石油是最重要的能源之一，也是生产各类石化产品的主要原料，被称为“现代工业的血液”，其在全球范围内的采掘量及需求量均不断增加^[1]。然而，石油的勘探、开采、加工、运输及意外渗漏导致石油污染事件频繁发生^[2]，即大量难降解和持久存在的石油烃类污染物被释放到自然环境当中^[3]。石油对土壤的污染一般会集中在 20 cm 左右的表层，而土壤表层是植物根系最为发达的区域^[4]。积聚在土壤中的石油烃对大多数植物具有胁迫作用，其在降低作物发芽率、抗性，延长生长周期的同时加速植物乙烯的生成^[5]。此外，石油类物质进入土壤后，不仅会在土壤介质中富集，破坏土壤理化性质，改变微生物群落结构，还会迁移至地下水、湿地、湖泊等环境中，造成二次污染，对生态系统构成巨大威胁^[6]。因此，石油污染土壤的修复已成为迫切需要解决的重要环境问题。

近年来，微生物修复技术以其经济、高效、环保、局限性小等优点备受人们的关注，在不破坏土壤环境的前提下，通过微生物自身或其代谢产物把石油污染物转化成无毒或毒性较低的化合物^[7]，被认为是一种最有应用前景的污染土壤修复方法。在微生物修复技术中，投加环境适应性强、降解效能高的菌种是提高石油类污染物降解效率的重要手段^[8]。龚汉意等^[9]从含石油烃的钻井泥浆中筛出 1 株对原油降解效率高的优势菌株 SW-1；当盐度为 0 时，菌株 SW-1 的原油降解率最高，可达 51.49%。柳晓东等^[10]从石油污染土壤中分离到 2 株高效石油降解菌，其中，OS33 为迪茨氏菌、 OS62-1 为红球菌，培养 5 d 后，两株菌的石油降解率分别为 80.51% 和 81.60%。余玲等^[11]从油污土壤中筛选出一株琼式不动杆菌，当石油浓度为 1% 时，该菌株对石油的降解率可达 60.20%。从阿拉伯湾的高盐沿海地区分离的两株极端嗜盐菌可生物降解原油、正十八烷和菲^[12]。Ebadi 等^[13]从油污土中分离出的铜绿假单胞菌 T4 对原油的降解率达 39%。Ajona 等^[14]从受石油污染土中筛选出的 Pseudomonas guguanensis 对原油具有一定的降解率。

植物根际促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）作为有益的微生物，定殖于植物根际，能够快速去除或降解附近石油污染土壤中的某些烃类化合物，有助于改善和修复根际土壤环境^[15]，并保护植物免受生长抑制。1-氨基环丙烷-1-羧酸（1-amino-cyclopropane-1-carboxylic acid，ACC）脱氨酶是许多根际促生菌独有的微生物酶，其可作为 PGPR 的一种特殊指标。从植物根系分泌的 ACC，即乙烯生物合成的直接前体，被 ACC 脱氨酶水解成 α-丁酮酸和氨，从而降低胁迫诱导的乙烯浓度^[16]。利用含 ACC 脱氨酶根际促生菌的这一机制，能够增强植物对石油污染胁迫的适应能力。方芳等^[17]研究发现，从受石油污染的狼尾草根际土中筛选出的两株细菌 F4-1 和 F4-2 具有产 ACC 脱氨酶、产吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid， IAA）及合成嗜铁素的能力。丁琳琳等^[18]从油污土壤中分离出的菌株 D5A 具有耐盐、产 ACC 脱氨酶、产 IAA 以及溶磷等多种促生特性，并对高羊茅的生长具有促生作用。Margarita 等^[19]筛选出的两株既能降解石油又能产植物激素的细菌在石油污染胁迫下能显著提高大麦种子的发芽率，并促进大麦幼苗的生长。

我国大部分油田作业区周围的土壤在面临石油污染问题的同时，也遭受着不同程度的盐渍化。特别是位于我国西北地区的油田，由于其特殊的地理位置，受到自然风化的严重影响，导致油田区生态环境脆弱，即干旱少雨、土壤盐渍化和石油污染程度高、面积大，植被生长稀疏、种类少。在石油污染土壤的治理方法中，生物修复技术被认为是最具有生命力的治理技术。常生长在盐渍化、石油污染等影响植物健康的极端环境中的有些植物的根际土壤中存在着能够降解石油或具有促生能力的微生物，其石油降解功能有助于改善和修复油污土壤环境，而促生功能有助于增强植物对胁迫的适应性，并保护植物免受生长抑制，从而使植物在逆境中得以存活，这对于发现和挖掘这些植物根际的有益微生物奠定了基础。因此，本研究在新疆克拉玛依油田作业区周围选择石油污染及盐渍化的区域，从梭梭根际分离筛选耐盐碱性强，具有较高产 ACC 脱氨酶活性，能够降解原油的细菌，并对其进行了种属鉴定，探究了接种量、pH、温度、原油浓度等不同环境条件对两株菌原油降解效果的影响，研究了两菌株的固氮、溶磷、产 IAA、产铁载体等促生能力，为微生物菌剂的制备奠定了基础，以期为提高盐渍化石油污染土壤的植物修复效率提供有价值的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试土壤

在新疆克拉玛依油田作业区周围选择石油污染及盐渍化的 3 个区域，从梭梭根际采集了土壤样品。采集土样的处理：一部分过筛去除杂质后自然风干，用于测定土壤的理化性质；另一部分置于-20℃保存备用。

1.1.2 供试原油

原油采集于陆梁油田作业区，用无菌采样瓶装集，放至 4℃冰箱避光保存备用。

1.1.3 主要仪器

分析天平，高压蒸汽灭菌锅，pH 计，超净工作台，恒温培养箱，摇床，紫外可见分光光度计，光学显微镜，扫描电子显微镜，高速冷冻离心机，漩涡震荡仪，恒温水浴锅，超声波仪，Oil460 型红外分光测油仪，马弗炉。

1.1.4 培养基的配制

原油培养基：无机盐基础培养基（MSM），原油 5.0 g。

MSM 培养基：（NH₄）₂SO₄ 1.5 g，NaNO₃ 1.5 g， K₂HPO₄ 1.0 g，CaCl₂ 0.002 g，KCl 0.5 g，MgSO₄· 7H₂O 0.5 g，FeSO₄·7H₂O 0.01 g，用超纯水定容至 1000 mL，pH 为 7.0～7.5。

选择培养基：原油 0.5 g，（NH₄）₂SO₄ 0.5 g， NaNO₃ 0.5 g，KH₂PO₄ 1.0 g，CaCl₂ 0.1 g，MgSO₄· 7H₂O 0.2 g，NaH₂PO₄ 1.0 g，用超纯水定容至 1000 mL，pH 调为 7.0。

上述培养基均于 121℃蒸汽灭菌 20 min。配制固体培养基时，每 1000 mL 培养基中需另加 18～20 g 琼脂。

Ashby 培养基：称取 30.7 g 该培养基，加热溶解于 1000 mL 超纯水中，121℃灭菌 15 min。

DF、ADF、TSB 培养基^[20]，PKO 培养基^[21]， CAS 培养基^[22]。

1.2 方法

1.2.1 土壤理化性质的测定

将采集的土壤过筛去除残留的植物根系和岩石等杂质，在室内自然风干后送往新疆农业科学院测试中心进行土壤理化性质的测定，测定指标有含水率、有机碳、pH、水溶性盐、速效氮（硝态氮 + 铵态氨）、有效磷、速效钾。土壤含油量由新疆油田公司实验检测研究院测定。

1.2.2 原油各组分的测定

原油各组分的测定委托新疆油田公司实验检测研究院完成。

1.2.3 菌株的富集与分离筛选

将 3 个采样点的土样各称取 5 g 分别添加到原油培养基中，30℃、180 r/min 恒温振荡培养 3 d 后取 1 mL 土壤悬浊液转接至新鲜原油培养基中，同样条件下培养 3 d，并依次连续富集 15 d。将上述培养液梯度稀释后均匀涂布于固体选择培养基平板上，30℃下恒温培养，待菌落生长后挑取形态和颜色不同的单菌落进行多次划线纯化得到单一菌株，再将其斜面保存备用。

将初筛得到的菌株分别划线接种于 ADF 固体培养基平板上，30℃恒温培养，待平板上长出菌落后，挑取单菌落划线于 ADF 固体培养基上，重复划线两次以确保菌株能在该培养基平板上生长。

1.2.4 菌株耐盐碱能力的测定

1.2.4.1 菌株耐盐试验

耐盐试验基于王伟楠等^[23]的方法稍作改动。以 TSB 固体培养基为基础，NaCl 浓度分别设为 5、10、20、30、50、70 g/L，pH 调至 7.0～7.5，将菌株分别划线于该培养基平板上，于 30℃恒温培养 24～48 h 后观察菌株的生长情况，每一梯度设 3 个重复，以大肠杆菌 （Escherichiacoli，E.coli）作为对照。

1.2.4.2 菌株耐碱试验

以 TSB 固体培养基为基础，NaCl 浓度设为 5 g/L，灭菌后将培养基 pH 分别调至 6、7、8、9、10、11 和 12，再将菌株分别划线于该培养基平板上，于 30℃恒温培养 24～48 h 后观察菌株的生长情况，每一梯度设 3 个重复，以 E.coli 作为对照。

1.2.5 菌株 ACC 脱氨酶活力的测定

1.2.5.1 α-丁酮酸标准曲线的绘制

主要按照张国壮等^[21]和赵龙飞等^[24]的方法，以 α-丁酮酸的浓度（mmol/L）为横坐标，以 OD₅₄₀ 为纵坐标绘制 α-丁酮酸标准曲线。

1.2.5.2 牛血清白蛋白标准曲线的绘制

参考 Bradford 法以牛血清白蛋白（BSA）作为标准物，以蛋白质浓度为横坐标，OD₅₉₅ 为纵坐标绘制 BSA 标准曲线。

1.2.5.3 酶比活力的测定

菌株 ACC 脱氨酶活性的测定主要参照张国壮等^[21]的方法，并稍作修改。将菌株接种至 TSB 培养基中，在 30℃、180 r/min 条件下振荡培养 24 h。离心收集菌体沉淀，并使其重新悬浮于 ADF 培养基中以相同条件摇培 24 h。将菌悬液离心收集沉淀，重新悬浮于 0.1 mol/ L Tris-HCl 缓冲液（pH 7.6） 中，再离心收集沉淀，该步骤重复 3 次。往菌体沉淀中加入 0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 7.6）以悬浮菌体，离心，再将菌体沉淀悬浮于 0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 8.5）中，加入甲苯后旋涡振荡 30 s，使菌体破碎。吸取 200 μL 菌悬液加入 20 μL 0.5 mol/L ACC 溶液，混匀后 30℃水浴 15 min，随后加入 1 mL 0.56 mol/L HCl 混匀，离心。取上清液 1 mL，加入 800 μL 0.56 mol/L HCl 混匀后再加 300 μL 2% 的 2，4-二硝基苯肼，30℃水浴 30 min。加入 2 mL 2 mol/L NaOH 用于显色，静置后用紫外可见分光光度计测定 540 nm 处的 OD 值。

酶比活力的计算：

$\mathrm{酶}\mathrm{比}\mathrm{活}\mathrm{力}（\mathrm{U}/\mathrm{m}\mathrm{g}）=\frac{\text{所产}\text{α}\text{-}\text{丁酮酸的量（μ}\text{mol}\text{）×}\text{测蛋白含量时所取的体积（μ}\text{L}\text{）}}{\mathrm{总}\mathrm{蛋}\mathrm{白}\mathrm{含}\mathrm{量}（\mathrm{m}\mathrm{g}）\times \mathrm{}\mathrm{测}\mathrm{酶}\mathrm{活}\mathrm{时}\mathrm{所}\mathrm{取}\mathrm{的}\mathrm{体}\mathrm{积}（\mathrm{\mu }\mathrm{L}）\times \mathrm{}\mathrm{酶}\mathrm{活}\mathrm{反}\mathrm{应}\mathrm{时}\mathrm{间}（\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{n}）}$

1.2.6 产 ACC 脱氨酶菌株的原油乳化效果评价

将酶比活力较高的 5 株菌的菌悬液以 1% 的接种量转接至以原油为唯一碳源的 MSM 液体培养基中，30℃、180 r/min 振荡培养 5 d 后，观察是否存在原油乳化现象，以未接菌含原油的 MSM 液体培养基作为对照。

乳化性能的测定基于李迎鹤等^[25]的方法上稍作修改，将出现乳化现象的菌株接种于含原油的 MSM 液体培养基中，以 30℃、180 r/min 摇床培养 5 d 后，将培养液离心去除菌体，收集上清液，在离心管中加入 4 mL 原油和 4 mL 离心后的菌体上清液，每处理设 3 个重复，于超声波仪中超声15 min，使原油与上清液完全混合，避光静置 1 d 后观察原油与上清液的分界面及乳化效果。

乳化率的计算：

$\text{乳化率}（\mathrm{\%}）=\frac{\text{乳化层高度}}{\text{液体总高度}}\times 100$

1.2.7 菌株生长曲线的绘制

以 1% 的投加量将菌株接种至 TSB 液体培养基中，30℃、180 r/min 摇床培养，根据各菌株生长速度选取不同时间段取样（S8-1 为 3 h，W8-4 为 6 h），以未接菌的 TSB 液体培养基作为对照，用紫外可见分光光度计测定菌悬液在 600 nm 处的吸光值，以时间为横坐标，OD₆₀₀ 为纵坐标作两株菌的生长曲线。

1.2.8 菌株原油降解率的测定

称取 1.0 g 原油溶于 100 mL 四氯乙烯中作为基准油，并将其分别稀释 0、5、10、20、50、100 mg/L，用红外测油仪 Oil-460 测定其吸光值，以原油浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制原油标准曲线。

在原油为唯一碳源的培养基中分别接种供试菌株，在 30℃、180 r/min 条件下振荡培养，每个样品设 3 个重复，以未投加菌的培养基作为空白对照。经摇培 7 d 后，采用 Oil-460 型红外测油仪测定原油降解率，用四氯乙烯将培养液中和瓶壁上的残油萃取 3 次，合并萃取液后向其中加入 4～5 勺用高温烘干（550℃，4 h）的无水 Na₂SO₄ 吸收多余水分并转移至容量瓶中，用四氯乙烯稀释后测定其浓度，随后计算原油降解率。

原油降解率的计算：

$\text{原油降解率}（\mathrm{\%}）=\frac{C_0-C}{C_0}\times 100$

式中，C₀ 为对照组样品的残油质量浓度（mg/L）；C 为处理组样品的残油质量浓度（mg/L）。

1.2.9 菌种鉴定

1.2.9.1 形态学观察

将分离菌株接种至 TSB 固体培养基上进行平板划线，30℃恒温培养 2～4 d，观察单菌落的形态特征；挑取单菌落进行革兰氏染色，镜检观察细菌的形态。使用 SU8010 型场发射扫描电镜观察两株菌的微观形态。

1.2.9.2 生理生化鉴定

主要参照《微生物学实验》^[26]和《常见细菌系统鉴定手册》^[27]中有关细菌的生理生化试验对筛选出的两株菌进行初步的菌种鉴定。本研究主要进行了糖发酵、油脂水解、明胶液化、淀粉水解、柠檬酸盐利用、丙二酸利用、接触酶试验、氧化酶试验、脲酶试验、吲哚试验、 M.R 和 V-P 试验等。

1.2.9.3 分子生物学鉴定

将菌样送至上海生物工程有限公司进行 16S rDNA 测序，对所得序列进行 BLAST 同源性分析，从 NCBI 数据库中找到相应模式菌株的基因序列后，运用 MEGA X 软件构建系统进化树，确定其种属关系。

1.2.10 不同环境条件对菌株原油降解效果的影响

以原油为唯一碳源，将菌悬液按不同接种量、pH、温度、原油浓度分别接种于选择培养基中，180 r/min 摇床培养 7 d，每个样品设 3 个重复，以未接种菌的培养基作为空白对照。7 d 后分别测以下几种环境条件下菌株对原油降解率的影响：（1）菌悬液接种量分别为 1%、2%、3%、 4%、5%、6%；（2） 初始 pH 分别为 6、7、8、9、 10、11、12；（3） 培养温度分别为 20、25、30、 35、40、45℃；（4） 原油浓度分别为 0.1、0.5、 1.5、2.5、5.0、7.5、10.0 g/L。

1.2.11 菌株促生能力的研究

1.2.11.1 固氮能力

固氮能力的测定基于赵廷伟等^[28] 的方法并稍作改动，将供试菌株接种于 Ashby 培养基平板上，于 30℃下培养 5 d 后观察菌落的生长情况，连续传代5次后均能在 Ashby 培养基上正常生长的菌株被视为具有固氮活性或固氮能力。每个处理设 3 个重复。

1.2.11.2 产 IAA 能力

产 IAA 能力的测定参考 Loper 等^[29] 的方法并稍作修改，将供试菌株分别接种于含色氨酸（100 mg/L）的 TSB 液体培养基中，以 30℃、180 r/min 条件下振荡培养 48 h， 8000 r/min 离心 10 min。取上述离心后的上清液 2 mL，加入 50 μL 体积分数为 83% 的正磷酸和 4 mL Salkowski 试剂，溶液颜色变为粉红色即说明有 IAA 产生。每个处理设 3 个重复。

1.2.11.3 溶磷能力

溶磷能力的测定基于 Verma 等^[30]的方法并适当修正，将供试菌分别点样接种于 PKO 培养基平板上，于 30℃恒温培养 10 d 后观察菌落的生长情况，若菌落周围有透明的溶磷圈产生，则说明具有溶磷能力。根据形成的溶磷圈直径 （D）和菌落直径（d）的比值（D/d）判断各菌株溶磷能力。每个处理设 4 个重复，以 E.coli 作为阴性对照。

1.2.11.4 产铁载体能力

菌株产铁载体能力的定性测定主要参考了王平等^[31]采用的方法。将菌株接种于 CAS 培养基中，30℃培养 5～7 d，观察此培养基平板上菌落的生长情况，若菌落周围出现橘黄色晕圈，则说明该菌株具有产铁载体的能力。每处理设 3 个重复。

2 结果与分析

2.1 土壤理化性质

土样理化性质的测定结果如表1 所示，受恶劣自然环境的影响，各采样点土壤含水率均偏低；有机碳含量少；pH 值范围为 8.13～8.45，略偏碱性； 不同采样点土壤盐含量存在一定差异；土壤速效氮、有效磷含量极低，速效钾含量较高，应增加油污土壤中的氮、磷含量，从而促进原油降解菌的生长，并提高其代谢活性；各采样点间含油量差异不大。

2.2 原油组分分析

原油各组分含量如图1 所示，其中饱和烃离子含量为 71.76%、芳烃含量为 8.42%、胶质含量为 4.65%、沥青质含量为 3.38%，总收率达 88.20%。

2.3 菌株的富集、分离纯化与筛选

经富集、分离纯化等步骤从 3 个采样点共筛选出 30 株形态和颜色不同的原油降解菌，并进行编号分类，其菌落形态见表2。由表2 可知，菌落形状和颜色丰富，大多数菌落为表面湿润，不透明，边缘不规则；少数为表面干燥，透明或半透明，圆形或椭圆形，菌落之间差异较大。进一步将初筛得到的原油降解菌划线接种于 ADF 固体培养基平板上培养，从中筛选出 26 株具有产 ACC 脱氨酶能力的菌株。

2.4 菌株耐盐碱试验结果

由表3 可知，26 株产 ACC 脱氨酶细菌中，菌株 Y8-2、Y8-3、Y8-4、Y8-5、S8-1、W7-2、 W8-1、W8-4、W9-1 的耐盐能力较强，在盐含量为 70 g/L 时依然能保持较好的长势。

注：“-”为不生长，“+”长势较差，“++”长势一般，“+++”长势较好。表4同。

由表4 可以得出，26 株产 ACC 脱氨酶细菌都能在 pH 为 6～7 的培养基中生长，菌株 S8-1、 W7-2 和 W8-4 能在 pH 为 10 的条件下存活，其中，菌株 S8-1 和 W8-4 具有更强的耐碱能力，在 pH 为 12 时仍能生长。

综合菌株耐盐碱能力，选取耐盐碱性能均较好的 Y8-2、Y8-3、Y8-4、Y8-5、S8-1、W7-2、 W8-1、W8-4 和 W9-1 共 9 株菌作后续试验的供试菌株。

2.5 α-丁酮酸和蛋白含量标准曲线的制定及菌株 ACC 脱氨酶活力的测定结果

α-丁酮酸标准曲线如图2 所示，相关系数 R² 为 0.9994，表示曲线拟合度好。蛋白含量标准曲线如图3 所示，相关系数 R² 为 0.9976，表示曲线拟合度较好。

由图4 可知，耐盐碱能力均较强的 9 株细菌中，菌株 W8-4 的 ACC 脱氨酶比活力最大，为 （0.77±0.08）U/mg，其次为菌株 S8-1、Y8-5、Y8-3、 Y8-4、W9-1、Y8-2、W8-1，酶比活力分别为 （0.17±0.06）、（0.16±0.02）、（0.15±0.03）、 （0.10±0.02）、（0.09±0.01）、（0.06±0.02）U/mg，菌株 W7-2 的酶比活力最小，仅为（0.04±0.02）U/mg。选取酶比活力较高的 5 株菌进行后续研究。

2.6 产 ACC 脱氨酶菌株的原油乳化效果评价

摇培 5 d 后，如图5 所示，接种菌株 S8-1 和 W8-4 的锥形瓶内原油在培养液中完全分散，即出现乳化现象，这表明菌株可能会产一些生物表面活性剂。

两株菌乳化性能的测定结果如图6 所示，菌株 W8-4 的乳化率达（54.92±5.04）%，菌株 S8-1 的乳化率为（49.59±3.69）%。乳化剂作为一类表面活性剂，可增加菌株细胞膜与原油等有机物之间的接触面，有利于菌株的生长代谢，进而提高降解率^[32]。

2.7 生长曲线

两株菌的生长曲线如图7 所示，S8-1 的指数生长期在 8 h 左右，15 h 后逐渐进入平稳期，42 h 后进入衰亡期（图7a）；W8-4 的指数期在 6～24 h，54～84 h 时菌株生长速度平缓，84 h 后进入衰亡期（图7b）。综上可得出，S8-1 生长速度较快， W8-4 生长速度较缓慢，这两株菌的生长曲线符合细菌生长曲线的趋势；微生物的不同生长情况将为微生物的实际应用价值提供重要参考。

2.8 原油标准曲线的制定及菌株原油降解率的测定结果

原油标准曲线如图8 所示，相关系数 R² 为 0.9994，表示曲线拟合度很好。

经 7 d 的降解试验后，通过红外分光光度法测定两株菌的原油降解率，结果表明，菌株 W8-4 的原油降解率高于 S8-1，其降解率达到 52.82%，而菌株 S8-1 的原油降解率为 41.38%（图9）。

2.9 菌种鉴定

如图10 所示，菌株 S8-1 的菌落呈圆形、淡黄色、不透明、表面湿润光滑，为革兰氏阴性菌（ 图10a，10c）； 菌株 W8-4 为橙色，菌落呈圆形、不透明、表面湿润光滑，是革兰氏阴性菌（图10b，10d）。通过 SU8010 型电镜观察菌株形态，菌株 S8-1 形态呈杆状（图10e）；菌株 W8-4 呈现出短杆状或球杆状结构（图10f）。

注：a 为菌株 S8-1 在 TSB 平板上的菌落形态；b 为菌株 W8-4 在 TSB 平板上的菌落形态；c 为菌株 S8-1 的革兰氏染色结果（物镜 100×）；d 为菌株 W8-4 的革兰氏染色结果（物镜 100×）；e 为菌株 S8-1 的扫描电镜图像；f 为菌株 W8-4 的扫描电镜图像。

由图11 和表5 所示，菌株 S8-1 和 W8-4 的油脂水解试验、接触酶试验、苯丙氨酸脱氨酶试验、脲酶试验、硝酸盐还原试验、产氨试验结果均呈阳性；两株菌都能还原石蕊牛奶，均具有运动性；两株菌都不能利用乳糖、L-阿拉伯糖、L-山梨糖，不能液化明胶；两株菌的氧化酶试验、淀粉水解试验、纤维素分解试验、吲哚产生试验、色氨酸脱氨酶试验、反硝化试验、甲基红试验和甲基乙酰甲醇试验结果均为阴性。此外，菌株 S8-1 能充分地利用柠檬酸盐、葡萄糖、蔗糖、D-果糖、丙二酸，但不能产荧光色素；菌株 W8-4 能产荧光。

注：a 为柠檬酸盐利用试验；b 为接触酶试验；c 为葡萄糖发酵试验；d 为石蕊牛奶分解试验；e 为脲酶试验；f 为油脂水解试验；g 为丙二酸利用试验。

将两株菌的 16S rDNA 基因组序列信息在 NCBI 数据库中进行 BLAST 同源性比对。结果显示，菌株 S8-1 与格氏假单胞菌（Pseudomonas gessardii）的同源性为 99.76%，菌株 W8-4 与假单胞菌属（Pseudommonas sp.） 的同源性为 99.77%（表6）。从数据库中选取与目标序列相似性较高的菌株序列，运用 MEGA X 软件中的 Neighbor-joining 法构建系统进化树，如图12 所示。结合形态学、生理生化特性及系统发育分析得出，菌株S8-1 和 W8-4 均与假单胞菌属聚在同一分支上，因此，两株菌都属于假单胞菌属（Pseudomoas）。

注：“+”表示试验结果为阳性，“-”表示试验结果为阴性。表7 同。

2.10 不同环境条件对菌株原油降解率的影响

2.10.1 接种量对菌株原油降解率的影响

接种量是影响微生物原油降解效果的重要参数。菌株 S8-1 和 W8-4 在不同接种量时对原油的降解效果如图13 所示。由图13 可知，当接种量小于 3% 时，微生物无法迅速并充分利用培养液中的碳源，进而导致菌株的降解效果不佳^[33]；接种量为 4% 时，菌株 S8-1 对原油的降解率高达 50% 以上；接种量为 5% 时，W8-4 对原油的降解率最大，可达 53.08%；接种量为 6% 时，两菌株的原油降解率都有所下降。由此可见，接种量过大时，微生物大量增长，菌密度高，造成培养基内营养源的短缺及溶解氧的不足，从而影响降解效果^[34]。

2.10.2 初始 pH 对菌株原油降解率的影响

菌株 S8-1 和 W8-4 在不同 pH 时对原油的降解效果如图14 所示。由图14 可知，摇床转速 180 r/min，降解时间为 7 d，初始 pH 为 6 时，菌株 S8-1 和 W8-4 对原油的降解率分别为 36.09% 和 40.60%；初始 pH 为 7～8 时，两株菌对原油的降解效果均高于其他 pH，pH 为 7 时，S8-1 的降解率最大，达 50.95%；pH 为 8 时，W8-4 对原油的降解率最大，可达 54.66%；当初始 pH 为 12 时，两株菌的降解效率最低，W8-4 的降解率为 12.29%， S8-1 的降解率仅为 9.35%。由此可见，pH 值过低或过高均影响微生物吸收营养源，使微生物的生长受抑制，进而对其分泌降解酶产生不利影响。

2.10.3 培养温度对菌株原油降解率的影响

温度会直接影响微生物的生长代谢及原油降解活性。菌株 S8-1 和 W8-4 在不同培养温度下对原油的降解效果如图15 所示。由图15 可知，当摇床转速为 180 r/min，降解时间为 7 d，培养温度为 30℃时，菌株 S8-1 和 W8-4 的原油降解率最大，分别为 52.60% 和 54.73%。当温度低于 30℃时，两菌株的降解率均 <40%；温度高于 30℃时，两株菌的降解率随着温度的升高而逐渐下降；温度为 45℃时，S8-1 和 W8-4 的降解率分别仅为 10.90% 和 18.00%。由此可见，培养温度过低或过高，微生物的代谢都会受抑制，导致原油降解效果不佳。

2.10.4 原油浓度对菌株原油降解率的影响

由图16可知，两株菌的原油降解率均随着原油浓度的增加而先增大后逐渐下降。随着原油浓度的增加，菌株 S8-1 的降解效果下降幅度明显大于菌株 W8-4。原油浓度分别为 0.1、0.5、1.5、2.5 和 5 g/L 时，菌株 W8-4 的降解效果呈现较稳定的上下波动趋势，降解率均在 50%～60%；当原油浓度为 2.5 g/L 时，其原油降解率最大，为 57.89%；而原油浓度为 0.5 g/L 时，菌株 S8-1 的降解率最大，达到 55.16%。由此可见，在低原油浓度下，微生物生长所需的碳源底物不足，导致微生物生长较缓慢，虽对原油具有较强的降解能力，但并非降解效果最佳；原油浓度过高时，底物碳氮比失调，在培养基表层形成较厚的油膜，这会减少空气中的氧气向培养基内部扩散，进而阻碍微生物的生长，甚至导致死亡，从而降低原油降解效率。

2.11 菌株促生能力的测定

两菌株促生能力的测定结果如表7 所示。连续传代 5 次后，两株菌在 Ashby 无氮培养基中仍能正常生长，说明菌株 S8-1 和 W8-4 具有固氮能力。将两株菌离心后的上清液与适量正磷酸和 Salkowski 试剂混合反应后，S8-1 和 W8-4 溶液的颜色未发生变化，即说明这两株菌不能产 IAA。两菌株的菌落周围均出现透明溶磷圈，通过测量菌落直径和溶磷圈直径，进行 D/d 值的计算后得出，菌株 W8-4 的溶磷圈较菌株 S8-1 大（表8）。在 CAS 培养基平板上生长的两株菌菌落周围均未出现橘黄色晕圈，说明两株菌都没有产铁载体的能力。

注：以 E.coli 作为阴性对照。

3 结论

本研究从受石油污染的盐碱地中生长的梭梭根际土壤中成功分离出两株具有较强耐盐碱能力和 ACC 脱氨酶活性，并能将原油作为唯一碳源进行代谢活动的细菌。ACC 脱氨酶活力的测定结果显示，菌株 S8-1 和 W8-4 的 ACC 脱氨酶比活力分别为 （0.17±0.06）和（0.77±0.08）U/mg，W8-4 的酶比活力高于 S8-1。两株菌乳化性能的测定结果表明，菌株 S8-1 的乳化率为（49.59±3.69）%，而菌株 W8-4 乳化效果优于菌株 S8-1，乳化率达（54.92±5.04）%。利用两株菌进行的原油降解试验结果表明，菌株 W8-4 的原油降解率明显高于 S8-1，其降解率达到 52.82%，而菌株 S8-1 的原油降解率仅为 41.38%。经形态观察、革兰氏染色、生理生化鉴定及 16S rDNA 序列分析得出，S8-1 为 Pseudomonas gessardii 菌株， W8-4 为 Pseudommonas sp. 菌株。

微生物降解土壤中石油类污染物的过程中易受环境因素，即 pH、温度、原油浓度等的影响^[35]。通过研究不同环境条件对菌株原油降解效果的影响看出，随着各因素数值的逐渐增大，两株菌对原油的降解效率均有先升高后降低的趋势。当降解时间为 7 d，摇床转速为 180 r/min 时，菌株 S8-1 的最佳降解条件是接种量为 4%，初始 pH 为 7，培养温度为 30℃，原油浓度为 0.5 g/L，降解率可达 55.16%；菌株 W8-4 的最佳降解条件是接种量为 5%，初始 pH 为 8，培养温度为 30℃，原油浓度为 2.5 g/L，原油降解率高达 57.89%。

PGPR 既可通过溶磷、产生植物激素等直接作用促进植物的生长，也可以通过分泌铁载体和产生抗生素等间接作用提高植物对胁迫的抗逆性^[36]。本试验通过对两株菌进行固氮、产 IAA、溶磷和产铁载体能力的测定，得出两株菌均有生物固氮能力和溶磷能力，但均无产 IAA 和产铁载体能力。

筛选到的两株菌具有较强耐盐碱能力、较高产 ACC 脱氨酶活性、较强原油乳化能力、固氮和溶磷能力，且对原油也有着较好的降解效果，可为将来提升盐渍化石油污染土壤的植物修复效率提供有价值的菌种资源，还有待进一步验证两菌株的促生效果。

参考文献