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甘蓝（Brassica oleracea L .）又被称为卷心菜、莲花白，由于其抗病、耐寒、产量高等优点在全国范围内广泛种植，也由于其富含维生素、口感佳，成为人们餐桌上的主要叶类蔬菜作物之一[1-2]。据统计，目前中国甘蓝年种植面积约 90 万 hm2，在蔬菜年度供应和出口贸易中占有重要地位[3]。甘蓝生产需要大量的化肥投入，而化肥的大量施用容易造成土壤板结、酸化、肥力下降、地下水污染等一系列的生态和环境问题[4-6]。如何在保证甘蓝产量的情况下减少化肥的投入量或者提高肥料的利用率引起了众多学者的关注。
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黄腐酸是一种植物生长促进剂，由于其分子量小，含有氨基、羟基等多种活性官能团，且有易于被植物吸收利用等特殊性质[7-8]，广泛应用于黄瓜[9]、番茄[10]、辣椒[11]、生菜[12]等蔬菜作物的实际生产中，被证明具有提高元素的利用效率，改善土壤理化性质，促进植物生长发育，提升作物产量等作用[13]。土壤微生物是土壤肥力的重要指标，土壤细菌作为土壤微生物的重要组成部分，其种类和丰度的变化都会对土壤环境造成影响，在植物对元素的吸收和利用方面也发挥着巨大的作用[14]。例如，固氮细菌（如根瘤菌）能够促进土壤氮素固持，硝化细菌（如硝化杆菌和硝化螺旋菌）能够促进土壤硝化，增加硝态氮的供给，解磷细菌（如芽孢杆菌、伯克氏菌）能够将难溶的磷转化为易于被植物吸收利用的有效磷[15-17]。张晓宇等[18]的研究结果表明，黄腐酸能够显著提高辣椒根际土壤放线菌和细菌数量，张丽丽等[19]在对番茄根际土壤细菌的研究中发现，添加黄腐酸后能够提高细菌的多样性。
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虽然黄腐酸在蔬菜生产中被大量研究，但在甘蓝种植中的应用研究以及同时结合肥力条件、土壤细菌的综合研究少见报道，本研究以甘蓝‘优贝特’为研究材料，在四川省农业科学院狮子山片区露地试验园进行试验，研究添加黄腐酸对不同肥力水平下土壤细菌多样性、甘蓝养分吸收和产量的影响，探究黄腐酸对甘蓝的作用机制，以期丰富相关研究，为甘蓝的高产提供依据。
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1 材料与方法
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1.1 试验材料
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试验于 2022 年 9—11 月在四川省农业科学院狮子山片区露地试验园进行，供试的甘蓝品种为 ‘优贝特’。
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1.2 试验设计
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根据是否施底肥与是否添加黄腐酸设置 4 个处理，分别为施底肥 + 黄腐酸（H-FA）、施底肥 （H-CK）、不施底肥 + 黄腐酸（L-FA）、不施底肥（L-CK），每个处理 3 次重复。底肥采用氮磷钾复合肥（15-15-15，史丹利）和尿素，均按照 24.45 kg·hm-2 进行施入，施入后的土壤肥力为硝态氮 139.56 mg·kg-1、铵态氮 10.63 mg·kg-1、有效磷 154.90 mg·kg-1、速效钾 81.39 mg·kg-1。不施底肥的土壤肥力为硝态氮 125.10 mg·kg-1、铵态氮 3.45 mg·kg-1、有效磷 83.50 mg·kg-1、速效钾 65.00 mg·kg-1。黄腐酸（85%）浓度为 500 mg·L-1，在 10 月 8、17 和 24 日分 3 次施入，每次对每株甘蓝进行灌根 20 mL，1 株甘蓝总计施入黄腐酸 30 mg。
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1.3 测定项目与方法
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1.3.1 土壤细菌高通量测序
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在 3 次黄腐酸施入结束后 7 d，对甘蓝根际土壤进行采样，送至派森诺生物科技有限公司进行基于 Illumina Novaseq 平台的细菌 16S rRNA V3～V4 可变区的高通量测序。
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1.3.2 植株生物量和养分测定
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当甘蓝成熟采摘时在每个处理的各个重复中随机取 2 株甘蓝，分别称量地上部和地下部鲜重，每个处理取一部分甘蓝地上部于烘箱中 105℃杀青 0.5 h 后，65℃烘干至恒重，用于测定干物质含量和氮、磷、钾元素含量。全氮含量采用凯氏定氮法测定，全磷采用钒钼黄比色法测定，全钾采用火焰光度计测定，均参照鲍士旦[20]的方法进行测定。
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1.3.3 相关指标计算公式
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甘蓝地上部氮（磷、钾）累积量（g·株-1）= 植株地上部全氮（磷、钾）含量 × 单株干物质量[21]；氮（磷、钾）生理利用效率（kg·kg-1）= 单株重量 / 地上部总氮（磷、钾）累积量[22]。
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1.4 数据分析
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利用 DADA2 和 USEARCH 对原始双端测序数据进行序列去噪和聚类，将有效序列基于 Silva_132 数据库进行物种分类学注释。通过比较 Alpha 多样性指数和主成分分析（Principal components analysis，PCA）来评估不同肥力条件下添加黄腐酸对土壤细菌多样性的影响，同时以 LEfSe（LDA Effect Size）分析不同处理的组间物种差异和标志物种。以上数据分析制图均利用派森诺基因云平台（https://www.genescloud.cn/）。试验数据用 Excel2010 进行整理，用 SPSS 20.0 进行单因素方差分析 （one-way ANOVA），差异显著性检验采用 Duncan 新复极差法。
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2 结果与分析
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2.1 不同肥力条件下添加黄腐酸对土壤细菌多样性的影响
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2.1.1 土壤细菌 OTU 聚类分析
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为研究不同处理共有和独有的物种数，使用 OTU 丰度表制作韦恩图进行群落分析，结果如图1 所示。添加黄腐酸后检测到的 OTU 数减少，说明添加黄腐酸后土壤细菌的种类减少。4 个处理共有的 OTUs 有 1394 个。施底肥的 H-CK 和不施底肥的 L-CK 处理共有的 OTUs 有 826 个，施底肥添加黄腐酸（H-FA）和不施底肥添加黄腐酸（L-FA） 处理共有的 OTUs 有 733 个。在施底肥后添加黄腐酸（H-FA）和未添加黄腐酸（H-CK）共有的 OTUs 有 505 个，而不施底肥（L-CK）和不施底肥添加黄腐酸（L-FA）共有的 OTUs 有 952 个。
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图1 不同处理土壤细菌韦恩图
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2.1.2 Alpha 多样性
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Alpha 多样性指数用 Chao1、Observed species、 Shannon 和 Simpson 指数表示，其中 Chao1 和 Observed species 指数越大，说明细菌物种丰富度越高， Shannon 和 Simpson 指数越大说明土壤细菌多样性越高。不同处理土壤细菌的 Alpha 多样性指数见表1。添加黄腐酸后，对不同施肥水平的土壤细菌丰富度和多样性无显著影响。
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注：同列不同小写字母表示不同处理间差异显著（P<0.05）；n=3。下同。
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2.1.3 主成分分析
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为明确不同处理中土壤细菌群落结构的差异，基于 OTU 水平绘制主成分分析图，结果如图2 所示。解释度最大的两个主成分 PC1 和 PC2，两者相加为 65.6%，可在此累计方差上解释土壤细菌群落结构的变化。图2 中 H-FA 处理与其余 3 个处理距离较远，与 H-CK 处理有明显区别，L-FA 与 L-CK 处理也存在明显区别，但是 H-CK 和 L-CK 处理距离相近，区别较小。由此可见，无论是否施加底肥，添加黄腐酸可以影响土壤细菌的群落组成，而不同肥力条件对土壤细菌群落的影响略小。
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图2 土壤细菌群落 PCA 分析
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2.1.4 土壤细菌物种差异与标志物种分析
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为筛选黄腐酸作用的物种差异和标志菌种，对不施肥和施肥处理进一步做 LEfSe 分析，结果见图3 和图4。在未施底肥的情况下，添加黄腐酸后 （L-FA）在变形菌纲（Proteobacteria）下的黏球菌目 （Myxococcales）中的 Haliangiaceae 科和 Haliangium 属的丰度更高；地嗜皮菌科（Geodermatophilaceae）、伯克氏菌科（Burkholderiaceae）中的马赛菌属 （Massilia）和沙壤土杆菌属（Ramlibacter）的丰度更高（图3）。
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图3 不施底肥土壤细菌群落 LEfSe 分析
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图4 施底肥土壤细菌群落 LEfSe 分析
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施底肥的条件下，添加黄腐酸后（H-FA）拟杆菌门（Bacteroidetes）和变形菌门（Proteobacteria） 丰度提高，在嗜酸杆菌门（Acidobacteriia）下的索力氏菌纲（Solibacterales）、拟杆菌门（Bacteroidetes） 中的噬几丁质菌目（Chitinophagales）和鞘氨醇杆菌目（Sphingobacteriales） 丰度提高； 黏球菌目 （Myxococcales）中的 Haliangiaceae 科中 Haliangium 属，芽单胞菌属（Gemmatimonas）、Saccharimonadales 属、红游动菌属（Rhodoplanes）丰度高于 H-CK 处理，但在 H-CK 处理中硝化螺旋菌科（Nitrospiraceae） 与硝化螺旋菌属（Nitrospira）的丰度比添加了黄腐酸的处理高（图4）。
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2.2 不同肥力条件下添加黄腐酸对甘蓝养分吸收利用和生长状况的影响
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2.2.1 甘蓝养分积累量与生理利用率
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为分析不同肥力条件下添加黄腐酸对甘蓝养分累积和利用的影响，根据前文所述公式计算甘蓝植株的养分积累量和生理利用率，结果如表2 所示。施底肥条件下，添加黄腐酸能显著提高氮和磷的生理利用效率，H-FA 处理氮和磷生理利用效率分别为（341.00±8.34）和（2296.98±47.49） kg·kg-1，分别为 H-CK 处理的 1.11 和 1.07 倍。未施底肥条件下，添加黄腐酸后植株地上部氮、磷、钾积累量均显著高于对照，分别是对照的 1.25、 1.36、1.39 倍。与 H-CK 处理相比，L-FA 处理植株地上部氮和钾积累量无显著差异，但是氮、磷和钾生理利用效率显著增加，分别增加 7.80%、16.57% 和 8.72%。
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2.2.2 甘蓝生长状况
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不同处理甘蓝的生长状况如表3 所示。添加黄腐酸显著提高了甘蓝地上部和地下部鲜重，施底肥条件下，与对照相比分别增加了 15.8% 和 20.7%； 未施底肥条件下，与对照相比分别增加了 16.2% 和 7.7%。施底肥和未施底肥条件下，添加黄腐酸对地上鲜重 / 地下鲜重无显著影响。与 H-CK 处理相比，L-FA 处理对地上部鲜重和地上鲜重 / 地下鲜重无显著影响，地下部鲜重是 H-CK 处理的 1.21 倍。综上所述，添加黄腐酸能显著增加甘蓝地上和地下部分的鲜重。
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3 讨论
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添加黄腐酸会对土壤微生物群落造成一定的影响，如在小麦的相关研究中发现，添加黄腐酸后小麦根际土壤中的细菌和真菌数量增加[23]，但在人参相关研究中提出添加黄腐酸或腐殖酸后土壤微生物丰度没有显著差异[24]，本研究也发现添加黄腐酸对甘蓝根际土壤细菌丰富度和多样性无显著影响。不同施肥水平下添加黄腐酸后，甘蓝根际土壤中 Haliangium 的丰度提高，Haliangium 是植物促生细菌，可以促进植物的生长[25]，因此，甘蓝的单株重量显著增加。
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未施底肥的处理中，添加黄腐酸提高了甘蓝根际土壤中伯克氏菌科的丰度，伯克氏菌是一种解磷细菌，可以把土壤中植物难以吸收的磷转化为可以被植物吸收利用的形态[26]。同时，马赛菌属和沙壤土杆菌属丰度也有所增加，马赛菌属具有解磷的能力，不仅可以提高土壤中的有效磷含量，并且还能够改善土壤环境[27]，沙壤土杆菌属细菌磷酸酶活性高，能够促进土壤中有机磷的矿化和磷脂的水解，增加土壤中磷酸盐的含量，对植物生长有益[28-29]。在施肥条件下，添加黄腐酸后，索力氏菌纲丰度显著增加，芽单胞菌属和 Saccharimonadales 属在土壤中的相对丰度也显著提高，这些细菌对于磷的生物累积、无机磷的增溶以及有机磷的矿化具有非常重要的作用[30-32]。甘蓝根际土壤中解磷细菌如马赛菌属和 Saccharimonadales 等丰度的增加，导致了土壤中可利用磷的含量增加，所以未施底肥添加黄腐酸后，增加了甘蓝地上部分磷的积累量，在施底肥的条件下，添加黄腐酸增加了磷的生理利用效率。硝化螺旋菌属具有硝化作用[33]，红游动菌属则与反硝化相关[34]，虽然施底肥处理添加了黄腐酸后，土壤中硝化螺旋菌属丰度有所降低，红游动菌属丰度提高，会降低土壤中亚硝酸盐氧化成硝酸盐的能力，减少硝酸盐的含量，但是磷的增多促进了甘蓝根系的生长[35]。本试验不同施肥条件下，添加黄腐酸后甘蓝根生物量也比对照显著增加，正因为甘蓝根的增多，促进了植株对氮、磷、钾元素的吸收，相比对照，氮和钾积累量均显著增加，有更多的营养物质用于自身的生长，最终导致甘蓝单株生物量的增加。
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与施底肥未添加黄腐酸处理相比，未施底肥添加黄腐酸处理的氮、磷和钾生理利用效率和根生物量均显著提高，单株地上部分生物量也高于施底肥未添加黄腐酸处理。由此可见，黄腐酸通过促进甘蓝根系生长，从而促进产量的增加；在适当减少肥料施用的前提下添加黄腐酸可以实现减肥不减产。
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4 结论
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本研究通过设置不同施肥水平和是否施用黄腐酸来研究不同肥力条件，探讨黄腐酸对土壤细菌多样性、甘蓝养分吸收及产量的影响，得出以下结论：
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（1）黄腐酸的施用和施肥水平对土壤细菌的物种丰富度和群落多样性无显著影响，但添加黄腐酸提高了解磷细菌和促生细菌的相对丰度；
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（2）添加黄腐酸主要增加了甘蓝根生物量，从而提高养分吸收利用率，实现产量的增加；
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（3）添加黄腐酸的“促根减肥”技术是一种作物“减肥稳产”的有效措施。
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摘要
为探究不同肥力条件下添加黄腐酸对土壤细菌多样性、甘蓝养分吸收和产量的影响，试验以甘蓝‘优贝特’品种为研究材料，共设置 4 个处理：施底肥 + 黄腐酸（H-FA）、施底肥（H-CK）、不施底肥 + 黄腐酸（L-FA）、不施底肥（L-CK），1 株甘蓝总计施入黄腐酸 30 mg。结果表明，黄腐酸的施用和肥力对土壤细菌的物种丰富度和群落多样性无显著影响，但添加黄腐酸提高了解磷细菌和促生细菌的相对丰度。施底肥条件下，添加黄腐酸能显著提高氮和磷的生理利用效率，H-FA 处理氮和磷生理利用效率分别为（341.00 ± 8.34）和 （2296.98±47.49）kg·kg-1，分别为 H-CK 处理的 1.11 和 1.07 倍。未施底肥条件下，添加黄腐酸后植株地上部氮、磷、钾积累量均高于对照。添加黄腐酸显著提高了甘蓝地上部和地下部鲜重，施底肥条件下，与对照相比分别增加了 15.8% 和 20.7%，未施底肥条件下，与对照相比分别增加了 16.2% 和 7.7%。因此，黄腐酸通过促进甘蓝根系生长，从而促进甘蓝产量的增加，添加黄腐酸是实现减肥不减产的有效措施。
Abstract
In order to explore the effects of adding fulvic acid under different fertility conditions on soil bacterial diversity， nutrient absorption，and yield of cabbage，the cabbage variety‘Youbeite’was used as the research material. A total of 4 treatments were set up in the experiment：Base fertilizer application+fulvic acid（H-FA），Base fertilizer application（H-CK），No application of base fertilizer + fulvic acid（L-FA），No application of base fertilizer（L-CK）. A total of 30 mg of fulvic acid was applied to per cabbage plant. The application of fulvic acid and the level of fertility did not significantly affect the species richness and community diversity of soil bacteria，but the addition of fulvic acid improved the relative abundance of phosphorus bacteria and growth promoting bacteria. Under the condition of applying base fertilizer，adding fulvic acid significantly improved the physiological utilization efficiency of nitrogen and phosphorus. The physiological utilization efficiency of nitrogen and phosphorus in H-FA was（341.00 ± 8.34）and（2296.98 ± 47.49）kg·kg-1 ，respectively， which was 1.11 and 1.07 times than that of H-CK，respectively. Under the condition of not applying base fertilizer，the accumulation of nitrogen，phosphorus，and potassium in the aboveground part of the plant after adding fulvic acid was higher than that of the control. The addition of humic acid significantly increased the fresh weight of the aboveground and underground parts of cabbage. Under the condition of applying base fertilizer，it increased by 15.8% and 20.7%，compared to the control，respectively. Under the condition of not applying base fertilizer，it increased by 16.2% and 7.7%，compared to the control，respectively. In conclusion，fulvic acid can promote the growth of cabbage roots，thereby increasing cabbage yield. Adding humic acid is an effective measure to reduce fertilizer input without reducing cabbage yield.
Keywords
fulvic acid ； cabbage ； bacterial diversity ； nutrient absorption ； yield