我国是农业生产大国，每年产生大量的农作物秸秆。木质纤维素是秸秆的主要成分，也是一种重要的可再生资源。秸秆还田对提高水分利用率、土壤酶活性以及有机质含量等具有重要作用^[1-2]。但秸秆中纤维素、半纤维素、木质素等高分子聚合物性质稳定，不易降解。微生物降解法因其反应条件温和、秸秆降解率高、对环境友善等优点而被广泛关注^[3]。自 1912 年 Kellerma 等^[4] 首次从土壤中分离出可降解纤维素的微生物 Cellulomonas flavigena 以来，各种降解纤维素的微生物被相继分离鉴定出来。黄颖婕等^[5]分离获得的解淀粉芽孢杆菌 （Bacillus amyloiquefaciens）X7，10 d 内可以使滤纸条完全崩解，其纤维素酶活性达 40.02 U/mL。陶治东等^[6] 筛选出一株高效纤维素降解菌里氏木霉DGW1，其滤纸酶酶活性为 112.71 U/g。Sun 等^[7] 筛选出的 Sarocladium strictum A4 具有较强的纤维素降解能力。黄青盈等^[8]使用筛选驯化的方法，得到有秸秆降解能力的细菌。张鹏飞等^[9]从长期覆盖秸秆的土壤中分离纤维素降解能力强的菌株，筛到 2 株放线菌和 1 株细菌。但在实际应用中丝状真菌最为广泛，因其可以产生菌丝，而这些菌丝能够穿透秸秆表层结构，破坏木质素蜡质层，具有强大的分解纤维素的能力^[10]。Shrivastave 等^[11]和张斯童等^[12]发现，真菌对秸秆的降解效果是最优的，真菌的降解能力好于细菌和放线菌。目前，国内外报道的真菌菌群有青霉属（Penicillium）、木霉属 （Trichoderma）和曲霉属（Aspergillus）等^[13]。

微生物对秸秆的降解能力受环境影响较大，但大多数纤维素降解菌在低温条件下不能生长，降解能力差。目前，对纤维素降解菌的研究多以常温环境的微生物筛选为主^[14]。河北省小麦和玉米轮作种植区，四季分明，冬季时间长、地温低，常温菌降解玉米秸秆效果差。而低温秸秆降解菌则不受温度限制，具有良好的纤维素降解能力。本研究从河北省石家庄、邢台、唐山等地区的小麦-玉米轮作农田土壤分离筛选纤维素降解菌，在 10℃条件筛到 1 株高效降解纤维素的菌株 SDF-LT。通过其形态学观察及 ITS 分子生物学鉴定技术鉴定了菌株，并研究其对秸秆的降解特性，以期为华北地区秸秆高效利用利用提供菌种资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试土壤及秸秆样品

土壤样品采自河北省石家庄、邢台、唐山等地区的小麦-玉米轮作农田的 5～10 cm 土层，共 39 份土壤样品。将土壤表面的动植物残体等杂质去除后，将土壤样品置入灭菌袋后，4℃保存。于河北省石家庄市赵县玉米地收集经粉碎机粉碎后的玉米秸秆，晾干后充分混匀待用。对照为市售秸秆降解菌剂旺农宝（洛阳欧克生物科技有限公司生产），有效活菌数在 5.0 亿个 /g 以上，有效菌种为枯草芽孢杆菌、哈茨木霉，剂型为粉剂。供试低温菌（假裸囊菌 SDF-LT）为本课题组筛选，有效活菌数 2×10⁷ 个 /mL，剂型为液体。

1.1.2 供试培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、纤维素钠-刚果红固体培养基、液体产酶培养基均参照黄亚丽等^[15]研究方法配制。

1.2 低温真菌的分离、纯化

称取 5 g 土壤样品置于 45 mL 灭菌水中，28℃、 180 r/min 恒温振荡 30 min。以稀释涂布法^[16]将土壤样品稀释液加至 PDA 培养基，10℃恒温培养 5 d，挑取形态各异、生长迅速的真菌菌落并进行 3 次分离纯化，获得低温生长的纯培养菌株并接种于 PDA 斜面培养基上保存备用。

1.3 低温纤维素降解菌的筛选

将筛选得到的低温菌株接种到 PDA 平板上于 10℃进行活化，然后用直径为 5 mm 的打孔器打取菌块，并接种于纤维素-刚果红固体培养基上， 10℃恒温培养 5 d，观察菌落附近有无水解透明圈，测量、记录菌落直径（d）和水解透明圈直径 （D），计算 D/d 值。每个菌株 3 次重复。将初筛得到的菌株在马铃薯葡萄糖水液体培养基中活化后，按 10% 的接种量接种于 50 mL 的液体产酶培养基中，10℃、180 r/min 继续恒温振荡培养进行液体发酵，6 d 后取样 10 mL 于离心管中，10000 r/min 离心 10 min，上清液即为粗酶液。以 1 cm×6 cm 左右的滤纸为底物，采用 3，5-二硝基水杨酸法测定菌株的滤纸酶活性^[17]。

1.4 低温秸秆降解菌株的鉴定

1.4.1 菌株的形态学特征鉴定

将菌株接种于 PDA 培养基中，10℃恒温培养，观察并记录菌株在 PDA 固体培养基上的菌落特征、色素产生情况，并在光学显微镜下观察菌丝、分生孢子和分生孢子梗的形态。

1.4.2 菌株的分子生物学鉴定

将菌株送至上海生工生物技术有限公司进行 ITS 序列测序，所得序列在 Genbank 数据库进行 BLAST 比对，采用 MEGA 7.0 与 Neighbor-Joining 法进行系统发育分析并构建系统发育树。

1.5 自然条件下沙袋法测定菌株 SDF-LT 的秸秆降解率

于 2022 年 10 月 21 日在石家庄市赵县农田边缘选取 1 m×3 m 区域进行自然低温条件下秸秆降解试验。设置 3 个处理：准确称量玉米秸秆 20 g 放入 0.15 mm 的尼龙袋（长 25 cm、宽 15 cm）中，秸秆表面喷施水为对照（CK）、喷施市售秸秆降解菌剂旺农宝（按照使用说明书用量 3000 g/hm²）为处理 1（T1）、喷施低温秸秆降解菌 SDF-LT（2×10⁷ 个 /mL）为处理 2（T2）。喷施量均为 30 mL，每个处理 4 次重复，将所有沙袋平铺埋入 20～25 cm 的土层。埋入后的第 20、40、60、80 d 取出沙袋，用自来水冲洗其中的玉米秸秆，直至滴下的水无色 （表明泥土等异物冲洗干净），然后将玉米秸秆置 85℃烘干至恒重，称取每个处理中的玉米秸秆重量，并计算降解率。

$\text{秸秆降解率}（\mathrm{\%}）=\left(W_0-W_1\right)/W_0\times 100$

式中，W₀ 为接种前培养基中秸秆的重量；W₁ 培养结束烘干后秸秆的重量。

1.6 玉米秸秆组成成分含量测定

将上述 1.5 步骤得到的秸秆粉碎后过 0.15mm 的筛网，利用美国 ANKOM2000i 全自动纤维分析仪，按照说明书要求，采用滤袋技术测定秸秆样品中的纤维素、半纤维素和木质素含量；用 FEI 公司生产的 Inspect S50 型扫描电子显微镜（SEM）观察秸秆纤维结构^[18-19]。

1.7 数据处理及分析

利用 Excel 2010 进行数据处理，利用 DPS 7.05 对试验数据进行方差分析和显著性检验，处理间的比较分析采用 Duncan 新复极差法（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 低温纤维素降解菌的分离及筛选

采用 PDA 培养基从 39 个土样中筛出低温生长迅速的真菌 212 株，其中 98 株在纤维素钠-刚果红固体平板上产生透明圈，10 个菌株的透明圈直径与菌落直径比值（D/d 值）大于 2.0（表1），具有较高的纤维素降解能力。滤纸酶活性代表一个菌株综合纤维素降解能力^[17]，初筛到的 10 株真菌滤纸酶活性为 60.70～101.60 U/mL（表1）。以菌株 SDF-LT 活性最高，SDF-NJF1、SDF-YNF1 次之。初步认定菌株 SDF-LT 具有较强的低温秸秆降解能力。

注：同一列不同小写字母表示菌株间差异达 0.05 显著水平。

2.2 低温秸秆降解菌株 SDF-LT 的鉴定

将菌株 SDF-LT 接种于 PDA 培养基于 10℃恒温培养，初期菌落呈白色，近圆形菌落，绒羽状，后期菌落表面生成大量锈红色颗粒状物（图1A）。该菌的分生孢子梗是各种各样短枝状，呈半透明并且光滑直立的，分生孢子直接从分生孢子梗末端形成，呈椭圆形（图1B、C）。菌株 PCR 扩增产物测序获得长度为 559 bp 的碱基序列，同源性分析显示 SDF-LT 的 ITS 序列与 Pseudogymnoascus sp. isolate F321（登录号：KX 610360.1）、Pseudogymnoascus sp. isolate JK-F-07（登录号：OM 218656.1）、 Leotiomycetes sp. isolate B33（登录号：MF615047.1） 等菌株的同源性均大于 99%，利用 MEGA 7.0 及其 Neighbor-Joining 法构建系统发育树（图2），该菌与假裸囊属菌（Pseudogymnoascus sp.）聚为同一分支。综合分析确定菌株 SDF-LT 为假裸囊属菌 （Pseudogymnoascus sp.）。

2.3 自然条件下沙袋法测定菌株 SDF-LT 的秸秆降解率

在不同时期，T2 的秸秆降解率较 T1、CK 分别显著提高 8.22%～17.87%、13.73%～23.07%（图3），说明低温秸秆降解菌加快玉米秸秆降解。随时间延长，田间温度逐步降低，二者之间降解率差异增大，T2 处理 80 d 时，秸秆降解率为 42.67%，比 T1 和 CK 的秸秆降解率分别增加 17.87% 和 23.07%。腐解 80 d 时，不同处理秸秆的表面颜色、质地发生明显变化。CK 的秸秆呈暗黄色，大小无明显变化；T1 的秸秆为褐色，变软；T2 的秸秆呈黑色，秸秆变得更加软烂（图4）。等量的秸秆 T2 处理体积变小，颜色加深，说明 SDF-LT 在低温时可有效降解玉米秸秆。

2.4 低温秸秆降解菌对玉米秸秆组成成分的影响

玉米秸杆主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，80 d 时 T2 的秸秆纤维素、半纤维素和木质素含量均最低，纤维素含量（26.79%）分别较 CK、T1 低 16.91%、25.19%（表2）。CK 的秸秆表面变粗糙，但纤维束结构未明显破坏，T1 的秸秆表面不再完整，内部结构有所暴露，T2 的纤维束结构断裂，纤维结构被高度破坏（图5）。

3 结论与讨论

农作物秸秆含有大量氮、磷、钾等营养元素，秸秆还田可提高秸秆利用率、培肥地力。采用微生物降解秸秆可提高作物秸秆利用率。我国北方冬季漫长、气温低，秸秆在自然条件下腐解缓慢，会严重影响下茬作物的生长。低温成为影响秸秆降解的主要因素，低温纤维素降解菌也成为了研究热点。本研究在 10℃条件下进行耐低温菌株的筛选，通过测定菌株透明圈大小以及其滤纸酶活性，最终筛选到 1 株能够在低温环境发挥较好秸秆降解效果的假裸囊菌 SDF-LT。假裸囊菌属于低温微生物，大多分布于地球两极地区、高山、冰川、海洋深处等地，可产生纤维素酶，具有滤纸酶和 β-葡萄糖苷酶活性^[20]。通过自然条件下沙袋法测定菌株 SDF-LT 的秸秆降解率发现，80 d 时 SDF-LT（T2）处理的玉米秸秆降解率为 42.67%，显著高于 CK、T1 （图3）。这可能是由于微生物主导了秸秆降解，而菌株 SDF-LT 可在低温条件下繁殖生长，菌株与秸秆表面接触紧密，其分泌的菌丝可破坏木质纤维素的分子结构，加速秸秆降解^[21]。同时，菌株 SDF-LT 也具有较高的酶活性，6 d 时其滤纸酶活性达到 101.69 U/mL（表1），菌株产生的酶破坏了秸秆中木质素与纤维素、半纤维素形成的复杂结构。随着玉米秸秆腐解，木质纤维素被降解为小分子寡糖和葡萄糖，80 d 时 T2 处理的纤维素、半纤维素和木质素含量最低，总占比为 59.73%，显著高于 CK、 T1 处理（表2）。前人研究发现使用 SEM 可以更直观的看出秸秆纤维束的降解断裂情况^[22]，本研究通过 SEM 发现，低温秸秆降解菌（T2）处理的秸秆纤维束结构断裂，纤维束结构高度破坏，进一步说明低温秸秆降解菌 SDF-LT 具有较强的纤维降解能力。

综上所述，从河北省小麦-玉米轮作区土壤中筛选到 1 株在 10℃具有较强秸秆降解能力的假裸囊菌（Pseudogymnoascus）SDF-LT，该菌株的玉米秸秆降解率在 80 d 时为 42.67%，显著高于市售常温秸秆腐熟菌剂和空白对照。秸秆腐解 80 d 时， SDF-LT 处理纤维素、半纤维素和木质素含量最低，秸秆纤维束秸秆高度破坏。菌株 SDF-LT 在低温时具有较好的降解作用。

参考文献