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中国苹果的产量和销量均居世界首位，但由于土地资源有限，苹果连作栽培在所难免，发生连作障碍，连作障碍将导致植株生长发育缓慢、果实品质下降、病虫害加剧等[1]。造成苹果连作障碍的原因复杂多变，土壤中有害真菌大量繁殖导致群落结构的改变、土壤理化性质的改变、植物的化感自毒作用等是造成连作障碍的重要原因[2]。目前，已知的克服连作障碍效果最好的方法是对土壤进行化学熏蒸，但因其危害人体和环境，已经被逐渐禁止。
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研究表明，腐植酸是大分子有机弱酸混合物，具有多种官能团，应用广泛，可以改善土壤理化性质，提高土壤养分，促进果树生长，增强果树抗逆能力[2]。课题组前期研究发现，1.5 g·kg-1 的腐植酸能明显促进苹果幼苗的生长发育。
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农膜覆盖是一项采用塑料薄膜覆盖地面的栽培技术，具有防旱防涝、增温、增湿的优点，目前已广泛应用于苹果[3]、樱桃[4]、杏[5]、梨[6]等作物栽培。地面覆盖是非常有价值的应对连作障碍的方式之一[7]。王晓芳等[8]研究发现，连作土加万寿菊生物熏蒸剂后，覆膜能明显减轻苹果连作障碍，提高苹果幼苗的生长发育；沟垄覆膜栽培可不同程度提高马铃薯连作田土壤酶活性，改善马铃薯根际土壤的理化性状，提高马铃薯块茎产量[9]； 刘凯等[10]研究表明，在减氮处理基础上进行覆膜种植后，可实现冬小麦产量的增加，促进养分的吸收转移，进一步提高肥料利用效率。
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腐植酸生物降解膜不仅能有效保蓄土壤水分，提高水分利用效率，促进肥料、土壤中有机物的腐熟和分解，还能分解成为对环境友好的小分子化合物并最终参与生物代谢循环[11]，缓解普通地膜造成的“白色污染”。但腐植酸及其生物降解膜对苹果连作障碍的影响，以及腐植酸生物降解膜破裂后的碎片对土壤环境的影响尚未可知，本试验尝试模拟腐植酸生物膜降解后，通过检测其对于连作条件下苹果幼苗生长及土壤环境的影响，系统性地探讨该方法在防控苹果连作障碍中的效果，以期为防控苹果连作障碍提供新的方案。
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1 材料与方法
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1.1 试验材料
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试验于 2022 年 3—9 月在山东农业大学园艺科学与工程学院、山东农业大学泮河校区实验站进行。
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供试连作土取自山东省泰安市满庄镇小王庄村 25 年的老苹果园，砧木类型为八棱海棠（Malus robusta Rehd.）。连作土壤硝态氮含量为 5.77 mg·kg-1、铵态氮含量为 3.04 mg·kg-1、有效磷含量为 6.67 mg·kg-1、速效钾含量为 34.2 mg·kg-1、有机质含量为 42.36 g·kg-1。
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腐植酸生物降解膜来自于山东清田塑工有限公司，聚己二酸对苯二甲酸丁二醇酯含量 90%；聚乳酸含量 5%；腐植酸含量 5%；厚度为 10μm。
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腐植酸由山东农大肥业科技有限公司提供，腐植酸含量 50%，黄腐酸含量 45%，有机质含量 40%，N、P2O5、K2O 含量分别为 25%、5%、10%。
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盆栽用苗是以苹果常用砧木平邑甜茶（Malus hupehensis）种子在 4℃条件下层压 30 d，发芽后于 3 月初播种到装有基质的塑料盆中统一管理，5 月初选取六叶幼苗作为盆栽试验材料。
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1.2 试验设计
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为了模拟腐植酸生物降解膜在使用降解后的土壤环境，考察其降解后的产物对连作土壤环境的影响，将腐植酸生物降解膜剪成 1 mm 碎片与腐植酸、连作土充分混匀后装入泥瓦盆（高 18 cm、上直径 25 cm、下直径 17 cm），每盆装土约 7 kg，每盆土添加面积约 500 cm2、重约 0.573 g 的腐植酸生物降解膜。共设定 5 个处理：未作处理连作土（CK）、溴甲烷熏蒸灭菌连作土（FM）、连作土 +1.5 g·kg-1 的腐植酸（A1）、连作土 + 腐植酸生物降解膜（A2）、连作土 + 腐植酸生物降解膜 +1.5 g·kg-1 的腐植酸复合处理（A3），每个处理 12 盆，每盆定植 1 棵，所有处理均采用统一肥水管理。
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1.3 测定指标
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于 2022 年 8 月中旬和 9 月中旬进行取样，并测定相关指标，每个处理 3 个重复。取根际土过 2 mm 筛后分装入封口袋，一部分样品放置 4℃冰箱用于土壤微生物计数；一部分样品风干用于土壤酶活性的测定。
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生物量：使用直尺测量株高、游标卡尺测量地径。植株清洗干净擦干水分后用天平测定其鲜重，放入烘箱 105℃下烘干，测定其干重。
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根系构型参数：用清水洗净根系，平铺在塑料板上的水中，使用专业版 WinRHIZO（2007 年版） 根系分析系统进行形态分析，记录根长度、根表面积、根体积和根尖数。
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叶、根抗氧化酶：超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）的含量参照张志良等[12]的方法测定。
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土壤酶：脲酶活性采用比色法测定，磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法测定，蔗糖酶活性采用比色法测定，过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法测定[13]。
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土壤微生物：土壤细菌、真菌、放线菌数量的测定均采用稀释平板计数法，细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基于 37℃条件下培养，真菌和放线菌分别采用 PDA 和 G 氏选择性培养基于 28℃条件下培养[14]。
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土壤养分：土壤铵态氮含量测定采用氯化钾浸提-靛酚蓝比色法，土壤硝态氮含量测定采用双波长紫外分光光度法，土壤有效磷含量测定采用钼锑抗吸光光度法，土壤速效钾含量测定采用火焰光度法，土壤有机质含量测定采用重铬酸钾容量法[13]。
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土壤镰孢菌数量：采用 E. Z. N. ATM 土壤 DNA 提取试剂盒提取土壤总 DNA 并纯化；采用 CFX-96TMThermal Cycler（Bio-Rad）对土壤中 4 种镰孢菌的基因拷贝数进行荧光定量分析[15]。
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试验数据通过 Excel 2003 进行计算和作图，采用 SPSS 19.0 进行方差分析，Duncan’s 新复极差法进行差异显著性检测。采用 Pearson 相关系数分析来阐明土壤酶活性、微生物数量与土壤养分含量之间的相互关系，所有数据均为 3 次重复的平均值。
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2 结果与分析
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2.1 腐植酸及其生物降解膜对连作平邑甜茶幼苗生长量的影响
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由表1 可以看出，2022 年 8 月，连作土壤中添加腐植酸、腐植酸生物降解膜及二者复合处理，均能促进苹果幼苗的生长，其中复合效果最佳，但复合处理的干、鲜重与腐植酸处理并未达到显著性差异。腐植酸和腐植酸生物降解膜复合处理使得幼苗株高、地径、鲜重、干重比 CK 分别提高了 72.56%、58.50%、196.20%、250.81%；9 月植株生长趋势与 8 月一致。
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注：表中同一取样时间不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。下同。
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2.2 腐植酸及其生物降解膜对平邑甜茶幼苗根系形态的影响
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由表2 可知，2022 年 8 月，添加腐植酸、腐植酸生物降解膜以及复合处理均促进了平邑甜茶幼苗植株根系的生长，其中腐植酸与腐植酸生物降解膜复合的效果最为显著，平邑甜茶根系的总根长、表面积、根体积和根尖数分别比 CK 提高了 122.31%、 74.93%、143.75% 和 134.40%；9 月处理与 8 月基本一致。
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2.3 腐植酸及其生物降解膜对平邑甜茶幼苗根酶活性及丙二醛含量的影响
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图1 显示，与 CK 的幼苗相比，经过腐植酸、腐植酸生物降解膜处理幼苗的根抗氧化酶（SOD、 POD、CAT）的活性均有不同程度的提高，而 MDA 含量均发生不同程度的下降。除溴甲烷熏蒸处理外，腐植酸与腐植酸生物降解膜复合处理对提高叶片中抗氧化酶活性效果最优，单施腐植酸略优于单施腐植酸生物降解膜处理。与 CK 相比，2022 年 8 月 A3 处理叶片中 SOD、POD、CAT 活性分别提高了 63.40%、100.85%、72.57%，MDA 含量下降了 47.89%；9 月趋势表现出与 8 月一致。
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图1 腐植酸生物降解膜对连作平邑甜茶幼苗根酶活性以及丙二醛含量的影响
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注：同一取样时间柱上不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。下同。
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2.4 腐植酸及其生物降解膜对连作平邑甜茶幼苗叶酶活性及丙二醛含量的影响
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图2 显示，与 CK 的幼苗相比，经过腐植酸、腐植酸生物降解膜处理幼苗的叶片抗氧化酶（SOD、 POD、CAT）的活性均有不同程度的提高，而叶片 MDA 含量均发生不同程度的下降。除溴甲烷熏蒸处理外，腐植酸与腐植酸生物降解膜复合处理对提高叶片中抗氧化酶活性效果最优，单施腐植酸略优于单施腐植酸生物降解膜处理。与 CK 相比，8 月份 A3 处理叶片中 SOD、POD、CAT 活性分别提高了 218.84%、142.20%、172.18%，MDA 含量下降了 40.39%，9 月表现出趋势与 8 月一致。
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2.5 腐植酸及其生物降解膜对连作土壤环境的影响
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2.5.1 对连作土壤可培养微生物总量的影响
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表3 显示，添加腐植酸、腐植酸生物降解膜以及复合处理的根区土壤细菌数量均出现不同程度的升高，而土壤真菌数量出现不同程度的下降，细菌 / 真菌值增加，配施处理的效果最为明显。8 月取样中，复合处理的细菌、放线菌数量比 CK 分别提高了 115.79%、135.14%；真菌数量降低了 87.25%，细菌 / 真菌值提高了 16 倍；9 月变化与 8 月一致。
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2.5.2 对连作土壤酶活性的影响
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与 CK 相比，腐植酸与生物降解膜复合处理中，过氧化氢酶、磷酸酶、蔗糖酶和脲酶的活性均有明显的提高（图3）。在所有处理的 8 月取样中， A3 处理（添加腐植酸降解膜 +1.5 g·kg-1 的腐植酸）的土壤酶活性最高，相比于 CK，过氧化氢酶、磷酸酶、蔗糖酶、脲酶的活性分别提高了 44.65%、 32.49%、103.90%、59.70%，其中磷酸酶活性的增长幅度较小。
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2.5.3 对连作土壤养分含量的影响
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由表4 可知，添加腐植酸、腐植酸生物降解膜以及复合处理均提升了平邑甜茶幼苗基质土壤铵态氮、有效磷、速效钾和有机质含量，其中腐植酸与腐植酸生物降解膜复合处理的效果最为显著，铵态氮、有效磷、速效钾和有机质相较于 CK 分别提高了 57.80%、113.83%、31.95% 和 108.60%；而灭菌处理硝态氮和铵态氮含量低于 CK，极有可能是因为灭菌处理的土壤酶活性、尤其是脲酶活性降低导致； 9 月处理与 8 月基本一致。
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图2 腐植酸生物降解膜对连作平邑甜茶幼苗叶片酶活性以及丙二醛含量的影响
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2.5.4 对连作土壤镰孢菌基因拷贝数的影响
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由图4 可以看出，与 CK 相比，添加了腐植酸、腐植酸生物降解膜的处理均能有效减少腐皮、层出、尖孢、串珠镰孢菌的基因拷贝数。其中，8 月 A3 处理的腐皮、层出、尖孢、串珠镰孢菌的基因拷贝数分别降低了 74.37%、66.36%、79.12%、 63.44%。A2 处理的腐皮、层出、尖孢、串珠镰孢菌的基因拷贝数分别降低了 46.86%、17.95%、 21.82%、21.21%，A1 处理的腐皮、层出、尖孢、串珠镰孢菌的基因拷贝数分别降低了 60.13%、 42.38%、62.40%、53.43%；9 月数据趋势与 8 月一致。
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图3 腐植酸生物降解膜对连作平邑甜茶幼苗土壤酶活性的影响
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图4 不同处理对土壤镰孢菌基因拷贝数的影响
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2.6 土壤酶活性、土壤微生物数量及土壤养分含量相关性分析
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土壤酶活性和土壤微生物数量与土壤养分含量关系密切。由表5 可以看出，土壤脲酶、蔗糖酶、磷酸酶、过氧化氢酶活性与铵态氮、有效磷、速效钾以及有机质含量呈极显著正相关（P<0.01）；细菌数量与铵态氮、有效磷、速效钾和有机质含量呈极显著正相关（P<0.01）；真菌数量与土壤有机质含量呈极显著负相关（P<0.01），与铵态氮、有效磷、速效钾含量呈负相关；放线菌数量与铵态氨、有效磷、速效钾及有机质含量呈正相关，但没达到显著水平；4 种土壤酶活性、3 种微生物数量与硝态氮含量相关性不显著。
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注：* 表示 0.05 水平上显著相关；** 表示 0.01 水平上极显著相关。
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3 讨论
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3.1 对平邑甜茶幼苗生物量的影响
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植株的生物量是宏观上用来比较植株生长优劣的一个参数，一般情况下，长势差的幼苗容易染病[16]，健壮的植株有利于提高植株的抗逆能力。植物的根系具有激素调节、养分提供、环境胁迫、信号转导、遗传控制等作用，良好的根系构型对植株的生长具有重要作用[17]。本试验中，腐植酸及其生物降解膜处理后的平邑甜茶幼苗生物量显著高于其他处理，这可能是因为腐植酸和腐植酸生物降解膜碎片富含丰富的有机物，它们的添加能改善土壤通透性，良好的土壤通透性有利于根系的生长和吸收更多的养分从而促进幼苗的生长发育。王璐等[18]研究结果表明，施用有机物可以促进苹果幼苗的生长，改善土壤通透性和孔隙率，这与本文的研究结果一致。且腐植酸肥料本身作为外源生长素能刺激苹果内生细胞激肽类和生长素的增加，促进相关蛋白质的合成和细胞的生长，从而促进其根系生长和产量的增加[19]。
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3.2 对平邑甜茶幼苗抗氧化酶活性的影响
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在正常生理条件下，植物体内会产生 O2- · （超氧自由基）、·OH（羟基自由基）、H2O2（过氧化氢）、ROOH（过氧化物）和 1 O2（单线态氧） 等物质，这些物质统称为 ROS（活性氧），植物的抗氧化系统（主要是 SOD、POD 和 CAT 等）对 ROS 的去除是动态平衡的。但当植物受到诸如盐分、干旱、低温等逆境胁迫时，这种平衡会被打破，植株内部会积累大量 ROS，高浓度的 ROS 能够导致生物膜脂过氧化，妨碍蛋白质的合成，从而造成细胞功能失常、逆境中植株的损伤[20]。 SOD、POD、CAT 是保护植物体不受自由基伤害的抗氧化酶，MDA 含量高低反映了植物膜系统的受损程度[21]。腐植酸能通过刺激植物各器官中蛋白质和酶的合成，增强植物体内的抗氧化酶活性和降低植物中 MDA 含量，减轻生物膜过氧化程度[22]。对定植辣椒的土壤施加不同程度的腐植酸复合肥（0～0.4 g·kg-1）后，0.2 g·kg-1 的腐植酸复合肥能最大程度的提高辣椒叶片 SOD 和 POD 活性，延缓植株衰老[23]；施用腐植酸钾显著提高了生姜根系 SOD、CAT、POD 活性，降低了 MDA 含量，延缓了根系衰老[24]。另外，腐植酸生物降解膜碎片在施入土壤中会继续降解，析出腐植酸，促进植物生长[11]。本试验添加腐植酸、腐植酸生物降解膜后，平邑甜茶幼苗叶片和根系的抗氧化酶活性都有不同程度的升高，MDA 含量呈现降低趋势，说明了添加腐植酸、腐植酸生物降解膜后平邑甜茶幼苗长势茁壮，且复合处理的平邑甜茶对抗连作损伤的能力相对较强，可能是因为腐植酸与苹果幼苗内部发生相互作用，腐植酸影响了其抗氧化酶活性和液泡质体中水通道蛋白编码基因的表达，从而控制了 ROS 水平和脂质过氧化的发生[25]，这与王玫等[26]对平邑甜茶幼苗叶片喷施黄腐酸能提高 SOD 和 POD 活性，降低 MDA 含量的结果一致。
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3.3 对土壤环境的影响
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当连作障碍发生时，土壤环境发生改变，包括土壤微生物区系失衡和土壤理化性质的恶化[1]。前人研究表明，长期连作会降低土壤中有益微生物数量，增加有害菌数量[27]。Wang 等[15]的研究表明，镰孢菌是渤海湾地区苹果园发生苹果连作障碍的主要致病菌，对发生苹果连作障碍土壤中的有害镰孢菌进行分离鉴定，结果表明分离的镰孢菌主要分为：尖孢镰孢菌、层出镰孢菌、腐皮镰孢菌和串珠镰孢菌。本试验发现，添加了腐植酸、腐植酸生物降解膜的处理明显降低了土壤中的真菌数量，尤其是 4 种镰孢菌的基因拷贝数有不同程度的降低趋势，细菌和放线菌的数量显著上升，使得细菌 / 真菌值变大，这说明腐植酸及其生物降解膜的添加有助于土壤微生物环境由不利于植物生长的“真菌型”向适合植物生长的“细菌型”改变[28]。这可能是因为腐植酸能刺激植物固有的防御机制，从而让植物能够更快地对镰孢菌的入侵和定殖作出反应，此外，复合处理导致了苹果幼苗 CAT、SOD 和 POD 活性的增加，这说明抗性的表达往往伴随着抗氧化酶的激活[29]。
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土壤养分提供植物生长所必需的矿质元素，是评价土壤自然肥力的重要指标，土壤酶参与土壤中许多的生物化学过程，也常作为评价土壤肥力的重要指标[30-31]。本试验中，添加腐植酸、腐植酸生物降解膜以及复合处理均能提高 4 种土壤酶活性和速效养分含量，其中腐植酸与腐植酸生物降解膜复合处理最为显著。可能是因为添加腐植酸与腐植酸生物降解膜有利于脲酶对土壤中尿素的转化，改善土壤中氮素含量，促进植物吸收利用[32]；增强土壤中磷酸酶活性，促进土壤有机磷的矿化[33]，催化土壤中有机磷化合物变为无机态磷，改善土壤中磷元素营养水平；增强蔗糖酶活性促使蔗糖酶水解为单糖，加快有机质的转化[34]；提高过氧化氢酶活性，促进土壤过氧化氢分解，有利于消除其对生物的危害作用[35]。且腐植酸及其生物降解膜中的腐植酸本身拥有较多的羧基、酚羟基等功能集团和阳离子可直接与土壤中的养分离子结合，提高土壤中的养分含量[36]。本试验中腐植酸和腐植酸生物降解膜复合处理的土壤酶活性的提高促进了连作土壤中的养分供给，提高了土壤微生物活性和土壤肥力，有利于平邑甜茶幼苗根系对养分的吸收，减轻连作障碍。
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土壤养分的丰度和成分对土壤酶活性和微生物数量起着决定性作用[37]。本试验对土壤酶活性、土壤微生物数量、土壤养分含量综合分析发现，土壤铵态氮、有效磷、速效钾以及有机质含量与脲酶、蔗糖酶、磷酸酶、过氧化氢酶活性以及细菌数量之间呈极显著正相关，对土壤酶活性和细菌数量有显著促进作用，这说明土壤酶活性和细菌数量对土壤中铵态氮的的转化、有效磷的矿化、速效钾的释放及有机质的分解有明显促进作用，能提高土壤肥力，这与张晓龙等[38]研究结果一致；土壤铵态氮、有效磷、速效钾及有机质含量与真菌数量之间呈极显著负相关，放线菌数量对有机质的转化有一定促进作用，说明因连作土壤中的真菌，可能是与营养转化无关，放线菌对有机质的转化、土壤肥力的提升起着重要作用；硝态氮与各指标相关性不显著，这表明硝态氮对土壤酶活性和微生物数量不敏感。
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4 结论
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在本试验中，添加 1.5 g·kg-1 的腐植酸和腐植酸生物降解膜后可以增加平邑甜茶幼苗的生物量以及根系总根长、根表面积、根体积和根尖数从而促进了幼苗的生长，且根系抗氧化酶和叶抗氧化酶得到了显著提升，MDA 含量显著下降，幼苗的抗逆性增强。同时，连作土壤中尖孢镰孢菌减少，细菌和放线菌数量增加，土壤养分含量显著提升，连作土壤环境得到改善。
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摘要
盆栽条件下，以平邑甜茶幼苗为试验材料，设置连作土（对照）、灭菌连作土、连作土添加 1.5 g·kg-1 腐植酸、连作土添加腐植酸生物降解膜、连作土添加 1.5 g·kg-1 腐植酸和腐植酸生物降解膜 5 个处理，通过测定处理后平邑甜茶生物量和植株根系生长状况、土壤微生物数量、土壤酶活性、土壤养分含量等指标，研究腐植酸及其生物降解膜对连作土壤环境及平邑甜茶幼苗生长的影响。8 月取样结果表明，与对照相比，腐植酸和腐植酸生物降解膜复合处理使得平邑甜茶幼苗株高、地径、鲜质量、干质量分别提高了 72.56%、58.50%、196.20%、250.81%；根表面积、根体积和根系超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶活性较连作土相比分别提高了 74.93%、143.75% 和 63.40%、100.85%、72.57%；腐植酸及其生物降解膜还可以改善土壤环境，施用后土壤中细菌数量明显增加，真菌数量减少，细菌 / 真菌值增大，细菌、放线菌数量分别比对照提高了 115.79%、135.14%，真菌数量降低了 87.25%，细菌 / 真菌值增大了 16 倍，且土壤有机质及营养元素含量也有所提升，9 月变化趋势与 8 月一致。综上所述，腐植酸及其生物降解膜改善了土壤环境，促进了平邑甜茶幼苗的生长，可有效减轻平邑甜茶的连作障碍。
Abstract
Under potted conditions，using the seedlings of Malus hupehensis as experimental materials，five treatments were set up，including continuous cropping soil，sterilized continuous cropping soil，continuous cropping soil with 1.5 g·kg-1 humic acid，continuous cropping soil with humic acid biodegradable film and continuous cropping soil with 1.5 g·kg-1 humic acid and humic acid biodegradable film. The effects of humic acid and its biodegradable film on the continuous cropping soil environment and the growth of Malus hupehensis seedlings were studied by measuring the biomass and root growth status of Malus hupehensis seedlings，the number of soil microorganisms，soil enzyme activity，soil nutrient content and other indicators. The results of the August sampling showed that compared to the control，the combined treatment of humic acid and humic acid biodegradable film significantly increased the height，ground diameter，fresh mass and dry mass of Malus hupehensis seedlings by 72.56%，58.50%，196.20% and 250.81%，respectively，and the root surface area，root volume，and root superoxide dismutase，peroxidase and catalase activities activities were increased by 74.93%，143.75%，63.40%， 100.85% and 72.57%，respectively，compared with the continuous cropping soil. Humic acid and its biodegradable film could improve the soil environment，with the application of them，the bacteria in the soil increased significantly，the number of pathogenic fungus decreased significantly，and the bacteria/fungus ratio increased. Compared with the control，the number of bacteria and actinomycetes in continuous cropping soil with 1.5 g·kg-1 humic acid and humic acid biodegradable film increased by 115.79% and 135.14%，respectively，the number of fungus decreased by 87.25%，and the bacteria/ fungus ratio improved by 16 times. The contents of soil organic matter and nutrients also improved. Moreover，the trend in September was consistent with that in August. In conclusion，the use of humic acid and its biodegradable film improved the soil environment and promoted the growth of Malus hupehensis seedlings while effectively reducing the continuous crop barrier of Malus hupehensis seedlings.
Keywords
humic acid ； humic acid biodegradable membrane ； replant disease