氮在作物必需大量元素中居首位，氮素肥料对农作物的品质和产量提高起着关键性作用。我国是世界最大肥料生产和消费国，对氮肥的利用具有高投入、高产出、高剩余、对合成肥料高度依赖等特点，“四高”特征在支持中国农业高产的同时，也导致了氮素利用率低、氮素向环境排放量高进而污染环境等问题^[1-2]。因此，研发利用率高且能控制其对环境质量产生不利影响的新型氮肥是新时代肥料行业的发展方向^[1，3]。

稳定性肥料是一类添加了脲酶抑制剂和 / 或硝化抑制剂等增效助剂从而使肥效得到延长的含氮肥料^[4-5]。脲酶抑制剂能通过抑制土壤中脲酶的活性进而延缓尿素的水解，降低尿素水解成氨的氨挥发损失及氨进一步硝化成硝态氮的氮淋溶损失。硝化抑制剂能通过抑制土壤中亚硝化单胞菌属的活性进而延缓铵态氮的硝化过程，降低铵态氮硝化成硝态氮的氮淋溶损失及硝态氮的反硝化脱氮损失^[4，6]。良好的农学效应和环境效益使稳定性肥料在生产应用领域发展迅速。目前，N-正丁基硫代磷酰三胺（NBPT）以其经济实惠、作用明显等优势是应用最广的脲酶抑制剂，双氰胺（DCD）以其稳定性良好、最终分解产物（CO₂ 和 NH₄ ⁺）对土壤无不利影响等优势是较常用的硝化抑制剂^[7-8]。 NBPT 与 DCD 组合添加于肥料中可达到协同增效的作用，其作用效果受抑制剂的含量影响很大^[9-10]，但国内外现有标准法规多着眼于氮肥增效助剂的评价^[4，11]，对含量的检测方法尚不健全。欧盟和我国建立了测定脲酶抑制剂和硝化抑制剂含量的方法^[12-16]，但各标准方法中仅涉及对单一种类抑制剂的测定，且对不同肥料基质的适用性未达成国际共识。

为实现对新型肥料的有效管控，解决肥料中氮肥增效助剂测定方法存在的问题，建立了采用高效液相色谱对 N-正丁基硫代磷酰三胺和双氰胺同时测定的新方法，并以此为基础向国际标准化组织“肥料、土壤调理剂和有益物质”标准化技术委员会（ISO/TC 134）提出建立了“肥料中正丁基硫代磷酰三胺和双氰胺的同时测定-高效液相色谱法”国际标准草案（ISO/DIS 6650），以求建立与氮肥增效助剂评价体系配套的含量分析方法，填补肥料中脲酶抑制剂和硝化抑制剂同时测定的国际标准与规范的缺失。为此，本文以一系列具有代表性的肥料样品为实验对象，对新方法进行了方法验证及国际实验室间比对研究。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

主要仪器：LC-20A 型高效液相色谱仪配二极管阵列检测器（日本岛津公司）；Simplicity uv 型超纯水仪（德国默克密理博公司）；SK7210HP 型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）； ME204/02 型分析天平（瑞士梅特勒托利多公司）； 移液器（20～200 μL，100～1000 μL，1～10 mL） （德国艾本德公司）。

主要试剂：乙腈（HPLC 级）（国药集团化学试剂有限公司）；N-正丁基硫代磷酰三胺（NBPT）（纯度 97%～100%，CAS 号 94317-64-3）（上海麦克林生化科技股份有限公司）；双氰胺（DCD）试剂 （纯度 98%～100%，CAS 号 461-58-5）（上海麦克林生化科技股份有限公司）。2 种抑制剂的结构式如图1 所示。

注：图 a 为 NBPT；图 b 为 DCD。

1.2 实验样品

实验选取了 9 种含尿素态氮和 / 或铵态氮的固体和 / 或液体肥料，样品信息见表1。

注：表中样品由 2 种抑制剂与对应肥料按质量比投入到搅拌器内混合制成，编号 1～5 的样品中 2 种抑制剂及其肥料在混合前经过精密称重，编号 A～D 的样品未经过精密称重，2 种抑制剂的含量范围在 0.2%～5.0%，用于开展国际实验室间比对实验。

1.3 实验步骤

1.3.1 试样溶液的制备

称取 0.1～3 g 的试样（称重精准至 0.0002 g） 于 250 mL 容量瓶中，加入 100 mL 水，置于超声波清洗器中超声溶解 20 min，冷却后加水定容、摇匀。将试样溶液过水相滤膜至进样瓶后加盖待测。

1.3.2 标准溶液的配制

精密称取 0.2500 g NBPT、DCD 试剂于 2 个 250 mL 容量瓶中，加入 100 mL 超纯水，置于超声波清洗器中超声溶解 20 min，冷却后用水定容、摇匀，即得浓度为 1000 mg/L 的 NBPT 和 DCD 单标母液。分别移取 NBPT 母液 0.5、1、2.5、5、10 mL，DCD 母液 0.1、0.25、1、2.5、10 mL 于 5 个 100 mL 容量瓶中，加水定容、摇匀，即得系列混标溶液，混标溶液中 2 种抑制剂的浓度见表2。将混标溶液过水相滤膜至进样瓶后加盖待测。

1.3.3 色谱分析条件

色谱柱：SHIMADZU Shim-pack GIST C18 4.6 mm× 250 mm、5 μm；柱温：35℃；进样体积：10 μL； 流动相为不同体积比的乙腈与水的混合物，梯度洗脱程序见表3，流速：1.0 mL/min；检测波长：205 nm（NBPT）、214 nm（DCD）。

2 结果与分析

2.1 色谱分析条件的选择

本文中建立的液相色谱分析条件参考了各国现行标准^[12-16]，各国现行标准测定方法的区别详见表4。

2.1.1 流动相与流速的选择

由于乙腈相比于甲醇截止波长更低、粘度更小，流动相选择乙腈 / 水体系。对于图1 中的分子结构式，2 种抑制剂均含有氨基极性基团，可与水分子形成氢键作用，从而与水有很好的互溶性，同时 NBPT 结构中含有正丁基基团，因此，2 种抑制剂均为极性化合物且 NBPT 的极性小于 DCD。由于分子结构的原因会使 2 种抑制剂在乙腈与水不同体积比的溶剂中溶解度不同，当利用液相色谱对 NBPT、DCD 同时分析时，流动相需采用梯度洗脱模式。

在确定了梯度洗脱程序中流动相的混合比例后，考察不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）对 2 种抑制剂的分离情况。结果表明，在其他色谱分析条件不变的情况下，1.0 mL/min 的流速分离效果较好，也不会造成柱压升高进而损坏色谱柱的情况，最终确定流动相流速为 1.0 mL/min。

2.1.2 检测波长的选择

称取 NBPT、DCD 试剂约 0.01 g 于 2 个 100 mL 容量瓶中，加水经超声溶解后定容、摇匀。过水相滤膜后依次进样分析，得到 2 种抑制剂的光谱视图 （图2），考虑到乙腈在末端吸收的影响，NBPT、 DCD 的最佳检测波长选取分别为 205、214 nm，此时，2 种抑制剂的灵敏度较高、干扰也较少。

注：图 a 为 NBPT；图 b 为 DCD。

2.2 试样提取溶剂的选择

采用溶剂 1（水）、溶剂 2（乙腈 / 水 =25/75）分别对 1.2 中的编号 3 样品进行试样溶液制备，过水相滤膜后分析测定结果见表5。由表5 可知，试样经不同溶剂提取所得 2 种抑制剂的平均含量及回收率基本一致，为便于实验操作最终确定以水作为提取溶剂。

2.3 标准线性方程与定量限

对 1.3.2 中的系列混标溶液按 1.3.3 仪器条件依次进样分析，以每种抑制剂标准溶液的浓度为横坐标，对应峰面积为纵坐标进行线性拟合，2 种抑制剂的标准线性方程等信息见表6。结果表明，NBPT 在 5～100 mg/L 浓度范围内线性关系良好，线性相关系数 R² >0.9999，定量限为 0.15 mg/L；DCD 在 1～100 mg/L 浓度范围内线性关系良好，线性相关系数 R² >0.9999，定量限为 0.02 mg/L。

2.4 回收率实验

对 1.2 中编号 1～5 样品按 1.3.1 制备后进样分析，所得色谱图见图3。由图3 可知，该方法能将各种肥料样品中的 NBPT 与 DCD 进行有效分离，可用于 2 种类型抑制剂的同时测定。

分别记录编号 1～5 样品中 2 种抑制剂的峰面积，并根据理论含量计算回收率，结果见表7。由表7 可知，2 种抑制剂的回收率分别为 91.1%～104.8% 和 90.9%～107.6%，表明该方法的准确度较高。

2.5 精密度实验

2.5.1 方法精密度实验

对 1.2 中的编号 3 样品平行制备 6 份样品溶液，并按 1.3.3 仪器条件进样分析，分别计算 2 种抑制剂含量，计算结果见表8。由表8 可知，2 种抑制剂进行 6 次平行测定的相对标准偏差分别为 1.94% 和 0.84%，表明该方法的精密度较高。

注：图 a 为 NBPT205 nm；图 b 为 DCD 214 nm。

2.5.2 国际实验室间比对实验

新国际标准 ISO/DIS 6650 由本文开发的高效液相色谱分析方法为基础进行制定。为研究 ISO/ DIS 6650 中测定方法在全球范围内的重复性和再现性，并进一步验证该方法作为国际标准进行推广的可行性，组织了全球 18 家分析实验室对该方法进行了国际实验室间比对。比对研究按国际标准草案 ISO/DIS 6650 制定程序进行，实验样品为 1.2 中所述的 4 个样品（A～D），实验数据的统计分析依据 ISO 5725—2:2019《测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第 2 部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法》^[17] 进行。

全球 18 家实验室测定的 4 个肥料样品中 2 种抑制剂含量原始数据见表9。

注：实验室 2 为离群实验室，所报告的关于 DCD 含量的 4 个样本数据在其测试结果水平上具有过大的系统误差。

依据 ISO 5725—2:2019 第 2 部分^[17]对数据的有效性进行统计检验，应用柯克伦（Cochran）检验对实验室内数据一致性进行检验，然后对通过 Cochran 检验的数据再应用格拉布斯（Grubbs）检验对实验室间的数据一致性进行检验。经 Cochran 及 Grubbs 依次检验后发现，NBPT 测定原始数据中在实验室 1 的 B 样品、实验室 3、12 和 13 的 C 样品所测数据的绝对差过大，因此剔除这 4 组数据； DCD 测定原始数据中在实验室 1 的 B 样品、实验室 3 的 C 样品、实验室 3 和 14 的 D 样品所测数据的绝对差过大，因此剔除这 4 组数据。所产生的离群值或歧离值均由随机误差引起。

计算通过有效性检验的 2 种抑制剂含量测定结果的平均值（m）、重复性标准差（s_r）和再现性标准差（s_R）。由于 2 种抑制剂的 s_r、s_R 与对应的 m 均具有明显的线性关系，因此，将 s_r、s_R 与 m 进行线性拟合，以此来表征该方法的精密度，平均值计算及拟合结果等见表10。由表10 可知实验中 2 种抑制剂的含量水平范围，该方法在全球范围内具有良好的适用性以及较高的精密度。

3 结论

本文利用二极管阵列检测器对 2 种抑制剂在各自特征波长进行测定的优势，建立了对肥料中 NBPT 和 DCD 同时测定的高效液相色谱分析方法。相较于国内外针对上述物质单独分别分析方法^[12-16]，本文开发的方法操作步骤简单，节约了部分样品溶液制备和液相上机的人力和时间成本，可将各种肥料样品中的 NBPT 和 DCD 进行有效分离及准确测定。通过对全球 18 家实验室间比对实验数据的统计分析，验证了本文所开发的方法具有良好的适用性以及较高的精密度，ISO/DIS 6650 可作为新的国际标准推广使用。

参考文献