<|r| <0.7 表示中度相关，0.05<|r| <0.4 表示低度相关，|r| <0.05 表示无直线相关性^[19]。

2 结果与分析

2.1 测序质量评估

如表2 所示，6 个样本共获得 311211956 条高质量 reads，平均每个样本 51868661 条，GC 含量为 60.27%～62.16%，Q30 大于 92%，平均 Scaftig N50 为 815 bp，ORF 为 328362～531864 条，表明文库的测序质量较好。

2.2 各处理基因丰度及其相关性

6个处理共获得 363552 个 Unigenes，共享 296597 个 Unigenes（图1A）。CF1 与 MC1 的 Unigene 数接近，CF2、CF3 的特有 Unigene 数分别较 MC2、 MC3 多约 3.3、4.5 倍。Unigenes 在 CF 和 MC 中均呈先增加后降低的趋势（图1B），MC2、MC3 的 Unigene 数分别明显少于 CF2、CF3。

主成分分析结果表明，MC1 和 CF1 聚为一类，其他处理各为一类（图2）。相关性与主成分分析结果一致（表3），MC1 和 CF1 的基因丰度模式高度相似，而 CF1、CF2 的基因丰度分别与 MC2、 MC3 低度相关，表明土壤微生物基因丰度与施肥方式高度相关。CF1、CF2、CF3 之间的基因丰度低度相关；MC1 的基因丰度与 MC2、MC3 低度相关， MC2、MC3 之间的基因丰度中度相关，表明土壤微生物基因丰度存在季节性。

2.3 不同季节不同施肥方式下茶园土壤微生物组成

如图3 所示，CF、MC 的土壤微生物组成主要为细菌（88%～89%）、古菌（0.8%～2.0%）、真菌（0.02%～0.10%），其他微生物（病毒、原生动物和显微藻类）占比为 9.98%～11.18%。冬季至夏季，古菌数量逐渐增加，真菌数量先增加后降低。CF2、CF3 的古菌数量分别高于 MC2、MC3，而真菌数量分别低于 MC2、MC3。在细菌域中鉴定出 135 个门、1835 个属、11434 个种；在古菌域中检测到 15 个门、109 个属、507 个种；在真菌域中共有 7 个门、116 个属、137 个种。

如表4 所示，CF1 与 MC1 的土壤微生物丰度无显著差异。CF2、CF3 的细菌、真菌丰度分别显著低于 MC2、MC3，而古菌丰度则相反，表明相较于习惯施肥，微生物有机肥配施控释复合肥处理可增加土壤细菌、真菌丰度，降低土壤古菌丰度。 MC1、MC2、MC3 的细菌、古菌、真菌丰度存在显著差异；CF1、CF2、CF3 的细菌、古菌丰度存在显著差异，CF1、CF3 真菌丰度接近，表明土壤微生物丰度变化存在季节性。

注：对角线两侧为相关系数；* 和 ** 分别表示在 P<0.05 和 0.01 水平上显著相关。

2.4 不同季节不同施肥方式下茶园土壤微生物群落结构

对各处理的土壤细菌、古菌和真菌相对丰度在门水平上进行分类，将相对丰度大于 1% 的微生物称为优势菌群^[20]。细菌优势门共有 11 个，CF1、CF2、 CF3、MC1、MC2、MC3 分别有 8、8、7、8、9、9 个 （图4A）。以酸杆菌门（28.1%～39.3%）、变形菌门 （26.2%～35.3%）相对丰度最大，其次是放线菌门 （4.1%～8.3%）、芽单胞菌门（5.2%～7.4%）、绿弯菌门（5.0%～6.3%）、念珠菌门（0.9%～5.3%）、拟杆菌门（0.7%～2.2%）、硝化螺旋菌门（0.5%～2.3%）、疣微菌门（0.7%～1.4%）、浮霉菌门（0.5%～1.2%）、装甲菌门（0.3%～1.1%）。

注：同行不同小写字母表示差异显著（P<0.05），字母相同表示差异不显著。

如图4A 所示，相较于 CF2、CF3，MC2、MC3 提高了变形菌门、放线菌门、芽单胞菌门、绿弯菌门、拟杆菌门、硝化螺旋菌门、装甲菌门相对丰度，增幅分别为 15.4%～29.6%、16.7%～25.0%、1.1%～40.0%、 20%、42.9%～100.0%、95.6%～100.0%、 111.1%～233.3%；降低了酸杆菌门、疣微菌门、浮霉菌门相对丰度，降幅分别为 16.2%～28.3%、 10.0%～22.2%、16.7%～28.6%；CF2 的念珠菌门相对丰度低于 MC2（200%），CF3 念珠菌门的相对丰度高于 MC3（20%）。冬季至夏季，CF 的酸杆菌门相对丰度呈增加趋势，而 MC 呈降低趋势；CF 的变形菌门、芽单胞菌门、绿弯菌门、拟杆菌门的相对丰度呈降低趋势，MC 呈增加趋势；CF、MC 的念珠菌门、硝化螺旋菌门、装甲菌门相对丰度呈增加趋势，而放线菌门、疣微菌门、浮霉菌门相对丰度呈降低趋势；CF 的绿弯菌门相对丰度稳定，而 MC 呈增加趋势。

CF 和 MC 的古菌优势门均有 3 个，分别为奇古菌门、广古菌门、泉古菌门（图4B）。奇古菌门相对丰度最大，为 75.4%～85.1%，其次为广古菌门（3.1%～8.4%）、泉古菌门（2.3%～5.2%）、深古菌门（0.5%～0.9%）。如图4B 所示，相较于 CF2、CF3，MC2、MC3 提高了奇古菌门相对丰度，增幅为 6.1%～16.7%；降低了广古菌门、泉古菌门、深古菌门相对丰度，降幅分别为 33.3%～40.1%、2.3%～60.4%、25.6%～37.5%。冬季至夏季，CF 的奇古菌门相对丰度先增加后降低，而 MC 呈增加趋势；CF 和 MC 的广古菌门、深古菌门相对丰度均呈降低趋势；CF 的泉古菌门相对丰度先降低后增加，而 MC 呈降低趋势。

CF 和 MC 的真菌优势门均有 5 个，分别为毛霉门、子囊菌门、担子菌门、壶菌门、捕虫霉门（图4C）。毛霉门相对丰度最大，为 27.3%～72.6%，其次为子囊菌门（9.3%～32.7%）、担子菌门 （5.1%～22.4%）、壶菌门（2.4%～5.3%）、捕虫霉门 （0.6%～15.1%）、隐真菌门（0.1%～0.6%）。如图4C 所示，相较于 CF2、CF3，MC2、MC3 提高了毛霉门、捕虫霉门、隐真菌门相对丰度，增幅分别为 5.8%～41.9%、16.1%～16.7%、150.3%～400.1%；降低了担子菌门相对丰度（1.2%～30.4%）； MC2 的子囊菌门、壶菌门相对丰度分别较 CF2 提高了 11.1%、50.3%，而 MC3 的子囊菌门、壶菌门相对丰度分别较 CF3 降低了 46.9%、60.4%。冬季至夏季，CF 和 MC 的毛霉门相对丰度先增加后降低；CF 的子囊菌门、担子菌门、壶菌门相对丰度先降低后增加，而 MC 呈降低趋势；捕虫霉门、隐真菌门相对丰度均呈降低趋势。

当 Bray-curtis 距离为 0.03 时，6 个处理分为 5 类，CF1 和 MC1 聚为同类，其他各具一类（图4D），再次表明茶园土壤微生物群落组成和结构存在季节性、施肥方式性变化。

3 讨论

3.1 不同施肥模式对茶园土壤微生物数量与丰度的季节性影响

冬季至春季，本研究的土壤微生物群落组成和结构呈现一定的季节性变化规律。研究表明，不同季节土壤微生物类群数量均是细菌最多^[21]。蔡艳等^[22]2009 年研究发现，蒙顶山茶园土壤细菌数量约占微生物总量的 90%，略高于本研究结果（88%～89%）。本研究中细菌数量冬、春、夏季变幅不显著，可能是细菌数量占比高，具体原因还有待进一步研究。土壤温度变化是微生物群落季节变化的主要驱动力，降水的季节性变化也会对土壤微生物群落数量、结构产生较大影响^[23]。李巍等^[24] 研究表明，武夷山茶园氨氧化微生物相对丰度随季节变化显著。春、夏季番茄土壤微生物数量略高于秋、冬季，细菌、真菌数量分别在夏季、春季最高^[25]。少数研究表明，土壤古菌数量与土壤温度呈正相关^[26-27]。这些结果部分揭示了本研究的古菌数量逐渐增加、真菌数量春季高于冬、夏季的原因。季节变化影响茶园土壤微生物的机制尚未系统研究，环境因子对微生物数量和群落结构的影响有待进一步明确。

本研究中，相较于单一撒施化肥的习惯施肥方式（CF），微生物有机肥配施控释复合肥（MC） 方式替代部分化肥、适当减少施氮量，增加有益微生物，改善茶园土壤微生物群落组成和结构，效果更好。在本研究中，MC2 处理的细菌数量为 89%，高于 CF 处理（88%），与林斯等^[28]、毛迎新等^[29] 研究结果一致，茶园有机肥配施复合肥提高了土壤细菌数量和丰度。韩文炎等^[30]、向芬等^[31]研究表明，茶园适当减少氮用量可以增加土壤中细菌菌落丰度，与这些研究结果类似，本研究的 MC 处理化肥减施量 48%、氮减施量 44%^[15]，控释肥的氮素释放速率缓慢、释放期较长、利用率高，增加了土壤细菌丰度。赵晓楠等^[12]、季凌飞等^[32]、王峰等^[33]研究表明，有机肥配施化肥可增加茶园土壤真菌数量和丰度，与本研究 MC 处理的结果一致。相对于习惯撒施肥料，沟施可提高肥料利用率、改善土壤理化性质，进而改善土壤微生物群落组成和结构。土壤古菌曾被冠以嗜极端环境的特征，耐胁迫能力强，相较于土壤细菌和真菌，古菌研究还非常有限^[34-35]。马龙等^[9]研究表明，相对于单施化肥，有机肥与化肥配施降低了土壤古菌丰度，可能是由于细菌和真菌对养分的竞争能力强于古菌。此外，茶园习惯施肥土壤易板结、酸化，而沟施微生物有机肥、控释肥、追肥，可改善茶园土壤生境、降低非生物胁迫，因而可能降低了土壤古菌丰度。

3.2 不同施肥模式对茶园土壤微生物群落结构的积极性影响

不同施肥方式的土壤微生物在门分类水平的类群相似，但优势门类群的相对丰度及变化趋势存在差异。酸杆菌一般具有嗜酸、寡营养等特点，土壤中酸杆菌相对丰度与土壤 pH 呈显著负相关^[36-37]。冬季至夏季，本研究 CF 的酸杆菌门相对丰度呈增加趋势，而 MC 呈降低趋势。究其原因，可能是 MC 的有机肥部分替代化肥可防治土壤酸化，提高 pH 值，从而降低了酸杆菌门的相对丰度。研究发现，莲雾根际土壤装甲菌门群落结构与 pH 呈正相关^[38]，这与本研究 MC2、MC3 装甲菌门相对丰度分别高于 CF2、CF3 的结果类似。已有研究表明，土壤放线菌门属富营养菌群，但在营养丰富的土壤中竞争能力较弱^[39]。相较于 CF2、CF3，MC2、 MC3 提高了放线菌门相对丰度，可能是 MC2、MC3 的营养更丰富。

奇古菌门包括氨氧化古菌和其他氨氧化古菌群 （Group 1.1c 和 Group 1.3），在土壤含水量和有机质含量较高的土壤中存在更多的 Group 1.1c 和 Group 1.3^[40]。增施有机肥、减施化肥可增加氨氧化古菌数量和丰度^[41]。相较于 CF，本研究的 MC 提高了土壤含水率、有机质含量，增加了茶园土壤奇古菌门相对丰度，与这些研究结果类似。土壤毛霉亚门属腐体营养型，随着倒木腐烂程度增加，土壤毛霉门丰度呈增加趋势^[42]，与本研究结果类似，相较于 CF2、CF3，MC2、MC3 分别提高了毛霉门相对丰度 5.8%、41.9%。不同施肥模式对其他菌门影响的研究报道不多，其影响机制有待进一步明确。

4 结论

季节性的温度和降雨量变化显著影响了茶园土壤环境，不同的施肥方式导致茶园土壤结构、含水量、pH 值、化肥含量、有机质含量有一定差异，而显著影响微生物群落组成和结构。本研究结果表明，冬季至夏季，CF 和 MC 的细菌、古菌、真菌分别占微生物总数的 88%～89%、0.8%～2.0%、 0.02%～0.10%；古菌数量逐渐增加，真菌数量先增加后降低；CF2、CF3 的古菌数量分别高于 MC2、 MC3，而真菌数量相反；CF2、CF3 的细菌、真菌丰度分别显著低于 MC2、MC3，古菌丰度则相反。总体上，CF 和 MC 优势细菌门、优势古菌门、优势真菌门相对丰度的季节性变化趋势存在一定差异。这些结果表明，茶园土壤微生物群落组成和结构存在一定的季节性、施肥方式性变化规律。微生物有机肥配施控释复合肥可以提高土壤细菌丰度、真菌数量和丰度，降低古菌数量和丰度，改变土壤优势菌群的组成。

参考文献