目前，连作障碍成为了大多数药用植物面临的重要难题。研究指出，70% 以根茎类入药的中药材在种植过程中均存在严重的连作障碍问题^[1]，如当归^[2]、三七^[3]和西洋参^[4]等。连作障碍会导致栽培药用植物生长发育欠佳、病虫害严重，药材产量与品质下降等，严重制约中药资源的可持续发展。造成连作障碍的原因主要归于 3 点：土壤养分失衡、微生物群落结构失衡、化感自毒作用^[5]。其中，微生物群落组成及多样性一直是揭示植物—微生物互作关系机制的热点问题，土壤微生物参与物质循环过程，微生物群落结构的变化会直接影响土壤健康与肥力状况，而土壤养分是土壤微生物生存的物质基础，土壤微生物量与速效养分含量之间具有一定相关性^[6]，微生物群落组成通常受土壤养分的有效性调节^[7-8]。药用植物与根际土壤微生物之间有着复杂的相互作用关系，在植物根际微环境中，一方面有益微生物对维持、促进植株健康生长具有重要作用^[9]，另一方面其根际微生物菌群的组成也会受到根系分泌物的影响^[10]。加之，根际微生物因植物种类、土壤类型、生长阶段与年限等的不同而存在较大差异。因此，立足植物根际—微生物互作关系，挖掘药用植物连作障碍发生原因，并基于此探究药用植物根际微生态的改善，以及防治和缓解连作障碍的发生等问题仍需深入研究。

川党参（Codonopsis tangshen Oliv.） 为桔梗科党参属植物，是《中华人民共和国药典》收载的党参药材基源植物之一，其干燥根具有补中益气、健脾益肺、养血生津之功效^[11]。2020 年党参纳入开展按照传统既是食品又是中药材的物质管理试点工作的品种之一，加之随着川党参产量、知名度的提升，不断销往国内外各地，其市场需求逐年增长。但近年来，随着种植规模不断扩大，重茬种植已成为各大产区的生产常态^[12]，不合理轮作或连作导致川党参病害严重、品质产量下降，严重制约其可持续发展。因此，目前制约党参生产的主要原因便是连作障碍^[13-14]。关于党参连作障碍以及自毒作用虽已有相关研究报道^[15-17]，但鲜见不同年限川党参根际土壤微生物的变化研究，对土壤细菌群落组成结构变化与川党参生长年限的关系仍不清楚。鉴于此，本研究从药用植物-土壤-微生物的互作关系入手，利用 Illumina Miseq 高通量测序技术，对不同种植年限川党参根际土壤细菌群落结构和多样性进行研究，并揭示根际细菌群落、土壤速效养分之间的关系，为缓解川党参种植的连作障碍提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况与样品采集

试验设于重庆市奉节县长安土家族乡党参种植基地，海拔 1890 m，年均气温 9.3℃，年均降水量 1320.5 mm，该基地土壤类型为石骨子土，前茬撂荒 2 年，此为第一次种植川党参，种植 4 年方可采收，田间管理同大田常规管理。供试土样选取 5 个采样点，于 2022 年 9 月上旬采收期采集川党参生长 1 年（1Y）、2 年（2Y）、3 年（3Y） 和 4 年 （4Y）的根际土壤。以不同种植年限区域为采样中心，每个样地采集 5 个点，每个采样点选取生长健康、长势一致的川党参 10 株，采用抖落法^[18]收集根际土壤，经除去杂质、混合均匀后四分法分成两份，一份装入灭菌的离心管并放入干冰盒，及时送至上海派森诺生物科技股份有限公司进行检测，分析不同生长年限间根际土壤微生物的群落结构组成和多样性；另一份带回实验室自然风干，用于土壤理化性质测定。

1.2 土壤速效养分测定

测定风干土先过 1 mm 筛。土壤水解氮（HN）采用碱性水解扩散法测定，有效磷（AP）采用紫外分光光度法测定，速效钾（AK）采用火焰光度法测定^[19]。

1.3 土壤 DNA 提取和高通量测序

采用 OMEGA 试剂盒 E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit 提取样品 DNA，采用 Nanodrop 对 DNA 进行定量，并通过 1.2% 琼脂凝胶电泳检测 DNA 提取质量。使用 338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′） 和 806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）对 16S rRNA 基因 V3～V4 可变区进行 PCR 扩增，将扩增产物在 Illumina Miseq 平台上进行高通量测序，以上均由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。

1.4 数据处理与分析

将高通量测序所得数据进行去燥、聚类等，对所得优化序列进行分析。对 97% 相似水平的 OTU 进行聚类和生物信息统计分析（QIIME2 和 R 语言）；采用 Mothur 计算 Alpha 多样性指数，通过 R 语言及 Vegan 软件包作韦恩图、主坐标分析及组间差异分析等。采用 SPSS 20.0 进行多重比较和相关性分析。

2 结果与分析

2.1 细菌测序结果和群落丰富度及多样性

检测共得到 1939357 条优化序列。按照 97% 相似性进行 OTU 聚类得到 21259 个 OTU。其中 1Y 根际土壤注释到 28 门、80 纲、167 目、275 科、377 属、7560 个 OTU，2Y 根际土壤注释到 27 门、76 纲、163 目、270 科、366 属、9926 个 OTU，3Y 根际土壤注释到 27 门、79 纲、168 目、283 科、385 属、10430 个 OTU，4Y 根际土壤注释到 26 门、75 纲、162 目、257 科、334 属、6624 个 OUT（表1）。

细菌群落 α 多样性指数分析如表2 所示，不同生长年限川党参根际土壤细菌群落的 Coverage 指数均 >0.98，说明所测样本的真实情况能够得到充分展示。其中，Chaol 指数显示 3Y>2Y>1Y>4Y， Observed 指数显示 3Y>2Y>1Y>4Y，表明随着生长年限的增加，川党参根际土壤细菌群落丰富度呈先增加后降低趋势。Shannon 指数显示显示 3Y>4Y>2Y>1Y，Simpson 指数 3Y>4Y>2Y>1Y，表明随着川党参生长年限的增加，其土壤中物种均匀度和多样性呈先增加后逐渐降低趋势。

2.2 细菌群落物种组成

对所得 OTU 的代表序列进行物种注释后，绘制各组样品在门水平上相对丰度前 20 位的物种图 （图1）。其中，变形菌门（Proteobacteria）（37.93%～55.83%）丰度最高，其次是未分类细菌门（unclassified_Bacteria）（6.15%～13.55%）、酸杆菌门（Acidobacteria）（7.02%～11.48%）、放线菌门（Actinobacteria）（7.68%～9.72%）、拟杆菌门（Bacteroidetes） （5.19%～8.35%）和绿弯菌门（Chloroflexi）（1.79%～10.78%），均为土壤中的优势菌门，相对丰度均大于 5%，占获得总细菌序列量的 85.71%～91.39%。

注：同列不同小写字母表示各生长年限间有统计学差异（P<0.05）。

对比不同生长年限间细菌门水平相对丰度关系发现，上述 6 种优势细菌中的变形菌门、酸杆菌门、绿弯菌门和未分类细菌门在各生长年限间差异显著，放线菌门和拟杆菌门差异不显著。其中，变形菌门相对丰度随着生长年限的增加先降低后逐渐增大，在 1Y 根际土壤中最高，显著高于 2Y 和 4Y；未分类细菌门相对丰度随生长年限的增加逐渐增大，其在 1Y 根际土壤中的丰度占比显著低于其他生长年限；酸杆菌门丰度占比随生长年限的增加先降低后逐渐增加至最大，在 4Y 根际土壤中的占比显著高于 2Y；绿弯菌门丰度占比随生长年限的增加在 2Y 时增至最大，后逐渐降低，其在 2Y 根际土壤中的丰度占比显著高于 1Y。放线菌门与拟杆菌门丰度占比均随生长年限的增加而先增加后逐渐降低，且各处理间差异显著。

在不同生长年限中检测到相对丰度较低 （1%～5%）的细菌门有巴氏杆菌门（Patescibacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、厚壁菌门（Firmicutes）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、WPS2。其中巴氏杆菌门丰度占比与生长年限不成规律性变化，但在 2Y 根际土壤中的丰度占比显著高于其他年限；疣微菌门与芽单胞菌门的丰度占比均随生长年限增加而先降低后逐渐增大，各年限间无显著性差异；厚壁菌门与 WPS-2 丰度占比均随生长年限增加而先增大后降低，WPS-2 在 2Y 根际土壤中丰度占比显著高于 1Y。

在属分类水平，除未被分类的细菌属，不同生长年限川党参根际土壤细菌相对丰度排序前 20 位的细菌属分布见图2，不同生长年限细菌优势属有所差异，相对丰度排名前 5 位的细菌属中，全噬菌属（Holophaga）、念珠菌属（Candidatus Udaeobacter）为 4 组样本共有的优势属，且其相对丰度随着生长年限的增加呈先减少后增加的趋势，均在 3Y 根际土壤中丰度占比最低；根瘤菌属（Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium）为 1Y、 3Y 与 4Y 共有的优势属，Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia 为 3Y、4Y 共有的优势属；类芽孢杆菌属（Paenibacillus）为 1Y、3Y 共有的优势属；芽单胞菌属（Gemmatimonas）为 1Y、2Y 共有的优势属；bacterium Ellin6519 为 2Y、4Y 共有的优势属；革兰氏阴性菌 cTPY-13（Gram-negative bacterium cTPY-13）为 2Y 独有优势属。此外，4Y 独有 8 个细菌属。

以 OTU 为分类单元作 Venn 图（图3），结果显示 4 组有 854 个共有 OTU，1Y 根际土壤与 2Y 根际土壤有 400 个共有 OTU，1Y 根际土壤与 3Y 根际土壤有 631 个共有 OTU，1Y 根际土壤与 4Y 根际土壤有 264 个共有 OTU，2Y 根际土壤与 3Y 根际土壤有 541 个共有 OTU，2Y 根际土壤与 4Y 根际土壤有 319 个共有 OTU，3Y 根际土壤与 4Y 根际土壤有 1019 个共有 OTU。1Y 根际土壤独有 4504 个 OTU，2Y 根际土壤独有 6807 个 OTU，3Y 根际土壤独有 5959 个 OTU， 4Y 根际土壤独有 2970 个 OTU。结果表明，不同生长年限的川党参根际土壤中细菌群落组成极为丰富，但在不同的分类水平上仍是少数物种占据优势地位，且各优势菌群在各组样本中的分布具有明显差异。

2.3 细菌群落生长年限组间差异

为进一步观察不同样本间细菌群落的相似度与差异性，采用 weighted-unifrac 算法对样本进行PCoA 分析、UPGMA 聚类分析（ 图4）。PCoA 分析结果显示，不同生长年限细菌群落的相对分散程度不同，但相对而言均较为集中，3 组的重复数据距离并不远，说明重复性较好，组内差异较小； 同时，1Y、2Y 与其余年限的样本亦可以很好的分开，说明组间差异显著。UPGMA 聚类分析结果显示，4 个不同生长年限土壤大致可以分成以下 3 类：3Y 和 4Y 可归为一类，1Y 和 2Y 分别为一类；表明 3Y 和 4Y 根际土壤中细菌群落组成的相似度最高，2Y 与其他年份的细菌群落组成相似度最低，而 1Y 介于二者之间。由此可见，川党参根际土壤细菌群落随其生长年限的变化而发生明显改变，尤以 2 年生时演变较为剧烈，而到 3 年生、4 年生时趋于相同； 表明生长年限是川党参根际土壤细菌群落变化的主要影响因素，不同年限间细菌群落结构差异先增大后逐渐减小。

2.4 不同生长年限川党参根际土壤细菌优势菌群与速效养分的相关性分析

将川党参根际土壤中相对丰度排名前 11 位的细菌门类与土壤速效养分进行相关性分析，结果如表3 所示。由表3 可以看出，土壤速效养分与根际土壤不同微生物具有不同程度的相关性。变形菌门、放线菌门与土壤各速效养分间没有显著的相关性（P>0.05）。绿弯菌门、未分类细菌门与 HN 呈显著负相关（P<0.05），WPS-2 与 HN 呈极显著负相关（P<0.01）。酸杆菌门、芽单胞菌门与 AP 呈显著负相关（P<0.05），拟杆菌门、厚壁菌门与 AP 呈显著正相关（P<0.05）。酸杆菌门与 AK 呈显著负相关（P<0.05），拟杆菌门、巴氏杆菌门、疣微菌门与 AK 呈显著正相关（P<0.05）。此外，土壤速效养分与细菌 Alpha 多样性指数的相关性也不同， HN、AK 与 Chaol 指数呈显著正相关（P<0.05）， AK 与 Shannon 指数呈显著正相关（P<0.05），Chaol 指数和 Shannon 指数与 AP 相关性未达显著水平 （P>0.05）。

注：*、** 分别表示显著（P<0.05）、极显著（P<0.01）相关。

从表3 还可以看出，HN、AP 和 AK 对不同年限川党参根际土壤优势细菌门均有一定程度的影响作用，其程度大小为 HN>AP>AK。受这 3 种速效养分影响较大的细菌为拟杆菌门、酸杆菌门、巴氏杆菌门、WPS-2 及芽单胞菌门。HN、AP、AK 均对厚壁菌门具有正向作用，对芽单胞菌门具有负向作用。

3 讨论

3.1 川党参根际土壤细菌群落特征

土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，植物根际土壤微生物群落的多样性及动态平衡是保证植物健康发育的主要因素^[20]，可敏感地反映植物生长、繁殖及其代谢活动的变化；同时，土壤生物之间存在着相互制约又彼此依赖的关系，也与周围的环境因子相互作用、往复调控^[21]。因此，研究根际土壤微生物多样性的变化有利于揭示植物的生长发育规律，对植物尤其是药用植物的栽培生产具有十分重要的意义。目前，大量研究已证实，同一植物在同一土壤中生长多年（或连作）会造成明显的连作障碍，可导致土壤结构改变、土壤微生物群落多样性降低、有益微生物量逐渐减少等，存在潜在的土壤肥力衰退趋势。土壤细菌作为土壤微生物中最重要的活性组分，其数量和多样性被认为是评价土壤生态功能的重要指标^[22]。

本文研究了不同生长年限川党参根际土壤微生物多样性的变化规律，发现不同生长年限川党参根际土壤中细菌群落组成及结构存在差异，OTU 数、Chaol 指数及 Shannon 指数均在 3 年生时最高 （表1、表2），说明 2～3 年是川党参根际土壤微生物群落多样性发生重大变化的关键时期，川党参生长 3 年时土壤中细菌的物种总数、菌群丰富度及复杂程度最高，即随着生长年限的增加，川党参根际土壤细菌群落的多样性呈先升高后逐渐降低趋势。该发现与三七的研究结果相一致，Dong 等^[23]研究发现，连作三七土壤中细菌 Chaol 指数与 Shannon 指数均随连作年限的延长而整体呈先增加后降低的趋势，说明随着植物生长，短期内土壤细菌多样性会增加，而长期连作则将降低土壤细菌多样性。不同种植年限宁夏枸杞根际微生物研究中发现，其根际土壤细菌的 Shannon 指数在种植 5 年时达最高，后随着生长年限的增加而逐渐降低，在种植 15 年时显著降低，种植 24 年时达最低^[24]。贝母相关研究也发现，甘肃贝母根际土壤细菌群落 OTU 数、谱系多样性（PD）值、多样性指数均在生长 5 年时最低，说明生长年限越长，土壤细菌的多样性越低^[25]；太白贝母根际土壤细菌多样性随着生长年限延长而整体呈递减趋势，土壤微生物区系由高肥力的“细菌型”向低肥力的“真菌型”过渡^[26]。同时，本研究还发现，土壤细菌 Alpha 多样性指数与土壤水解氮和速效钾呈显著正相关（P<0.05），说明土壤速效养分的降低会导致土壤细菌多样性降低。相关研究证实，轮作条件下细菌多样性指数的增加，一方面是由于作为微生物外源植物残体种类及数量的增加，另一方面，土壤养分尤其是速效养分含量的升高也是其主要因素之一^[25，27]。因此，在田间管理中，随着川党参生长年限的延长，需根据其生长状况适时、适量增施氮肥和钾肥，并配合施用有机肥，以保证川党参根际土壤微生物与土壤养分的平衡。

尽管不同生长年限间川党参根际土壤细菌群落结构存在一定差异，但其主要优势菌群较稳定，均以变形菌门丰度最高，其次是酸杆菌门、放线菌门、拟杆菌门和绿弯菌门（图1），说明川党参根际土壤微生物群落具有土壤微生物优势菌群组成的共性，只是不同年限优势菌群的占比存在差异。这与当归^[28]、甘肃贝母^[25]和西洋参^[29]生长时期和年限对细菌群落结构影响的研究结果一致。或许意味着以上几种菌门能够适应各种植物物种的根际环境，亦或暗示着植物对根际微生物结构组成上具有某种特定选择。虽然川党参根际土壤微生物组成在门水平上比较稳定统一，但在属水平上并未保持这种结构稳定；只有全噬菌属和念珠菌属是 4 个年限所共有的优势菌属，革兰氏阴性菌 cTPY-13 则为 2 年生独有优势菌属，其余则分别为不同年限有相应共有优势菌属（图2）。加之，即使根际土壤微生物细菌群落结构组成稳定，但在不同生长年限，细菌在门和属水平上也具有明显的相对丰度波动，或许此类相对丰度剧烈变化的微生物正与川党参的生长发育过程有着密切联系。随着生长年限的增加，根际土壤微生物菌群间存在着某些横向联系，或者微环境特化程度越高，对微生物的选择性和富集性越强^[18]；由此可推测，川党参种植多年后根际土壤细菌群落多样性的改变将引起优势菌群比例的下降，破坏其根际土壤微生物菌群平衡，从而导致其连作障碍的发生。

3.2 川党参根际细菌群落与土壤速效养分的关联性

在作物连续种植土壤中，土壤理化因子不仅可以体现土壤的健康状况，而且能够影响土壤微生物种群数量、组成与分布。相关研究发现，土壤理化因子与土壤微生物群落具有显著相关性，土壤环境因子的改变会直接影响土壤中微生物的群落结构^[30]。本研究中表3 结果显示，变形菌门、放线菌门与土壤速效养分间相关性不显著，这应该是与每一特定性的菌类具有不同的功能特性有关，如放线菌门是自养型细菌，它并不依赖于土壤养分而生存；而变形菌门是一类适应性很强的细菌，其既包含动植物的病原菌，同时也存在抑制致病菌的有益菌。酸杆菌门与有效磷、速效钾呈显著负相关，这与相关研究^[31-32]结果“酸杆菌门喜欢低营养组环境”相一致；而拟杆菌门则与二者呈显著正相关，拟杆菌门是有机碳的主要矿化者，可增加有机碳含量，并为其他微生物和土壤酶活性提供能量。绿弯菌门与水解氮呈显著负相关，与胡启良等^[33]的研究中碱解氮、硝态氮、铵态氮与绿弯菌门群落的相对丰度呈负相关相一致，追施氮还会使土壤中绿弯菌门的相对丰度降低^[34]。有效磷与厚壁菌门呈显著正相关（P<0.05），这与武睿等^[25]的结果有所差异，甘肃贝母根际土壤中有效磷与厚壁菌门呈显著负相关性，或许与不同植物的根系分泌物、次生代谢产物不同有关，此猜想可作进一步的研究验证。张英等^[35]的研究结果表明，土壤 pH、有效磷、铵态氮是影响土壤微生物群落结构的主要环境因子，对华重楼根际土壤微生物群落的研究中发现，对细菌群落组成起主要作用的是速效钾和全氮^[21]；本研究表明，土壤水解氮、有效磷和速效钾是影响川党参根际细菌群落的主要因子，这与前人研究结果既存在差异，但也有相同之处，表明不同植物土壤细菌因生境、植物种类等不同，主要影响因素也存在差异。

4 结论

本研究从分子生物学角度，采用 Illumina MiSeq 高通量测序技术进行研究，初步揭示了不同生长年限川党参根际土壤细菌群落多样性的变化规律，即细菌群落 Alpha 多样性随生长年限的延长而先升高后降低，在 3 年生时达最高；且不同年限间细菌群落结构的差异也先增大后逐渐减小；生长年限显著影响着川党参根际土壤细菌群落多样性和组成，但各生长年限中的优势菌门相对稳定，均为变形菌门、酸杆菌门、放线菌门、拟杆菌门和绿弯菌门。土壤速效养分的变化会显著影响川党参根际细菌群落结构，其中影响程度大小为水解氮 >有效磷 >速效钾，优势菌门中酸杆菌门与有效磷、速效钾呈显著负相关（P<0.05），拟杆菌门与有效磷、速效钾呈显著正相关（P<0.05），而绿弯菌门与水解氮呈显著负相关（P<0.05）。研究结果为进一步探索川党参生长发育与微生物的关系奠定了基础，也为今后进一步研究川党参有效成分积累与根际微生物环境的关系，探讨川党参病虫害发生机制及其防治、缓解措施提供了科学依据，有助于促进川党参的可持续利用和产业发展。

参考文献