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苯醚甲环唑（difenoconazole），分子式为 C19H17Cl2N3O3，分子量 406.26，化学名为顺，反-3-氯-4-[4-甲基-2-1H-1，2，4-三唑-1-基甲基 （-1，3-二哑戊烷-2-基）]苯基 4-氯苯基醚，CAS 登记号为 119446-68-3。苯醚甲环唑是三唑类农用杀菌剂的一种，具有治疗、保护双重特性，对多种病原真菌具有良好杀灭效果[1]，被广泛应用于农业生产中各种作物蔬菜的种植。苯醚甲环唑易溶于有机溶剂，在土壤中移动性小，降解缓慢[2]，在土壤中半衰期可达 135.9 d 之久[3]。由于病害防治过程中的过量使用，已经导致苯醚甲环唑在农田土壤中大量蓄积[4-6]，这大大增加了其影响土壤环境的风险。微生物作为土壤生态的重要组成部分，也受到农药残留的影响，特别是杀菌剂施用后，土壤微生态系统遭到破坏，农药残留对土壤中微生物群落结构的影响以及微生物受到胁迫后的响应变化值得关注。近年来随着分子生物学的迅速发展，高通量测序技术成为研究土壤中微生物群落结构和丰度变化的重要手段，本研究通过模拟实际生产中施用苯醚甲环唑的土壤环境，利用高通量测序技术分析苯醚甲环唑的残留量对土壤中细菌和真菌整体所带来的影响，通过多样性分析，反映微生物群落丰富度和多样性变化，构建菌群与环境因子响应关系，旨在为农药残留对环境微生物的影响提供理论支撑。
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1 材料与方法
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1.1 试剂
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市购苯醚甲环唑（dif）水分散粒剂（青岛瀚生生物科技股份有限公司）净含量 10 g，有效成分含量 10%。
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1.2 土壤处理
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农田土壤取自辽宁省朝阳县（120°44′E， 41°53′N），取至少 5 年未使用 dif 的表层土壤 （5～20 cm），风干过 2 mm 筛，至于 20℃恒温暗培养 1 周。
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在田间条件下，根据 dif 的预测环境浓度约为 5.0 mg/kg（推荐剂量）[7]，在实际操作中农药的用量通常高于推荐剂量。因此，本试验设计 dif 添加浓度分别为 0、2.0、5.0、10.0 和 50.0 mg/kg 的 5 个处理组，分别标记为 CK、C2、C5、C10 和C50，每个处理 3 个重复。将混合均匀的土壤含水量调节为田间持水量的 60%，每份 1.0 kg 装于高 15 cm、直径 15 cm 的花盆中，保鲜膜密封扎孔透气。所有土壤样品至于恒温培养箱中，20℃暗培养，通过定期添加无菌蒸馏水保持土壤含水量，于第 35 d 取样进行土壤理化性质测定和 DNA 的提取。
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1.3 土壤理化性质及农残测定方法
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土壤 pH 测定方法参考《土壤 pH 的测定》（NY/ T1377—2007）；土壤有机质测定方法参考《土壤有机质的测定》（NY/T1121.6—2006）；全氮、碱解氮、有效磷含量的测定方法参考《土壤农化分析》[8]；采用气质联用仪，参考 Wang 等[9]从土壤中提取测定苯醚甲环唑（dif）的方法。
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1.4 土壤微生物 DNA 提取及测序
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采用土壤 DNA 试剂盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）提取土壤细菌和真菌总 DNA，利用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测提取的土壤微生物总 DNA 质量，然后将 DNA 送至上海美吉生物医药科技有限公司进行 MiSeq 高通量测序。细菌 16S rDNA 扩增引物为 F：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’，R： 5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’，真菌扩增引物为 F：5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’，R： 5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’。
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1.5 数据分析
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在美吉生物云平台，使用 fastp[10] 对双端原始测序序列进行质控，使用 FLASH[11] 进行拼接，使用 UPARSE[12-13] 根据 97% 的相似度对质控拼接后的序列进行操作分类单元 OTU 聚类并剔除嵌合体，将所有样本序列数抽平至 20000，采用 Mothur[14]计算 Alpha 多样性，使用基于距离的冗余分析用来调查环境因子对土壤菌群结构的影响。利用 SPSS 21.0 对环境因子和 Alpha 指数进行相关性分析。
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2 结果与分析
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2.1 苯醚甲环唑施用对土壤理化性质的影响
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表1 为土壤理化性质数据。由表1 可以看出，施用不同浓度的 dif 对土壤的理化性质有一定影响。其中随着 dif 浓度增加，土壤有机质（SOM）、总氮（TN）、碱解氮（AN）均有所提高，相反，有效磷（AP）呈下降趋势。
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注：不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。下同。
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2.2 土壤测序结果
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采用 USEARCH11-uparse 聚类方式算法，OTU 序列相似度为 97%，分类置信度为 0.7，共完成 15 个土壤样本的多样性数据分析，其中细菌共获得优化序列 583225，平均序列长度 414 bp，OTU 总数 2438 个；真菌共获得优化序列 749122，平均序列长度 236 bp，OTU 总数 1058 个。根据图1 稀释曲线可知，随着测序数量增加曲线趋于平缓，说明已获得绝大部分样本信息，试验数据合理。
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2.3 土壤微生物群落多样性分析
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所有样本覆盖度均在 99.7% 以上，说明测序结果可靠，反映了土壤菌群的真实情况。Chao1 和 ACE 指数用来反映物种丰度。由表2 和表3 可以看出，dif 的施用减少了细菌和真菌丰度，随着 dif 浓度增加，细菌的 Chao1 和 ACE 指数均呈减小趋势；真菌的 Chao1 和 ACE 指数在 dif 较低浓度时略有增大，但随着 dif 浓度升高，又呈现减小趋势。Shannon 和 Simpson 是用来估算样本多样性的指数，Shannon 值越大，说明群落多样性越高，相反，Simpson 值越大，则说明群落多样性越低。细菌中处理组的 Shannon 指数均低于 CK，且随着 dif 浓度增高 Shannon 指数逐渐减小。真菌中处理组的Shannon 指数均高于 CK，Simpson 指数均低于 CK 组，说明 dif 的施用对土壤中细菌和真菌群落多样性的作用相反，即减少了细菌群落多样性，增加了真菌群落的多样性。
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图1 土壤细菌和真菌 Sobs 指数稀释曲线
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注：图 a 为细菌；图 b 为真菌。
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2.4 土壤微生物群落组成分析
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2.4.1 细菌群落组成分析
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所有样本中细菌共检出 31 门、91 纲、206 目、 315 科、553 属；其中门水平相对丰度前 5 位物种包括放线菌门（Actinobacteriota）（49.44%）、变形菌门 （Proteobacteria）（23.37%）、酸杆菌门（Acidobacteriota） （8.23%）、绿弯菌门（Chloroflexi）（5.91%）、拟杆菌门（Bacteroidota）（4.56%），占细菌群类的 91.51%，其中放线菌门和变形菌门相对丰度 >10%，是绝对优势菌门。细菌属水平前 5 位物种包括节杆菌属 （Arthrobacter）（13.18%）、糖丝菌属（Saccharothrix） （7.76%）、链霉菌属（Streptomyces）（5.03%）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）（3.42%）、芽球菌属（Blastococcus）（2.23%）。由图2 可以看出，在门水平上不同处理组优势菌群基本稳定，但相对丰度存在一定差异，C50 组中变形菌门和拟杆菌门的相对丰度分别提高了 14.2% 和 1.81%，而酸杆菌门和绿弯菌门相对丰度分别降低了 8.28% 和 3.44%。在属水平上，高浓度 dif 导致绝对优势菌属节杆菌属相对丰度下降 7.85%，链霉菌属和芽球菌属相对丰度基本无变化，而糖丝菌属和鞘氨醇单胞菌属随着 dif 浓度增加其相对丰度也随之增大。这说明高浓度 dif 的施用对土壤中细菌优势菌群的相对丰度产生了影响。
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图2 土壤细菌群落组成分析
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2.4.2 真菌群落组成分析
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真菌共检测出 11 门、34 纲、79 目、174 科、370 属，其中门水平相对丰度 >1% 的菌门有子囊菌门 （Ascomycota）（85.09%）、担子菌门（Basidiomycota） （9.39%）、被孢霉门（Mortierellomycota）（4.65%），占真菌群类的 99.13%。属水平前 5 位物种包括交链孢霉属（Alternaria）（12.72%）、枝孢霉属（Cladosporium） （11.00%）、裂褶菌属（Schizothecium）（10.87%）、青霉属（Albifimbria）（8.49%）、镰孢菌属（Fusarium） （5.71%）。由图3 可以看出，在门水平上真菌的优势菌群无变化，其中子囊菌门占绝对优势。在属水平上，不同处理组优势菌群的种类和相对丰度均有所变化，相对丰度 >5% 的菌群 CK 中有交链孢霉属、枝孢霉属、青霉属、裂褶菌属和 unclassified_c_ Sordariomycetes，C2 和 C5 处理中为交链孢霉属、枝孢霉属、青霉属、裂褶菌属，C10 和 C50 处理中镰孢菌属相对丰度增加分别为 7.42% 和 7.08%，C50 处理中赤霉属（Gibberella） 和被孢霉属（Mortierella） 逐渐成为优势菌群，相对丰度分别为 6.24% 和 6.59%。
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图3 土壤真菌群落组成分析
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2.5 土壤微生物群落与环境因子相关性
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db-RDA 分析是加入了环境因子约束性的分析，采用 db-RDA 分析可以解决数据类型的限制，并用于分析物种与环境因子之间的关系。菌群与环境因子的关系可以由图4 反映，其中 pH 与样本相关性较小（P>0.05）。由图4a 可以看出，细菌门水平上丰度前 5 位的优势菌群中，放线菌门、变形菌门和酸杆菌门与环境因子具有明显相关性，变形菌门与 TN 呈显著正相关性，与 AN、SOM 和 dif 呈正相关性，酸杆菌门与 AP 和 pH 呈正相关性，而放线菌门与其他环境因子均呈负相关。图4b 中，真菌优势菌门中子囊菌门、担子菌门和被孢霉门与环境因子具有相关性，子囊菌门与 AN、TN 和 dif 呈显著正相关，与 pH 呈显著负相关性，被孢霉门与 AP 呈正相关性，与 SOM 呈显著负相关性，担子菌门与 SOM 和 pH 呈正相关性。
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Alpha 多样性指数与环境因子的相关性系数见表4，其中细菌 Shannon 指数与 TN 和 AN 呈极显著负相关，相关系数分别为-0.963 和-0.968，与 dif 呈显著负相关，相关系数为-0.955。Chao1 和 ACE 指数均与 AN 和 dif 呈显著负相关。真菌 Alpha 多样性指数与环境因子无显著相关性，Chao1 和 ACE 指数与 pH 呈正相关，与其他环境因子均呈负相关， Shannon 指数与 AP 呈负相关。
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图4 基于门水平下土壤菌群和环境因子的 db-RDA 分析
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注：图 a 为细菌；图 b 为真菌。图中不同颜色或形状的点表示不同样本组；红色箭头表示数量型环境因子，蓝色三角表示不同菌门。SOM 为有机质，AN 为碱解氮，AP 为有效磷，TN 为总氮，dif 为苯醚甲环唑。
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注：** 在 0.01 级别（双尾）相关性显著；* 在 0.05 级别（双尾）相关性显著。SOM 为有机质，AN 为碱解氮，AP 为有效磷，TN 为总氮，dif 为苯醚甲环唑。
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3 讨论
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苯醚甲环唑是一种高效广谱杀菌剂，但由于过量使用造成土壤中长期残留所带来的生态环境问题值得关注。微生物群落结构的组成是衡量土壤质量的重要指标[15]，在土壤的物质循环中起着极其重要的作用，农药残留的增加势必会对土壤微生态产生影响。
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本研究发现，苯醚甲环唑的施用减小了土壤中的细菌丰度，与未处理土壤相比，高浓度的苯醚甲环唑降低了细菌的多样性，Zhang 等[7]研究发现，苯醚甲环唑暴露引起了土壤细菌群落多样性的下降，同时表现出浓度依赖性，这与本研究结果一致。苯醚甲环唑暴露下受影响的主要优势菌门为变形菌门、拟杆菌门、酸杆菌门和绿弯菌门，这与薛鹏飞等[16] 研究手性三唑类杀菌剂氟环唑暴露下的主要细菌群落结构的结果一致，其中变形菌门在多数土壤中是优势菌门，被认为是世界上存在最广泛的菌门[17-18]。本研究中低浓度苯醚甲环唑（<10 mg/kg） 处理土壤中相对丰度 >4% 的菌属与未处理土壤基本一致，而高浓度苯醚甲环唑的施用增加了鞘氨醇单胞菌属和类诺卡氏菌属，许天衡[19]研究发现，类诺卡氏菌属在添加高浓度苯醚甲环唑时其相对丰度略高于添加低浓度的处理，Wang 等[20]研究发现，小剂量的苯醚甲环唑对细菌有短暂的抑制作用，通常情况下只有高浓度苯醚甲环唑才会使土壤中细菌群落结构发生较明显改变。苯醚甲环唑的施用减小了真菌丰度，苯醚甲环唑虽然是针对真菌的广谱杀菌剂，但并不能杀灭土壤中的所有真菌，本研究中真菌 Shannon 指数增加，Simpson 指数降低，说明土壤中真菌多样性有所增加，可能是由于对苯醚甲环唑无影响的真菌填补了生态位上的空白所导致[21]。以上说明，苯醚甲环唑的施用对土壤中细菌和真菌丰富度和群落结构均产生了影响。
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微生物与其所在的土壤环境有着密切联系，二者相互影响，相互制约。本研究中施用苯醚甲环唑的土壤中细菌优势菌群变形菌门与 TN 呈显著正相关，变形菌门是土壤细菌中最为庞大的菌群，具有丰富的遗传多样性和广泛的生理代谢功能，对土壤中氮肥的利用具有促进作用[22]。
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4 结论
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经苯醚甲环唑处理的土壤中微生物的丰富度和群落组成均发生了变化，土壤的理化性质也出现改变，说明苯醚甲环唑的施用改变了土壤的微生态结构。高浓度苯醚甲环唑的施用降低了土壤中微生物整体的丰富程度，但细菌变形菌门和拟杆菌门的相对丰度有所提高。真菌中赤霉属和被孢霉属逐渐成为优势菌群。
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经苯醚甲环唑处理的土壤中细菌优势菌群变形菌门与 TN 呈显著正相关性。真菌优势菌门中子囊菌门与 AN、TN 和 dif 呈显著正相关，被孢霉门与 SOM 呈显著负相关；土壤氮素对细菌 Shannon 指数影响较大。
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摘要
为研究三唑类杀菌剂苯醚甲环唑（dif）施用后土壤中微生物群落结构的响应变化，通过模拟生产中的施用剂量，监测 35 d 后土壤的理化性质并利用高通量测序技术分析土壤中细菌和真菌的群落组成变化，通过 db-RDA 分析建立环境因子与微生物群落响应关系。研究结果显示，随着 dif 施用浓度的增加，土壤中有机质 （SOM）、总氮（TN）、碱解氮（AN）均有所提高，有效磷（AP）呈下降趋势，Alpha 多样性指数中细菌 Chao1、 ACE 和 Shannon 指数均低于未处理土壤，真菌 Shannon 指数高于未处理土壤；所有样本中细菌共检出 31 门、91 纲、206 目、315 科、553 属，真菌共检测出 11 门、34 纲、79 目、174 科、370 属；苯醚甲环唑施用浓度为 50 mg/kg 时，土壤细菌中变形菌门和拟杆菌门的相对丰度分别提高了 14.2% 和 1.81%，酸杆菌门和绿弯菌门相对丰度分别降低了 8.28% 和 3.44%，绝对优势菌属节杆菌属相对丰度下降 7.85%，真菌中赤霉属和被孢霉属逐渐成为优势菌群；细菌的优势菌群中变形菌门与 TN 呈显著正相关，真菌优势菌门中子囊菌门与 AN、TN 和 dif 呈显著正相关，被孢霉门与 SOM 呈显著负相关；TN 和 AN 对细菌的 Shannon 指数影响较大。以上说明，高浓度苯醚甲环唑的施用对土壤的理化性质以及微生物的丰富度和群落结构均产生了影响。
Abstract
In order to study the response changes of soil microbial community structure after the application of triazole fungicide difenoconazole（dif），the physical and chemical properties of soil after 35 days were monitored by simulating the application dose in production，and the changes of soil bacterial and fungal community composition were analyzed by high-throughput sequencing technology. The relationship between environmental factors and microbial community response was established by db-RDA analysis. The results showed that with the increase of dif application concentration，organic matter（SOM），total nitrogen（TN）and alkali-hydrolyzed nitrogen（AN）content in soil were increased，while available phosphorus（AP）content showed a decreasing trend，and bacterial Chao1，ACE and Shannon indices in Alpha diversity index were lower than those in untreated soil. The Shannon index of fungi was higher than that of untreated soil. A total of 31 phyla，91 classes，206 orders，315 families and 553 genera of bacteria were detected in all samples，and 11 phyla， 34 classes，79 orders，174 families and 370 genera of fungi were detected. When dif was applied at a concentration of 50 mg/kg，the relative abundances of Proteobacteria and Bacteroidetes in soil bacteria were increased by 14.2% and 1.81%， respectively，the relative abundances of Acidobacteria and chlorocurvula were decreased by 8.28% and 3.44%，respectively， and the relative abundances of Arthrobacter，the absolute dominant bacterium，was decreased by 7.85%. Gibberellus and Mortierella gradually became the dominant group of fungi. Among the dominant bacterial groups，Proteobacteria showed significant positive correlation with TN content，ascomycetes showed significant positive correlation with AN，TN content and dif application concentration，and mortierella showed significant negative correlation with SOM content. TN and AN content had great influence on the Shannon index of bacteria. The above results indicated that the application of high concentration dif had effects on soil physicochemical properties，microbial richness and community structure.
Keywords
farmland soil ； difenoconazole ； high-throughput sequencing ； soil microorganism ； diversity