多环芳烃（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs） 由两个及以上苯环构成^[1]，是土壤中最常见的典型持久性有机污染物^[2]，具有致癌、致畸、致突变的“三致效应”，对人体危害较大，被美国环境保护局确定为环境中优先检测的污染物^[3]。蒽作为其具有代表性的有毒的污染物，结构稳定，难以降解^[4]，其结构单元同时也存在于致癌性苯并〔a〕 芘（Ba〔a〕P） 和苯并〔a〕 蒽（Ba〔a〕A） 中，故也经常被当作降解 PAHs 的模型化合物^[5]，同时蒽也是检测 PAHs 污染的指示物^[6]。传统 PAHs 污染土壤修复技术如淋洗法、热处理法等，成本高且易造成二次污染，应用有一定的局限性^[7]。生物修复法降解效率高、无二次污染、可原位处理^[8]，是未来大范围污染处理的理想方式。现阶段对 PAHs 污染的生物修复的研究主要涉及降解功能菌株的筛选^[9]及降解特性的分析^[10]、降解功能基因挖掘^[11]、降解途径及机理解析^[12]、降解过程代谢中间产物分析^[13]，以及人工强化的生物降解调控技术^[14]等方面，其中通过人工驯化从环境中分离出修复性能优异的微生物，强化降解污染物菌株的定殖技术和调控技术是生物修复的主流。目前已报道的降解菌有 200 多种，以细菌为主，如放线菌门的脱醌菌属（Demequina）^[4]、蓝细菌门的蓝细菌属（Cyanobacteria）、黄杆菌门的黄杆菌属（Flavobacterium）^[6]、厚壁菌门的芽孢杆菌属（Bacillus）^[15] 中均有 PAHs 降解菌分布。

目前生物修复法在 PAHs 污染土壤修复的实际应用上较少，尤其是对蒽污染土壤生物降解的成功案例鲜有报道，主要是由于实验室中筛选或改造的高效降解菌降解效率受环境条件限制严重^[16]，仅在其较适宜的环境条件下有较高的 PAHs 降解速率，施入土壤后受到环境温度、湿度、土著微生物竞争等影响，难以发挥出应有的降解效率，甚至难以在污染土壤中定殖。因此，本研究旨在从土壤中分离筛选可以高效降解蒽并可耐受多种 PAHs 的降解菌，评价其降解效果和在污染土中的定殖能力，并通过多组学结合分析的方式研究降解菌的蒽降解通路，初步解析其降解特性，为 PAHs 污染土壤的生物修复法提供可利用的微生物资源以及理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品与试剂

用于分离筛选蒽降解菌的土样采自北京郊区不同工厂的 6 个不同点位。验证降解菌在污染土壤中定殖效果的土样取自北京郊区的菜园。

萘、菲、蒽、芘标准品，纯度为 99%，购自上海麦克林生化科技股份有限公司。

裂解液（g/L）：20 mmol/L Tris 2.42，25 mmol/L NaCl1.46，2.5 mmol/L EDTA 0.73，0.05% SDS 0.5， 5% Chelex-100 2.5，灭菌备用。

1.2 培养基

无机盐培养基^[17]（g/L）：KH₂PO₄ 0.5，Na₂HPO₄· 12H₂O 1.0，NH₄Cl 1.1，MgSO₄·7H₂O 0.2。微量元素溶液 2 mL，琼脂 18-20，pH=7.3。

微量元素溶液（g/L）：EDTA 0.5，ZnS0₄·7H₂O 0.22，CaCl₂ 0.005，MnCl₂·4H₂O 0.051，FeSO₄· 7H₂O 0.0199，（NH₄）₆Mo₂O₂₄·4H₂O 0.11，CuS0₄· 5H₂O 0.0157，CoCl₂·6H₂O 0.161，琼脂 18-20，pH=6.0，灭菌备用。

选择培养基^[18]：将 PAHs 溶于丙酮溶液，过尼龙滤膜除菌，按照浓度计算所需体积加入锥形瓶中，待丙酮挥发完全，加入灭菌后的无机盐培养基。

肉汤培养基（g/L）：蛋白胨 10.0，牛肉膏 3.0， NaCl 0.5，琼脂 18-20，pH=7.0～7.2。

LB 培养基^[19]（g/L）：胰蛋白胨 10.0，酵母浸粉 5.0，氯化钠 10.0，琼脂 18-20，pH=7.2。

R2A 培养基（g/L）：海博 R2A 液体培养基 3.2，琼脂 18-20。

蒽-肉汤培养基：向肉汤培养基中加入 0.5 mg/L 的蒽，蒽的添加方式与选择培养基相同。

蒽-葡萄糖培养基：向无机盐培养基中加入 0.5 mg/L 蒽和 0.1 g/L 葡萄糖，蒽的添加方式与选择培养基相同。

1.3 降解菌的分离筛选

1.3.1 土样驯化

称取 10 g 新鲜土样加入 50 mL 无机盐液体培养基，180 r/min 培养，10 d 后取 10 mL 培养液加入含 50 mg/L 萘、菲、蒽、芘混合 PAHs 的选择培养基中 180 r/min 培养 10 d^[18]。重复上述操作逐步提高 PAHs 浓度到 100、200 和 400 mg/L。

1.3.2 降解菌的分离

取不同浓度驯化培养基的上清液，稀释涂布于含 50 mg/L 萘、菲、蒽、芘混合 PAHs 的选择培养基平皿，28℃倒置培养 7 d，挑长势较好的单菌落分别在 R2A 和肉汤平板上划线培养，纯化 2～3 次，分离出具有 PAHs 降解潜力的菌株单菌落。取纯化后的菌落在 5 mL 肉汤培养基或者 R2A 液体培养基中培养过夜。

1.3.3 降解菌的筛选

初筛时将得到的菌液按不同的土样、驯化浓度、纯化时的培养基进行分组。按分组混合菌液，将 1 mL 菌液加入 9 mL 含 50 mg/L 蒽的选择培养基中培养 4 d，定量测定样品中蒽的含量，计算得混合菌样的蒽降解率。复筛通过测定初筛中降解率较高的分组中每种单一菌株的降解率，筛选出降解率最高的一株蒽降解菌。测定时，将全部 10 mL 样品按体积比 1∶1 加入乙酸乙酯进行萃取，原 pH 值萃取两次，酸性（pH=2）萃取两次，收集上层有机相加入 5 g 无水硫酸钠除水，使用玻璃纤维滤纸过滤除去硫酸钠。60℃氮吹 40 min 至全部乙酸乙酯挥发干净，加 3 mL 甲醇重溶，过 22 μm 尼龙滤膜后取 1.5～2 mL 于液相用小棕瓶备用。采用高效液相色谱法定量测定蒽的含量^[20]，使用 ODS 色谱柱，柱温 40℃，上样量为 20 μL，流动相甲醇∶水 =80∶20，流速 1 mL/min 线性洗脱，在 254 nm 处进行紫外检测，此条件下蒽的出峰时间为 13.5～14.5 min，根据峰面积和标准曲线计算样品中蒽的含量。

1.4 最优培养基选择

选取肉汤培养基、LB 培养基和 R2A 培养基等常用细菌培养基，测定降解菌在不同培养基中培养 12 h 的 600 nm 处的吸光度，采用平板计数法，测定降解菌在 OD₆₀₀ 值最高的培养基中的菌落数，以获得最优培养基。

1.5 降解菌的多相分类学鉴定

1.5.1 形态学特征鉴定

在肉汤培养基梯度稀释涂布，28℃培养 72 h，在体式显微镜下观察降解菌菌落形态；挑取单菌落，在光学显微镜下使用 100 倍油镜观察革兰氏染色结果。

1.5.2 分子生物学鉴定

采用裂解法提取降解菌 DNA^[21]，取 2 μL为模板，加双蒸水（9.5 μL）、Premix（12.5 μL）、引物 1（0.5 μL）、引物 2（0.5 μL），至总体积为 25 μL，进行 PCR 扩增。上述引物分别选用 16S rRNA 序列通用引物 27F：5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和 1492R：5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′，以及 gyrB 扩增引物 F：5′-ATTTGGCGCTGGCGGTTAT-3′ 和 R：5′-GGTTTCGGCTGGGCTGGTA-3′。扩增片段测序后在 NCBI 数据库进行 blast 比对，并使用 MEGA11 通过邻接法（Neighbor-Joining method）对比对结果建树分析^[22]。

基因组框架图由上海生工公司进行测定，并由此得到基因组进化树。使用 EZBiocloud 计算降解菌与基因组进化树得到的同属菌的 ANI 值，在 Type Strain Genome Server 上得到 DDH、dDDH 以及 G+C 含量差^[23]。

1.6 降解菌在污染土壤中定殖能力的测定

取未污染的菜园土壤风干研磨后，过 1 mm 筛，将土铺平土层厚度在 1.5 cm 左右。在通风橱内喷洒蒽-丙酮溶液，并不断翻动保证喷洒均匀，静置 12 d 后，取样测试蒽浓度，为 0.25 mg/kg。将污染土样分为 4 份，喷洒降解菌液并不断翻动混匀，使土壤中降解菌含量为 0、10⁶、10⁷ 和 10⁸ cfu/kg。每组 5 个平行，每 2 d 称量土样重量，喷洒相应重量的蒸馏水保持土样含水量为 25% 左右。取第 0 d 和第 5 d 的土样，使用凯杰 DNeasy PowerSoil Pro Kit 试剂盒提取土壤总 DNA。由北京百迈客生物科技有限公司对土样中微生物群落进行绝对定量测定，评价降解菌在污染土壤中的定殖能力。

1.7 降解菌的组学分析

降解菌基因组完成图、转录组以及代谢组由美吉生物公司进行测定。基因组 DNA 纯度经 NanoDrop2500 仪器测定后，使用 Illumina Hiseq 和 PacBio 两种方式结合完成基因组测序，并结合 NR、Swiss-Prot、Pfam、EggNOG、GO 和 KEGG 六大数据库完成基因注释。转录组在对提取的 RNA 浓度、纯度及完整性检测后进行反转录，并通过 Illumina Hiseq 平台完成测序，经上述六大数据库进行基因注释后，比较不同组样本之间的基因表达差异，完成分析。代谢组学通过液相色谱-质谱联用（LC-MS） 完成，对不同组样本间进行非靶标的代谢物测定，通过 KEGG 数据库完成对其中代谢通路的分析。

样品处理前，连续测定几天降解菌的降解效率，降解效率计算公式为 W_n=[（C_n-1-C_n）/C_n]× 100%，其中 C_n 为第 n 天培养基中蒽的含量，C_n-1 为第 n-1 天培养基中蒽的含量，C₀=0.5 mg/L，确定降解效率最高的一天。分别使用蒽浓度为 0、0.5、 5 mg/L 的蒽-无机盐培养基培养降解菌，在降解效率最高的一天，取菌体液氮冷冻后，-80℃保存后送测其转录组；吸取 1 mL 菌体与发酵液的混合液，冷冻干燥后-80℃保存送测其代谢组。

2 结果与分析

2.1 蒽降解菌的分离筛选

使用 PAHs 对 6 个土样的梯度驯化后，共分离纯化出 185 个具有蒽降解潜力的 PAHs 耐受菌株，经 16S rRNA 测序分析对其中 172 个菌株进行了初步的分类鉴定，经统计结果包括假单胞属（Pseudomonas）、不动杆菌属（Acinetobacter）、无色杆菌属（Achromobacter）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、诺卡氏菌属（Nocardia）等 36 个不同属，具体结果见表1，其中假单胞属的菌株最多，共 75 株。

选取初筛中降解效率最高的两组 R2003 与 R4004 进行复筛，结果见图1，最终保留蒽降解效果最好的菌株 R4004-2，该菌株属于假单胞属。

注：不同小写字母表示不同菌株间差异显著（P<0.05）

2.2 降解菌的多相分类学鉴定

2.2.1 形态学鉴定

降解菌 R400-2 在平板上菌落直径在 0.25 cm 左右，呈光滑、半透明状，随着培养时间的增长，菌落表面出现皱褶，边缘不规则，革兰氏染色结果为阴性。

2.2.2 降解菌分子生物学分类鉴定

2.2.2.1 16S rRNA 与看家基因分析

16S rRNA 进化树和 gyrB 进化树分别如图2 和图3 所示，降解菌 R4004-2 均与施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）模式菌株聚类到同一分支，初步确定降解菌 R4004-2为施氏假单胞菌。

2.2.2.2 基因组分析

为进一步确定 R4004-2 菌种，测定了菌株的全基因组草图，将其基因组序列与假单胞属中不同种的模式菌株进行比对，结果与目标菌株相似度最高的为 Pseudomonas stutzeri strain ATCC 17588^T （图4）。

2.2.2.3 ANI 和 DDH 分析

使用线上工具计算R4004-2 与其基因组相似度最高的 12 株假单胞菌属的模式菌株的 ANI 值，结果如图5 所示。图中颜色越红说明其 ANI 值越高，其中与 R4004-2 相似度最高的为 Pseudomonas stutzeri strain ATCC 17588^T，二者 ANI 值为 97% 且大于阈值。同时二者 DDH=72.00%， dDDH=72.5%，超过了阈值，G+C 含量相差小于 3%。

综合菌落形态与分子生物学分类鉴定，最终可以确定降解菌 R4004-2 为施氏假单胞菌。

2.3 降解菌施氏假单胞菌 R4004-2 定殖能力验证

为验证降解菌施氏假单胞菌 R4004-2 在污染土壤中的定殖能力，人工配制蒽污染土样，加入菌液使得土壤中施氏假单胞菌 R4004-2 的终浓度为 0、 10⁶、10⁷、10⁸ cfu/kg，28℃培养 5 d，分别测定不同天数以及加入了不同浓度菌液的土样中的微生物绝对含量。结果如图6 所示，与 CK 相比，加入的菌液浓度越高，土壤中施氏假单胞菌含量越高，表明施氏假单胞菌 R4004-2 可以在蒽污染土样中定殖，具有实际修复污染土壤的潜力。

注：大写字母为第 0 d 时不同土样中施氏假单胞菌含量的显著性标识 （P<0.05）；小写字母为第 5 d 时不同土样中施氏假单胞菌含量的显著性标识（P<0.05）；* 为同组土样在第 0 d 和第 5 d 时施氏假单胞菌含量的显著性标识；ns 表示 P>0.1，** 表示 P<0.05，*** 表示 P<0.01。

2.4 降解特性分析

2.4.1 降解菌最优培养基选择

选择 LB 培养基、肉汤培养基和 R2A 培养基，测定菌株 R4004-2 生长状况，结果表明，R4004-2 在肉汤培养基中培养 12 h 时 OD600 最高，通过稀释涂布法计数得其浓度为 10⁹ cfu/mL。

2.4.2 降解效率测定

通过连续测定多天的降解效率可知，降解菌 R4004-2 在第 3 d 的降解效率最高（图7），达到了 48.86%，此时培养基中 80.5% 的蒽已完成了降解，第 4 d 开始降解效率骤降，第 5 d 培养基中蒽含量与第 4 d 仅相差 0.004 mg/L，后续几天蒽含量几乎不变，最终降解率在 82.3% 左右。由此可以确定，R4004-2 在第 3 d 对于蒽的代谢活动最为活跃，因此，选择第 3 d 测定 R4004-2 降解特性。

注：不同小写字母表示不同天数间差异显著（P<0.05）。

2.4.3 培养基成分对蒽降解效率的影响

测定施氏假单胞菌 R4004-2 在培养基成分不同的条件下的蒽降解率（测定方法与菌株筛选时相同，详见 1.3.3），结果见图8。施氏假单胞菌 R4004-2 在蒽-肉汤培养基中的蒽降解率下降至 23.04%，远低于在无机盐培养基中的蒽降解率；在蒽-葡萄糖培养基中蒽的降解率下降至 50.65%，也低于在无机盐培养基中的蒽降解率。

2.4.4 降解通路的组学分析

2.4.4.1 基因组完成图分析

基于组装完成的 R4004-2 基因组圈图（ 图9） 可知，R4004-2 内不含质粒，由一个环形染色体构成，其基因组全长为 4666542 bp，平均 G+C 含量为 63.56%，编码基因 4309 个； 预计 tRNA 总数为 60 个，rRNA 总数为 12 个。其中包括编码乙醇脱氢酶的基因：adh（K0001）、adhp （K13953）、frmA（K00121）、ADH5（K00121）、adhC （K00121）等，乙醇脱氢酶与萘代谢（ko00626）、细胞色素 CP450（ko00980）^[24]、氯烷烃代谢（ko00625）、芳香族化合物代谢（ko01220）等相关^[13]。

2.4.4.2 原核转录组学分析

将含不同浓度蒽的无机盐培养基分为 CK、Low、High 3 组，其中 CK 组蒽含量为 0，Low 组蒽含量为 0.5 mg/L，High 组蒽含量为 5 mg/L。降解菌施氏假单胞菌 R4004-2 在 3 组培养基中培养到第 3 d，得到不同组别的基因表达差异结果如图10 所示，与 CK 组相比，Low 组有 3 个基因的表达显著提高，2 个基因的表达显著下降；High 组有 21 个基因的表达显著提高，3 个基因的表达显著下降；High 组与 Low 组相比有 15 个基因表达显著提高。

进一步对比不同组分中基因表达的差异，发现编码双加氧酶的基因表达量随着培养基中蒽含量的增加而提高。在蒽含量为 0 的培养基中双加氧酶的表达量为 CK 的 43.33 倍；在蒽含量为 0.5 mg/L 的培养基中双加氧酶的表达量为 CK 的 641.17 倍；在蒽含量为 5 mg/L 的培养基中双加氧酶的表达量为 CK 的 2626.67 倍，详见图11。由此可知，双加氧酶的表达量与施氏假单胞菌 R4004-2 对蒽的降解活性呈正相关，参与了蒽降解反应。

2.4.4.3 代谢组学分析

对施氏假单胞菌 R4004-2 代谢组学进行分析，在含有蒽的培养基中生长的菌内总共有 16 种通路显著上调，与代谢相关的通路上调最多，其中脂质代谢、异质生物质代谢以及次级代谢产物合成相关代谢通路占比最多，详见图12，8 条与异质生物质代谢相关的通路显著上调，这与施氏假单胞菌 R4004-2 对蒽的降解相关。

注：不同小写字母表示不同组间差异显著（P<0.05）。

从显著上调的代谢通路中筛选差异性代谢产物，其中 1-羟基-2-萘甲酸酯、羟基蒽醌^[25]、 1，2-萘醌是与蒽代谢相关的产物^[26]，其含量随培养基中蒽含量的增加而增多。CK 组 1-羟基-2-萘甲酸酯相对含量为 5.00，Low 组相对含量为 6.91， High 组相对含量为 7.39；CK 组羟基蒽醌相对含量为 2.84，Low 组相对含量为 4.15，High 组相对含量为 4.55；CK 组 1，2-萘醌相对含量为 3.33，Low 组相对含量为 4.24，High 组相对含量为 4.46，详见图13。该结果表明，上述 3 种物质随着施氏假单胞菌 R4004-2 对蒽的降解而不断积累，但同时其积累量并未与蒽的含量呈线性关系，这表明这 3 种物质会继续降解，是施氏假单胞菌 R4004-2 降解蒽的中间代谢产物，而非死段产物。蒽代谢通路中关键中间产物的邻苯二甲酸酯类物质^[8]也有检出。

注：* 为同一代谢产物不同组间显著性标识，ns 表示 P>0.1，* 表示 0.05<P<0.1，*** 表示 P<0.01。

3 讨论

3.1 高浓度 PAHs 耐受菌株的分离鉴定

PAHs 污染已随地下水和地表径流向农用土壤蔓延，为修复已污染的土壤，高效、低成本、无二次污染的生物修复法是目前研究的重点。蒽作为典型的 PAHs，经常被当作降解 PAHs 的模型化合物^[5]，是很好的研究对象。目前已有许多可降解蒽的微生物被分离出，已报道的大约有 200 多种，以细菌为主，例如蓝细菌门的蓝细菌属、拟杆菌门的黄杆菌属、厚壁菌门的芽孢杆菌属中均有 PAHs 降解菌分布。例如中度嗜盐菌 Martelella sp．AD-3 可在 0.1%～10% 的盐度下降解蒽^[27]；向可降解蒽的真菌烟曲霉 A10 的培养基中加入一定量的营养盐或共代谢底物乳糖均可提高其降解效率^[28]。本研究从驯化后的工厂土壤中分离出的 185 株可耐受高浓度 PAHs 的菌株，经鉴定分别属于假单胞属、不动杆菌属、无色杆菌属、鞘氨醇单胞菌属、诺卡氏菌属等 36 个不同属，与文献报道的假单胞属、鞘氨醇单胞菌属、诺卡氏菌属中菌株有蒽降解功能的结论一致^{[6，16，29-30]}。

3.2 施氏假单胞菌 R4004-2 对蒽的降解能力

研究发现，施氏假单胞菌 R4004-2 在以蒽为唯一碳源的培养基中可生长，且能够降解蒽，而在营养物质更丰富的蒽-肉汤培养基以及蒽-葡萄糖培养基中菌株 R4004-2 对蒽的降解率下降，与于瑶瑶等^[4]的研究结果一致，这可能是由于葡萄糖作为快速碳源，被降解菌的生长代谢优先利用，降低了蒽对降解酶的诱导。此外，在实际应用中，降解菌在土壤中有效定殖是发挥其降解功能的关键。本研究中在对降解菌施氏假单胞菌 R4004-2 进行污染土壤修复验证时发现，该菌可以在蒽污染土壤中有效定殖，具备实际降解应用潜力。由于土壤中碳源种类丰富，提供的碳源等被微生物优先利用，从而导致降解菌未能优先利用蒽。目前可通过构成复合菌系、加入共代谢底物等方式来提高降解菌的降解效率，提升其实际修复污染土壤的潜力，例如李凤梅等^[31]发现，将可产生表面活性剂的菌株 B2 与其他降解菌共同加入污染土壤，可提高 PAHs 的生物利用率，提高降解效率；Rahman 等^[32] 比较了单一降解菌和复合菌系去除土壤有机污染物的效率，单一降解菌 20 d 后降解效率为 20%，复合菌系的降解效率则提高至 78%；冯清敏等^[33]分离出的芘降解菌株 M4 和 N1 在以原油为共代谢基质时，芘降解效果被强化，未加入原油时菌株 M4 和 N1 的 30 d 芘降解率分别为 42.1% 和 41.2%，加入原油后分别提升至 62.5% 和 76.0%。以上研究为土壤中蒽的生物修复提供了思路。

3.3 施氏假单胞菌 R4004-2 对蒽的降解通路推理

结合基因组、转录组与代谢组对 R4004-2 降解机理进行剖析，可以确定 R4004-2 中包含与蒽代谢相关的酶有双加氧酶；相关基因包括 adh、 adhp、frmA、ADH5 和 adhC^[11] 等； 相关代谢产物有 1-羟基-2-萘甲酸酯、羟基蒽醌、1，2-萘醌、邻苯二甲酸酯类物质等。综合上述结果进行推测，R4004-2 可能从两条通路同时进行蒽的降解 （图14），第一条通路为蒽在双加氧酶的作用下进行第一步氧化生成蒽-9，10-二氢二醇，其反应与唐婷婷等^[26]总结的 M．vanbaalenii PYR-1 对菲的降解的第一步类似，接着逐步转化为蒽醌（KEGG： map00624）；目前在细菌对蒽的降解通路中通常认为蒽醌为死端产物，例如 Pathak 等^[34]的研究中假单胞菌酶促反应产生了死段产物 9，10-蒽醌，但在本研究中检测到了羟基蒽醌以及邻苯二甲酸酯的存在，由此推断这里的蒽醌可能与某些真菌对蒽醌的降解方式相同，该途径类似于 Ye 等^[25]的研究中烟曲霉降解蒽时蒽醌会转化为邻苯二甲酸酐进行后续降解，蒽醌经取代反应形成羟基蒽醌后逐步氧化形成邻苯二甲酸酯类物质，后通过邻苯二甲酸途径降解，羟基蒽醌也可以通过非酶促反应分解^[25，35]。第二条通路为双加氧酶催化蒽生成 1，2-蒽二酚，逐步反应生成 3-羟基-2-萘甲酸，3-羟基-2-萘甲酸可继续反应最终通过苯甲酸途径降解（KEGG：map00624），或在异构酶的作用下转变为 1-羟基-2-萘甲酸，1-羟基-2-萘甲酸及其酯类物质可以通过水杨酸途径或者邻苯二甲酸途径降解，与马静^[36]总结的细菌降解菲的途径相同， 1-羟基-2-萘甲酸酯也可能脱氢氧化为 1，2-萘醌 （KEGG：map00980）。

由于蒽的 9、10 位的 C 活性更高，因此，在 R4004-2 降解蒽时更可能产生蒽醌，造成醌类物质的积累，也可能是由于其他通路的降解速率更高，醌类物质代谢较慢，故造成积累，具体原因有待进一步研究确定。为提高实际应用效果，降低醌类物质污染风险，后续可以考虑将 R4004-2 与可降解醌类物质的菌构成复合菌系，以实现更高效的蒽降解功能。

注：实线箭头为已被研究证明过的过程，虚线箭头为推测可能会进行的过程，加粗字体为本研究通过代谢组学确定在 R4004-2 蒽降解通路中存在的物质。

4 结论

从北京郊区工厂土壤中分离出的 185 个 PAHs 耐受菌株中筛选出一株蒽降解效率最高的菌株 R4004-2。经形态学及分子生物学等多相分类学鉴定，蒽降解菌 R4004-2 为施氏假单胞菌。

降解菌施氏假单胞菌 R4004-2 在肉汤培养基中生长更好，且在降解的第 3 d 降解活动最为活跃，第 5 d 完成降解，最终的降解效率约为 83%。经过验证，施氏假单胞菌 R4004-2 可在蒽污染的土壤中定殖，具有实际应用的潜质。

通过对基因组、转录组以及代谢组的耦合关联分析，推测降解菌施氏假单胞菌 R4004-2 可能的降解通路为：蒽在双氧化酶的作用下氧化，从两个方向进行降解，一部分反应生成蒽醌，进一步氧化成羟基蒽醌，逐步反应生成邻苯二甲酸酯，通过邻苯二甲酸途径完成降解；另一部分反应经蒽二酚生成 3-羟基-2-萘甲酸酯，通过苯甲酸途径降解，3-羟基-2-萘甲酸酯也会在异构酶的催化下生成 1-羟基-2-萘甲酸酯，进入萘降解途径生成萘醌等物质最终完成降解。

参考文献