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中药黄芩为唇形科黄芩 Scutellaria baicalensis Georgi 的干燥根，始载于《神农本草经》，为我国传统大宗药材，主要分布在中国东北、华北、西北等地区[1]。黄芩具有清热燥湿、解毒、止血、安胎等功效，在中医临床上用于治疗咳嗽、感冒、发热等多种疾病[2]，近年来，黄芩在 2 型糖尿病和新型冠状病毒肺炎治疗中的作用也受到重视[3-4]。随着振兴中医药事业战略的逐步实施，中医药产业迎来了发展的黄金时期[5]，对黄芩等中药材的需求量不断增加。以往有关黄芩的研究主要集中在化学成分、药理作用、质量和临床应用等方面[6]。然而由于不同产地的环境因子如气候、土壤养分等条件不同，黄芩质量的差异很大，只有对黄芩的种植进行科学管理，获得高质量的黄芩，才能提升其应用效果，提高经济效益。其中，施肥是提高黄芩生产力的重要措施之一，施用化肥可以补充黄芩生长所需要的养分，提高其产量和质量[7]，但是化肥的不合理施用会导致土壤出现板结和环境污染等问题[8]，而有机肥配施化肥能有效缓解单施化肥所引起的这些问题[9]，其中，生物有机肥由于添加了微生物进行腐熟处理，兼有传统有机肥和微生物肥料的优点，在促进植物生长、改善土壤理化性质和植物根际微生物生态等方面具有重要作用[10-11]，是一种可持续农业生产的措施。而从现有的研究成果看，目前对于黄芩栽培过程中土壤环境的施肥效应，特别是黄芩根际微生物群落结构的研究仍处于初级阶段。因此，探寻科学合理的施肥技术体系和施肥模式，促进人工栽培黄芩增产提质具有重要意义。
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土壤微生物是生态系统中最为活跃的组分，与土壤相互作用形成动态系统，不仅在养分循环、有机质形成与降解中具有重要作用[12]，由于其群落数量、结构和多样性易受到环境因素影响，还是衡量土壤质量和土壤生态功能的重要指标[13]。根际微生物的丰度和群落结构的变化会直接影响作物对营养物质的吸收和植物抗逆性[14]。关于化肥和有机肥对土壤微生物影响的研究已有大量报道，长期定位试验研究结果表明，单施化肥会导致土壤酸化、微生物多样性降低[15]。而有机肥不仅可以在一定程度上缓解土壤酸化，提高作物产量[16]，还能增加土壤微生物生物量及其多样性[17-18]。目前，关于不同处理对黄芩根际土壤微生物群落结构及其多样性影响的报道还较少。因此，本研究从微生物的角度出发，探究不同施肥方式对黄芩根际土壤微生物群落组成和结构的影响，有助于认识黄芩根际土壤微生物菌落功能调节，以期为黄芩的合理施肥和提高土壤微生物多样性提供理论依据。
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1 材料与方法
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1.1 试验区概况
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试验田位于河北省唐山市丰润区王官营镇 （118°27′ E，39°90′ N），该地属暖温带大陆性季风气候，年平均气温 10.8℃，年平均降水量 710.0 mm。供试土壤类型为褐土，pH 7.46，碱解氮 27.4 mg/kg、有效磷 20.6 mg/kg、速效钾 148.0 mg/kg、有机质 16.1 g/kg。
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选取生长良好，长势一致的黄芩种苗，在 2021 年 4 月 20 日完成黄芩种苗移栽。试验田设置不施肥料对照（CK）、单施化肥（NPK）、生物有机肥配施化肥（NPKM）3 个处理，每个处理 3 个重复，共计 9 个小区，小区面积为 40 m2。在 NPK 处理中，化肥施入量按 N 225 kg/hm2、P2O5 180 kg / hm2、K2O 225 kg/hm2 进行施肥；在 NPKM 处理中，除施入与 NPK 处理等量的无机肥外，还添加了生物有机肥，其施用量为 1800 kg/hm2，供试生物有机肥产自河北力康农生物科技有限责任公司，其执行标准为 NY 884—2012，登记菌株为解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，有效活菌数（以干基计） ≥5.0 亿个 /g，有机质含量（以干基计）≥45.0%。磷肥和有机肥全部作为基肥在 2021 年 4 月一次性施入；氮肥和钾肥分 3 次施入土壤，于 2021 年 4 月将总量的 1/3 作为基肥施入，基肥的施肥方式为撒施后旋耕，剩余 2/3 作为追肥分别在 2021 年 7 月和 2022 年 8 月（黄芩常规栽培追肥时间）通过撒施的方式等量施入。试验期间各处理除施肥水平不同外，其他栽培措施保持一致，均进行常规田间管理。
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1.2 土壤样品采集
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土壤样品在 2022 年 11 月采集，将黄芩整株挖出后，抖落根系表层土壤，用灭菌刷将根际土壤刷入无菌袋中，混合均匀后立即置于冰盒中，并迅速转移至-80℃超低温冰箱保存。
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1.3 高通量测序及数据分析
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根据 Fast DNA Spin Kit for Soil （MP Biomedicals，Santa Ana，CA，USA）试剂盒说明书进行土壤微生物总 DNA 的提取。采用 16S rRNA V3～V4 区进行细菌高通量测序，使用 515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3 ′）/806R（5 ′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3 ′） 通用引物进行 PCR 扩增，每个样品前端引物均含有不同的 7 bp Barcode 用于区分不同样品。PCR 扩增体系（25 μL）：预混液 12.5 μL，DNA 模板 1 μL，上下游引物（10 μmol/L）0.8 μL，ddH2O 补充至 25 μL。扩增程序：95℃、5 min，95℃、30 s， 55℃、30 s，72℃、60 s，共 30 个循环，之后 72℃、10 min。为保证扩增片段的质量符合测序要求，每个样品扩增 4 个技术平行，扩增后将其混合成 1 个样品，反应产物采用 TIANgel Midi Purification Kit（天根，中国）进行纯化，纯化产物送往诺禾致源科技股份有限公司（北京），基于 Novaseq 技术平台完成序列分析。
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使用 FLASH http：//www.cbcb.umd.edu/software/ flash，version 1.2.7）对每个样本的原始序列进行拼接，然后使用 fastp 对拼接得到的原始序列经过质控后再进行去嵌合体序列的处理，获得最终的有效数据。通过 UPARSE，根据 97% 的相似度对序列进行 OTU 聚类。选取 OTU 的代表性序列（OTU 中出现频数最高的序列）进行物种注释，用 Mothur 方法与 SILVA 的 SSUrRNA 数据库进行物种注释分析获得分类学信息。最后，以样本中最少数据量为标准对各样本数据进行均一化处理。
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采用 Mothur 基于 SparCC 方法计算 OTU 间的 Spearman 相关系数，为了降低稀有 OTUs 对相关性分析产生的偏差影响，选取丰度高于 0.1% 的 OTU 用于网络构建；通过 R 中的 RMThreshold 包筛选出最小相关系数阈值为 0.80565，最终选用 |r| >0.80565，P<0.05 的关系用于构建网络，在 igraph 包中构建微生物分子生态网络（Csardi and Nepusz， 2006），运用 induced_subgraph 函数抽取每个样品的子网络，计算各个样品的拓扑学特征，如边数、节点数、平均度、中介中心性、平均路径长度等；使用 Gephi 进行网络图形绘制。
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运用 SPSS 26.0 进行方差分析和 Pearson 相关分析；采用 CANOCO 5 进行非度量多维尺度（NMDS） 分析，同时运用 R 中的 vegan 包通过置换多元方差分析和多响应置换过程检测差异的显著性；运用 R 中的 igraph 和 RColorBrewer 包绘制网络模块内连通度和模块间连通度（Zi-Pi）图。
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2 结果与分析
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2.1 土壤细菌 Alpha 多样性
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通过高通量测序总共得到 395550 条高质量序列，共包含 8803 个 OTU，其中各个样品包含有 1959～2350 个 OTU，经过对比，这些 OTU 归属于 39 个门和 100 个纲。不同施肥处理细菌 Alpha 多样性如图1 所示，NPKM 处理的细菌丰富度显著高于 CK 和 NPK 处理，增幅分别为 11.51% 和 7.37%， NPKM 处理中的香农多样性指数显著高于 CK 处理，增幅为 2.03%。
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2.2 土壤细菌群落结构
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土壤细菌主要隶属于 5 个门，即变形菌门 （Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteriota）、硝化菌门 （Nitrospirota）、甲基微菌门（Methylomirabilota）、拟杆菌门 （Bacteroidota），不同处理中，该 5 个类群占总丰度的 79.9%～78.9% （图2a）。变形菌门的相对丰度在各处理中均大于 28%，是优势菌门。不同处理之间，CK 处理中酸杆菌门（Acidobacteriota）的丰度显著高于 NPK 和 NPKM 处理； 变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidota）在 NPK 处理中的丰度显著高于其他处理；NPKM 处理中，放线菌门（Actinobacteriota）和绿弯菌门（Chloroflexi）的丰度显著高于 CK 和 NPK 处理 （图2c）。图2b 为进一步在纲水平上进行分类，丰度最高的前 5 个纲属于变形菌门、酸杆菌门、芽单胞菌门 （Gemmatimonadetes），不同处理中，该 5 个类群占总丰度的 50.4%～54.9%。基于 Bray-curtis 距离对细菌群落结构进行 NMDS 分析，结果表明，前两轴总共解释了 88.62% 的群落差异，其中第一轴和第二轴分别解释了 68.10% 和 20.52% 的群落差异（图2d），应用置换多元方差分析与多响应置换过程进行验证发现各处理之间的群落结构具有显著差异（表1）。
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图1 不同施肥处理下土壤细菌 Alpha 多样性
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注：柱上不同字母表示处理间差异显著（P<0.05）。下同。
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2.3 土壤细菌生态网络分析
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通过构建 16S rRNA 的分子生态网络，可以研究不同施肥模式下，黄芩根际土壤细菌不同物种间互作关系，结果如图3a 所示。生态网络包含 199 条边和 125 个节点，在生态网络中，两个节点间连线表示其存在显著相关关系，连线越粗，表明相关性越强，不同节点间正相关关系（红色） 占 64.32%，负相关关系（ 绿色） 占 35.68%。将生态网络进行聚类，共形成 7 个模块（Module）， Module I 的节点最多且丰度最高，共 100 个节点，占总丰度的 19.80%； 其次是 Module Ⅳ 和 Module Ⅴ，分别包含 8 和 7 个节点。变形菌门 （Proteobacteria） 和酸杆菌门（Acidobacteriota） 等门在 Module Ⅰ中丰度均最高（图3b）。比较不同处理下，黄芩根际土壤微生物群落生态网络的拓扑学特征发现：NPK 处理的节点数、边数、传递性、平均度均低于 CK 和 NPKM 处理，以节点数和边数为例，CK 和 NPKM 处理的网络节点数较 NPK 处理而言，分别增加了 4.76% 和 5.95%，边数则分别增加了 12.13% 和 10.54%，而中介中心性、平均路径长度与密度在各处理间没有显著差异（表2）。
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图2 不同施肥处理下土壤的细菌群落结构
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注：（a）门水平细菌群落相对丰度图；（b）纲水平细菌群落相对丰度图； （c）不同施肥处理下 8 个丰度最高的门的相对丰度；（d）非度量多维尺度分析图。
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图3 16S rRNA 群落生态网络（a）和各模块 OTU 的分布及其相对丰度（b）
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注：圆圈的大小代表度的高低，线的粗细代表相关性大小，红色表示正相关，蓝色表示负相关。
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注：同列数据后不同字母表示处理间差异显著（P<0.05）。
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在以往的研究中，将分子生态网络的模块间连通度 Pi ≥ 0.62 或模块内连通度 Zi ≥ 2.5 的节点作为关键物种[19]，本研究的结果表明黄芩根际土壤中的关键物种有变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门 （Acidobacteriota）、放线菌门（Actinobacteriota）、芽单胞菌门（Gemmatimonadota）、拟杆菌门（Bacteroidota） （图4）。
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图4 16S rRNA 分子生态网络 Zi-Pi 图
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3 讨论
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3.1 不同施肥措施对黄芩根际土壤细菌群落的影响
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土壤细菌群落多样性能反映出细菌群落的种类和种间差异，是影响土壤养分周转和作物生产力的重要因素[20]。以往研究结果表明，施用生物有机肥可以通过增加土壤孔隙度、降低土壤容重等方式改善土壤物理性状[21]，从而有利于土壤细菌数量和多样性的提高[22-23]，这与本研究结果相同，与不施肥和单施化肥相比，施用生物有机肥显著增加了黄芩根际土壤细菌的 Alpha 多样性（图1），这可能是施用生物有机肥后，增加了土壤有机碳的含量，一方面能直接为土壤微生物提供碳源，另一方面，有机碳的投入能促进黄芩更好的生长，促进了黄芩根际碳的分泌，从而增加了土壤细菌多样性[24]。应当注意的是生物有机肥中的外源细菌也有可能会增加土壤细菌多样性和丰富度[25]，本研究添加的生物有机肥中含有芽孢杆菌，芽孢杆菌隶属于厚壁菌门-芽孢杆菌纲，但 NPKM 处理中厚壁菌门 （Firmicutes）的相对丰度与 CK 和 NPK 处理相比均无显著差异（图2），这可能是因为与土壤中本来存在的芽孢杆菌的生物量相比，通过生物有机肥添加进入土壤的芽孢杆菌量含量较低，不足以显著提高 NPKM 处理中芽孢杆菌的相对丰度，但生物有机肥可通过提高土壤养分（如氮、磷）、土壤有机质含量以及土壤酶活性等方式改善土壤微生物生存环境，从而调节土壤微生物群落结构[26]。
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在黄芩根际土壤中，变形菌门、酸杆菌门、硝化菌门、拟杆菌门等是相对丰度较高的门（图2），这些细菌也同样广泛存在于种植牧草[27]、小麦-玉米[9]、番茄[28]等作物的土壤中，这说明不同条件下土壤细菌的优势物种具有稳定性。但是在不同施肥处理下，黄芩根际细菌群落组成存在明显差异，这可能是施肥方式通过影响黄芩根际分泌物从而影响群落组成。CK 处理下，酸杆菌门的丰度显著高于施肥处理（ 图2），CK 处理中，由于没有施肥，土壤较为贫瘠，导致黄芩生物量较低，根际分泌物较少，而酸杆菌门属于典型的寡营养型细菌，广泛存在于养分较少的土壤中，其相对丰度与土壤有机质含量呈显著负相关[29]，因此，在 CK 处理中，酸杆菌门丰度较高，这与马垒等[9] 的研究结果相同。NPK 处理中，变形菌门和拟杆菌门的相对丰度显著升高 （图2）。变形菌门与拟杆菌门均属于富营养型细菌，适宜生长在养分含量和有效性高的土壤中，施用化肥后，土壤中各种营养成分的升高可能促进了这些物种丰度的升高[30]。NPKM 处理中，放线菌门和绿弯菌门的丰度显著高于其他处理（图2），放线菌门具有降解纤维素和几丁质等复杂有机大分子的能力[31]，几丁质和纤维素是自然界中最丰富的生物聚合物，降解后能有效改善土壤养分情况[32]，添加生物有机肥后，一方面有机肥的添加直接增加了这 2 种物质的含量，另一方面，有机肥和化肥的添加为黄芩提供了充足的养分，黄芩根际土壤中根系分泌物含量增加，黄芩根部组织等的脱落使黄芩根系周围拥有更丰富的碳源，有利于放线菌的生长。绿弯菌门形态多样，营养方式也十分丰富，参与了碳、氮、硫等元素的生物地球化学循环过程[33]，绿弯菌门是土壤有益菌，在植物病害防控上也起着重要作用[34]，王海婷等[21]的研究结果也表明，生物有机肥的添加显著增加了绿弯菌门的相对丰度，这与本研究结果一致。绿弯菌门的一些菌种在碳源较少的条件下，能以二氧化碳为碳源进行光能自养生长，而在有机质丰富的条件下，能以光能异养的方式快速生长[35]，因此，在碳源更充足的 NPKM 处理中，绿弯菌门更容易获得生长所需要的碳源，从而拥有更高的丰度。
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3.2 不同施肥措施对黄芩根际土壤细菌分子生态网络的影响
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分子生态网络的分析被广泛用于揭示微生物群落变化动态及其复杂的互作关系：如拮抗、竞争、合作、共生等[36]。在本研究的网络分析中，不同节点间正相关关系（64.32%）比例高于负相关关系 （35.68%）（图3），表明不同处理中，黄芩根际土壤细菌各物种间以合作协同关系占主导。本研究中 NPK 处理的边数和节点数均显著低于 CK 和 NPKM 处理（表2），说明其网络关系较其他处理更简单，网络稳定性较低，可能是 NPK 处理中黄芩根际土壤细菌之间的相互联系较弱[37]，这也说明仅施用化肥不有利于增强黄芩根际土壤细菌种群之间的联系和提高系统稳定性。Zi-Pi 的结果表明关键物种包含变形菌门、酸杆菌门、放线菌门、芽单胞菌门和拟杆菌门（图4），这些关键物种对维持细菌群落结构的稳定性和生态系统过程的功能中发挥重要作用，有趣的是芽单胞菌门的相对丰度虽然很低，但作为关键物种，它对于该细菌群落的稳定性和生态功能具有重要作用，这可能是因为芽单胞菌门的类群可以适应干燥的条件[38]，因为试验地点较为干旱，说明该类群可能在旱地生态系统中占有重要功能，Shi 等[39]的研究表明芽单胞菌门可能在碳固定、碳降解、氮循环和硫循环中发挥重要作用。
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4 结论
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化肥配施生物有机肥不仅显著增加了黄芩根际土壤细菌的多样性，还显著改变了细菌群落结构和组成，通过刺激放线菌门和绿弯菌门等的生长和活性，使黄芩根际微生物形成强烈的共生协作关系，共同参与土壤碳、氮、硫等元素循环，优化了黄芩根际细菌群落结构和组成，将有利于提高黄芩质量和产量。
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摘要
探究不同施肥措施对黄芩根际细菌群落结构和种间互作关系的影响，为黄芩的合理施肥和提高土壤微生物多样性提供理论依据。采用高通量测序技术对不施肥（CK）、单施化肥（NPK）、化肥配施生物有机肥 （NPKM）3 个处理的野外黄芩根际土壤样本细菌多样性、群落结构和网络关系进行测定和分析。结果表明，与 CK 和 NPK 处理相比，NPKM 处理显著增加了细菌多样性，增幅分别为 11.51% 和 7.37%。与 CK 相比，NPK 和 NPKM 处理均显著改变了细菌群落结构。不同处理中，变形菌门是丰度最高的门，其相对丰度均高于 28%，此外，CK 的优势菌群为寡营养型的酸杆菌门，NPK 处理的优势菌群为富营养型的变形菌门和拟杆菌门，NPKM 处理的优势菌群为能降解复杂有机物的放线菌门和绿弯菌门。网络分析的结果表明，黄芩根际土壤细菌各物种间的正相关性达 64.32%，表明物种间主要呈现出互相合作的关系，与 NPK 处理相比，CK 和 NPKM 处理的网络节点数分别增加了 4.76% 和 5.95%，而边数则分别增加了 12.13% 和 10.54%，说明仅施化肥不利于增强土壤微生物群落之间的联系和系统稳定性。综上所述，施用化肥，特别是化肥配施生物有机肥可以通过增强土壤细菌种间互作联系，优化群落组成，为黄芩生长提供更适宜的环境。
Abstract
This study aimed to clarify the effects of different fertilization regimes on bacterial community structure and intraspecific interactions in rhizosphere soil of Scutellaria baicalensis Georgi，and further lay the foundation for future research of reasonable fertilization of Scutellaria baicalensis Georgi and improving soil microbial diversity. The high-throughput sequencing technology was employed to compare the bacterial community structure among soils that subjected to three fertilization regimes：non-fertilization control（CK），chemical fertilizer application only（NPK），and chemical fertilizer application combined with bio-organic fertilizer（NPKM）. Compared with CK and NPK treatments，the bacterial richness was significantly increased by 11.51% and 7.37% under NPKM treatment，respectively. NPK and NPKM significantly affected the bacterial community structure as compared with CK. Proteobacteria was the most abundant phylum because of the highest relative abundance（>28%）in different treatments. The dominant species in CK belonged to Acidobacteria， which is oligotrophic microbes. The indicator species in NPK were Proteobacteria and Bacteroides，which favor the eutrophic environments. NPKM stimulated the abundance of Actinobacteriota and Chloroflexi，which play important roles in the decomposition of recalcitrant organic matters. The co-occurrence network analysis demonstrated that bacteria mainly showed cooperative relationships，as the positive correlation was 64.32% . Compared with NPK treatment，the number of the nodes in CK and NPKM were significantly increased by 4.76% and 5.95%，respectively，while the number of the edges in CK and NPKM were significantly increased by 12.13% and 10.54%，respectively. These results indicating that only applying chemical fertilizer would hinder the improvement of connection between bacteria and system stability. Our results indicated that chemical fertilizer application，especially chemical fertilizer application combined with bio-organic fertilizer，could provide a more suitable environment for Scutellaria baicalensis Georgi by enhancing the interaction between soil microbes， optimizing bacterial community composition.