烟草是我国重要的经济作物，健康的土壤生态系统是烟株正常生长发育的前提。长期施肥、过度耕种和缺乏管理造成土壤退化^[1]，主要表现在土壤养分含量下降^[2]、土壤生物多样性下降和土传病害频发。土壤微生态失衡导致烟叶的产量和质量下降，影响优质烟叶的生产^[3]。

生物炭是生物质在高温低氧的条件下裂解产生的一种疏松多孔且具有丰富含氧官能团的含碳物质^[4]，具有高度芳香化的结构特点，存在于土壤中不易分解，有利于土壤碳积累^[5]。相关研究表明，生物炭能够改变土壤的物理化学性质^[6-7]，影响土壤碳库和土壤碳氮转化过程，提高土壤有机碳含量^[8]。本试验所用的生物炭基肥主要由生物炭和植物油粕等有机物料组成，其中生物炭含量占物料总量的 45% 以上。前人研究表明，生物炭基肥能够显著提升植烟黄壤有机质和速效养分含量^[9]，增强土壤酶活性，加速土壤的能量流动和物质循环^[10]。真菌作为土壤生态系统中不可或缺的一部分，在调节土壤碳库和改善土壤结构方面起着至关重要的作用。涂坤^[11]研究发现，土壤真菌能够分解有机质释放养分，调控土壤碳循环。王义祥等^[12]在探究生物炭对酸化茶园真菌群落结构的影响时发现，高生物炭施用量对非优势真菌丰度的增加效果高于优势真菌，有利于真菌群落 α 多样性提高。汪坤等^[13]研究表明，生物炭基肥处理能够增加土壤有机质、速效养分的含量以及土壤酶活性。因此，生物炭基肥对土壤改良有促进作用。

农田土壤固碳培肥是提升耕地质量和作物产量、质量的关键途径。烤烟作为陕西省商洛市的主要经济作物，由于受土地面积和耕作方式的影响，连作现象十分普遍，致使土壤有机质含量降低，养分利用率低、产量和品质下降等问题日益突出。土壤有机质含量和养分利用率低已经成为制约商洛烟区特色经济作物高质量发展的主要问题。商洛烟区位于秦岭腹地，烟草是当地重要的经济作物，已经有 40 年种植历史，是南水北调的水源涵养地。鉴于上述问题，探究以减氮增碳为目标的植烟土壤保育施肥方式具有重要的理论和实践意义。目前的研究大多在于探究施用生物炭后环境因子和土壤细菌群落结构的相互作用关系，而生物炭基肥对土壤真菌群落，尤其是功能微生物的研究相对较少。因此，本试验以烤烟根际土壤为研究对象，在烟苗移栽后 75 d 采集根际土壤样品，采用 18S rRAN 高通量测序技术，对土壤养分和真菌群落结构进行分析，探究施用生物炭基肥后植烟土壤养分含量和真菌群落结构的变化趋势，以期为我国秦岭植烟土壤养分高效利用和根际真菌微生物群落结构调控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

本试验于 2021 年 4—9 月在陕西省秦岭烟区 （34.10°N，110.13°E）进行，该地区属温带季风性气候，夏季高温多雨，冬季寒冷干燥。供试烤烟品种为云烟 87，由洛南县烟草公司提供。烟区常年连作，黄褐土为当地主要植烟土壤类型，试验地土壤基本理化性质为：pH 7.13、有机质（SOM） 20.12 g·kg^-1、速效钾（AK）224.62 mg·kg^-1、碱解氮（AN）120.45 mg·kg^-1、有效磷（AP）42.36 mg·kg^-1。生物炭基肥（河南省生物炭工程技术中心研制）主要包含生物炭和植物油粕等原料，其基本理化性质：有机质 45.20%，N 1.02%，P₂O₅ 1.12%，K₂O 2.90%。

1.2 试验设计

本试验采取随机区组设计，试验设置 2 个处理，分别为：常规施肥（CK），750 kg·hm^-2 生物炭基肥 + 常规施肥减氮 10%（ST），每个处理 3 次重复。常规施肥：烟草专用有机肥 600 kg·hm^-2，烟草复合肥 1125 kg·hm^-2，K₂SO₄（51%）375 kg·hm^-2，氮磷钾比值（N∶P₂O₅∶K₂O）为 1∶1.08∶3.08。试验地面积为 1332 m²，每个小区面积为 222 m²，共 6 个小区。烟苗移栽垄间距为 1.1 m，株距为 0.5 m。所有肥料在烟株移栽前作为基肥以条施的方式一次性施入土壤。各处理的田间管理措施与当地优质烟叶生产技术规范保持一致。

1.3 土壤样品采集

在烟苗移栽后 75 d，采用 5 点取样法收集深度为 0～30 cm 的烤烟根际土壤作为土壤样品，每个处理各取 3 株。具体操作方法：铲子用酒精消毒后，将烟株周围 10 cm 土壤挖至 30 cm 深度，挖出整个烟株根部，除去动植物残体、碎石以及其他杂质。取靠近根部的根际土壤，混匀过筛后，使用 10 mL 无菌离心管取部分根际土壤样品，用干冰保存送往上海美吉生物医药科技有限公司进行微生物多样性的检测；用自封袋收集另一部分根际土壤样品保存于 4℃冰箱中进行土壤酶活的检测；最后将剩下的根际土壤样品放置在常温条件下自然风干，研磨后过筛，用于土壤物理化学性质的检测。

1.4 土壤理化性质及酶活分析

参考鲍士旦^[14]的《土壤农化分析方法》对土壤理化性质进行测定：采用 pH 计（PSH-3C）测定土壤 pH，pH 的标准溶液用标准物质按规定配制。土壤有机质含量的测定采用浓硫酸-重铬酸钾外加热法，即在加热条件下，重铬酸钾-硫酸溶液氧化有机质，用硫酸亚铁溶液返滴定剩余重铬酸钾。土壤中碱解氮的含量使用碱解扩散法测定，用碱溶液水解土壤产生 NH₃，使用 H₃BO₃ 吸收后再用标准酸溶液直接滴定 NH₃。使用 NaHCO₃ 法测定有效磷的含量，测定过程中利用同离子效应降低溶液中钙的浓度。使用 NH₄OAc 浸提土壤样品后，用火焰光度法测定土壤速效钾含量。

过氧化氢酶活性的测定采用高锰酸钾滴定法，即用 KMnO₄ 标准溶液直接滴定土壤中的 H₂O₂。采用磷酸苯二钠比色法测定土壤中的中性磷酸酶活性。脲酶先经过一定反应生成氨，通过测定氨的含量，得到脲酶含量。使用比色法测定土壤中蔗糖酶的含量，蔗糖水解产物与某种物质发生化学反应生成有色物质，通过与系列标准葡萄糖溶液进行比色测得土壤中蔗糖酶含量。

1.5 DNA 的提取和 Illumina 测序

使用 E.Z.N.A.®soil 试剂盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）提取土壤样本的 DNA，利用 1 % 的琼脂糖凝胶电泳检测抽提得到的基因组 DNA。在指定区域合成带有 barcode 的特异引物后，使用 ABI GeneAmp® 9700 型的 PCR 仪对提取的 DNA 片段进行扩增，DNA 扩增过程中的聚合酶是 TransGen AP221-02 聚合酶。使用 2% 琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物后，使用蓝色荧光定量系统（QuantiFluor^TM-ST）对 PCR 扩增产物进行定量。经 Miseq 文库构建后，使用 PCR 技术扩增提取的土壤样本 DNA 片段产生 DNA 簇，通过荧光标记并收集荧光信息，最后获得 DNA 片段序列信息。

1.6 数据分析

使用 Excel 2019 处理原始数据，SPSS 27.0.1 进行单因素方差分析和双因素相关性分析。热图相关性分析、主成分分析图以及真菌群落相对丰度弦图分别使用 R 4.2.0 中的 pheatmap、factoextra、 circlize 程缉包绘制。R 4.2.0 中的 ggplot2 程缉包绘制土壤酶活性柱状图和真菌群落功能分析堆积柱状图。

2 结果与分析

2.1 生物炭基肥对植烟土壤理化性质的影响

由表1 可知，施用生物炭基肥后，烤烟根际土壤的 pH、有机质、碱解氮、有效磷、速效钾的含量均显著高于 CK，分别较 CK 显著提升 8.55%、 22.36%、14.42%、15.43%、17.36%。

注：同列不同小写字母表示在 P<0.05 水平下存在显著性差异。下同。

2.2 生物炭基肥对植烟土壤酶活性的影响

由图1 可知，施用生物炭基肥后过氧化氢酶活性、蔗糖酶活性以及脲酶活性均显著高于 CK，而中性磷酸酶活性与 CK 相比显著降低。过氧化氢酶活性、蔗糖酶活性以及脲酶活性分别较 CK 显著升高 26.36 %、28.17%、17.28 %。 ST 处理中性磷酸酶的活性与 CK 相比显著降低 33.90 %。

注：* 表示在 P<0.05 水平下处理间存在显著性差异。

2.3 烤烟根际土壤样品基因测序数据

利用高通量测序技术，经双端序列质控拼接后共测得 6 个烤烟根际土壤样本的有效基因序列为 514133，样本中测得序列平均长度为 381 bp。按照 97% 相似性对非重复序列进行 OTU 聚类，共测得 6 个土壤样本的 OTU 为 311 种，共有的 OTU 为 52 种。由图2a 可知，ST 各处理的 OTU 数均高于 CK，表明生物炭基肥能够增加真菌群落的丰富度。稀释曲线用来评估测序深度是否具有合理性。植烟土壤样本稀释曲线（图2b）表明，当测序深度达到 30000 时，逐步扩大测序深度稀释曲线斜率变化较小，增加测序深度不会导致 sobs 急剧增加。因此，测序深度和测得的数据合理，能够满足后续分析要求。

注：图 a 为样本 Veen 图；图 b 为样本稀释曲线图。

2.4 生物炭基肥对烤烟根际土壤真菌 α 多样性和 β 多样性的影响

主成分分析通过几个主成分来体现土壤真菌群落多维数据下的特征，因此，通过 PCA 图可以观察到不同的组间差异。由图3 可知，第一主成分可以解释原始数据集 76% 的特征，第二主成分可以解释原始数据集 15% 的特征。施加生物炭后，ST 处理与 CK 处理相距较远，表明 ST 处理和 CK 处理的真菌群落结构存在明显的差异。样本测序覆盖率达到 99% 以上，表明测序深度合理。由表2 可知， ST 处理的 Ace 指数、Chao 指数、Shannon 指数和 Sobs 与 CK 相比均有显著性差异，分别较 CK 显著增加了 47.76%、51.41%、24.25%、47.19%，Simpson 指数与 CK 相比显著降低 50.00%，表明生物炭基肥能够增加根际土壤真菌群落的 α 多样性。

2.5 生物炭基肥对植烟土壤真菌群落结构的影响

由图4a 可知，子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、毛霉菌门（Mucoromycota） 的相对丰度占门水平下真菌群落相对丰度的 75% 以上，其中子囊菌门的相对丰度占门水平下真菌群落相对丰度高达 50%。施用生物炭基肥后 ST 处理的子囊菌门、担子菌门、毛霉菌门的相对丰度较 CK 分别降低 4.16 %、44.07 %、38.65 %。而未分类超类群（SAR_k_norank）、芽枝菌门 （Blastocladiomycota）、未分类的真菌类群（unclassified_k_Fungi）的相对丰度与 CK 相比均明显升高。

由图4b 可知，施用生物炭基肥后，ST 处理的毛壳菌属（Chaetomium）、木拉克酵母菌属（Mrakia）、短柄菌属（Solicoccozyma）、未分类的毛霉菌属 （norank_p_Mucoromycota）、枯草菌属（Boeremia）的相对丰度均低于 CK，而未被定义的座囊菌属（unclassified_ c_Leotiomycetes）、镰刀菌属（Fusarium）、未分类的肉座菌属（unclassified_o_Hypocreales）的相对丰度分别较 CK 增加 70.53%、229.38%、166.28%。

注：图 a 为门水平；图 b 为属水平。

2.6 烤烟根际土壤理化性质与门水平下真菌群落结构的相关性分析

土壤理化性质与优势菌门相关性分析 （ 图5）表明，土壤 pH、有机质、碱解氮、速效钾以及有效磷的含量与芽枝菌门、捕虫霉门 （Zoopagomycota）、LKM15、未分类超类群、未分类真菌类群和 Aphelidea 均呈正相关关系，其中未分类超类群与 pH、速效养分的含量呈显著正相关关系，Aphelidea 与有效磷的含量呈显著正相关关系。担子菌门和毛霉菌门与 pH、有机质、速效钾、有效磷和碱解氮均呈负相关关系，其中毛霉菌门（Mucoromycota）与有机质、速效钾、有效磷和碱解氮均呈显著负相关关系。

2.7 生物炭处理后烤烟根际土壤真菌功能预测分析

FUNGuild 是一种根据真菌功能进行分类的工具，通过将真菌群落中具有相似功能的真菌划分为一类，最终得到具有某种功能真菌在样本中的丰度信息。由图6a 可知，在植烟土壤根际土壤中共有 7种真菌营养类型，其中，病理-腐生-共生营养型和腐生营养型真菌占可鉴定菌的 40% 以上，是真菌群落主要的功能类型。ST 处理的病理营养型真菌的相对丰度与 CK 相比减少了 51.28 %。由图6b 可知，CK 和 ST 处理中可鉴定菌相对丰度占比超过了 45%。动物病原-粪便腐生-植物内生-附生植物-植物腐生-木材腐生、未定义的腐生菌以及植物内生菌是植烟土壤根际主要的功能微生物，分别占真菌群落的 23.24%、11.57%、4.94%。生物炭基肥对未定义的腐生菌、动物病原-内生植物-地衣寄生虫-植物病原-土壤腐生菌-木材腐生菌、粪腐菌-外生菌根-土壤腐菌-木材腐菌和动物病原真菌有一定的促进作用，其中未定义的腐生菌作为优势功能菌与对照相比增加了 2.80%。

注：* 表示 P<0.05。

3 讨论

3.1 生物炭基肥对土壤理化性质和酶活性影响分析

本试验使用的生物炭基肥由生物炭、油粕等有机物料组成，含有丰富的有机物质。在植烟土壤中施用生物炭基肥能够改变土壤的物理化学性质。汪坤等^[13]研究表明，施用生物炭基肥能够增加植烟土壤有机质、速效钾、有效磷以及碱解氮含量。Gao 等^[15]研究表明，土壤 pH 和速效养分含量在使用生物炭基肥均有所增加。本试验研究表明，施用生物炭基肥的植烟土壤物理化学性质均得到明显改善，pH、有机质以及速效养分含量均显著高于 CK，与前人研究结果一致。有机质含量表征土壤碳排放量的多少，结果表明，生物炭能够减少土壤碳排放，增加土壤有机质含量^[16]。施用生物炭基肥后土壤速效养分含量提高，一方面可能与生物炭疏松多孔的物理性质有关，微生物良好生长发育环境增强土壤酶的活性，间接促进了土壤矿质养分从结合态向游离态的转化，另一方面是生物炭的吸附解析作用增加了土壤养分的固持作用^[17]。土壤 pH 升高可能是因为生物炭含有大量的碱性物质，本身呈碱性，在土壤溶液中能够发生碱性反应^[18]。

冯慧琳等^[19]的研究表明，施用生物炭后土壤中过氧化氢酶、脲酶以及蔗糖酶的活性与 CK 相比显著提高，并且在施用 1.2 t·hm^-2 生物炭后酶活性达到最大值。Song 等^[20]发现，生物炭处理能够提高土壤碳氮循环相关酶的活性，与本试验研究结果一致。本试验结果表明，ST 处理的过氧化氢酶、蔗糖酶和脲酶活性较 CK 显著提高。Ahmad 等^[21] 研究表明，土壤碳循环或生物炭热解过程也可能会造成过氧化氢酶和蔗糖酶活性高于对照。这可能是由于生物炭含有大量碱性物质，施入土壤后碱性离子能够与重金属发生离子交换作用，降低重金属的生物活性，从而减少重金属对土壤酶的毒害作用^[22]。

3.2 生物炭基肥对植烟土壤真菌群落的影响及相关性分析

生物炭基肥能够改善植烟土壤的通气性和保水性，为土壤真菌提供了更好的生长环境^[23]。与 CK 相比，生物炭基肥处理后显著增加了 Ace 指数、 Chao 指数和 Shannon 指数，显著降低了 Shannon 指数，这与高文慧等^[23]的研究结果一致，生物炭基肥能够显著增加真菌 α 多样性。主成分分析结果显示，ST 和 CK 处理的真菌群落结构存在明显差异，这表明生物炭基肥能够改变根际土壤真菌的群落结构，降低某些优势真菌的相对丰度，使根际土壤真菌群落 α 多样性增加。本试验研究发现，子囊菌门、担子菌门、毛霉菌门、芽枝菌门为根际土壤真菌的优势菌门，毛壳菌属、木拉克酵母菌属以及短柄菌属为根际土壤真菌的优势菌属，这与郭晓雯等^[24]的研究结果一致。生物炭基肥能够明显增加芽枝菌门、捕虫霉门和镰刀菌属（Fusarium）的相对丰度。一方面可能是生物炭基肥中含有一定量的营养物质，如有机质以及氮磷钾等为微生物生长发育所必须的能量物质^[25]，另一方面可能是多孔的生物炭成分具有巨大的比表面积，为土壤微生物提供生存空间和适宜的生存环境，影响真菌群落的群落结构。

对土壤 pH、有机质含量和土壤养分含量与门水平下真菌类群进行相关性分析。本研究表明，土壤 pH、有机质含量和土壤养分含量与芽枝菌门、捕虫霉门、LKM15、未分类超类群、未分类真菌类群和 Aphelidea 均呈正相关关系，与担子菌门和毛霉菌门呈负相关关系。前人^[26]研究表明，土壤环境因素是真菌群落构建过程中起主导作用的关键因素，并且土壤有机质含量、有效磷和碱解氮含量能够显著影响真菌群落结构。此外，生物炭基肥能够显著改变土壤真菌群落结构，并且土壤速效钾、有效磷和碱解氮含量与真菌群落显著相关^[27]。这表明植烟根际土壤真菌群落结构受多种环境因子共同调节，生物炭基肥可以通过改变植烟根际土壤化学性质间接调控真菌群落结构。

3.3 烤烟根际土壤真菌功能预测分析

FUNGuild 分析结果表明，病理-腐生-共生营养型和腐生营养型真菌是真菌群落主要的功能类型。本试验研究结果表明，施用生物炭基肥后，ST 处理的腐生营养型真菌的相对丰度高于对照，这与Chen 等^[28]的研究结果一致。一方面可能是生物炭基肥通过改变土壤的理化性质影响植烟土壤真菌的群落结构组成，腐生营养型真菌的相对丰度增加； 另一方面可能是有机质是腐生营养型真菌的营养来源，生物炭基肥能够显著提升土壤有机质含量，腐生营养型真菌的相对丰度随有机质含量的增加而升高。病理营养型真菌的丰度明显小于对照，说明生物炭基肥对预防植物病害有一定的作用，这与李茂森等^[29]的研究结果一致。

4 结论

生物炭基肥能够显著提升植烟土壤养分的含量以及提高土壤酶活性。施用生物炭基肥后，烤烟根际土壤真菌的 Ace 指数、Chao 指数和 Shannon 指数显著增加，Simpson 指数显著降低。烤烟根际土壤理化性质的改变能够影响根际土壤真菌群落结构，降低子囊菌门、担子菌门和毛霉菌门等优势菌门的相对丰度。多样性指数和优势菌门相对丰度的变化表明，生物炭能够增加烤烟根际土壤的 α 多样性，增加根际土壤有益功能真菌的相对丰度。基于此，生物炭基肥能够影响土壤微生态，具有提高土壤养分含量、增加土壤固碳培肥潜力的作用。另外，能够显著调节烟株根际微生物群落结构，增加优势微生物相对丰度，促进土壤中养分与碳转化，并降低病理营养型真菌的相对丰度，增强烟株抗性。

参考文献