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土壤微生物作为种类最为丰富的群落之一，其在物质和能量的循环及维持生态系统的结构和功能方面发挥重要作用[1]。土壤真菌是果园土壤中最常见的微生物，主要参与分解有机质、改善土壤养分、调节土壤营养状况、促进养分循环等活动，其群落结构以及群落多样性是评价农田生态系统稳定和健康的重要指标之一[2]。与细菌相比，真菌在活化养分、分解植物残体及土壤有机质方面的表现更好[3]。在土壤真菌群落的发育过程中，环境因素（如土壤有机质、速效氮等养分状况）起到了十分重要的作用[4]，是导致真菌群落结构发生变化的主要原因之一[5]。在果树生产实践中，果农为提高土壤肥力，增加果树产量，将施肥作为主要手段，而肥料中的多种成分会使土壤理化性质产生变化，土壤真菌多样性也会因此改变[6]。施肥方式可以直接或间接改变农田生态系统的养分平衡和供应状况，从而对土壤生物学特性产生影响[7]。施肥对真菌群落的影响在施肥后较为显著，主要影响真菌群落的物种丰富度和物种组成[8]。
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氮素是调控作物生长发育和群体结构的重要因素[9]，并与土壤微生物群落结构关系密切，是土壤微生物多样性和群落结构变化的主要驱动力之一[10]。有研究表明，添加氮会增加土壤微生物多样性[11-12]，但随施氮水平的提高，微生物多样性呈下降趋势[13-14]，长期施氮会改变微生物群落分布，抑制其活性[15]。但也有研究表明不同施肥措施下，土壤微生物群落多样性受到的影响较小，短期添加氮可能并未显著影响土壤微生物的代谢能力和植物生产力[16]。张强等[17]对北京苹果、梨等果园进行研究发现，土壤真菌数量主要受阳离子交换量（CEC）、土壤 pH 及有效钾、全氮含量的影响，并与土壤全氮、有效钾含量及 CEC 均呈显著正相关，与土壤 pH 呈显著负相关。而库尔勒香梨 （Pyrus brestschneideri Rehd.）园中土壤理化性质对土壤真菌群落影响的重要程度及其相关性研究的详细资料还有待补充。
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本试验通过利用高通量 ITS 基因测序技术，研究施氮量对库尔勒香梨园土壤（0～20 cm 土层） 真菌群落结构组成及多样性的影响，并探讨土壤真菌群落结构变化与土壤理化性质的相关性，以此分析施氮量对库尔勒香梨园土壤生态环境的影响，优化库尔勒香梨园施肥措施，为推进库尔勒香梨可持续健康的发展及生态系统多样性的提高提供理论依据。
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1 材料与方法
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1.1 研究区概况
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本试验在新疆巴音郭楞蒙古自治州库尔勒市南郊阿瓦提农场（41°40′28″N、86°07′12″E）进行。试验地位于天山南坡，塔里木盆地东北边缘，气候类型属于典型的温带大陆性干旱荒漠气候，年均气温 10.5～11.8℃，年降水量 50～55 mm，年最大蒸发量 2788 mm，年均日照时数 2800～3000 h，日照总辐射 5700～6500 MJ/cm2，有效积温 4100～4400℃，无霜期 210～239 d。土壤类型主要为草甸土，肥力中等，土壤中有机质含量为 21.56 g/kg，碱解氮、有效磷、速效钾含量分别为 46.22、 14.41、169 mg/kg。
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1.2 试验设计
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试验以栽植 6～8年树龄的库尔勒香梨为试材，株行距 2 m×4 m，密度 1125 株 /hm2。选取长势相仿，且无病虫害、结果正常的库尔勒香梨树进行挂牌标记。参照库尔勒香梨常规施肥水平，设置不施氮（N0）、低氮量（N1）、中氮量（N2）和高氮量（N3）4 个处理，氮肥施用量分别为 N 0、 150、300、450 kg/hm2，相当于每株 0、133、267、 400 g，每处理选取 9 株香梨树，单株为 1 次重复。
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除 N0 处理外，其余各处理施用氮肥（尿素： N 46%）总量的 60% 于果树的萌芽前期基施，剩余 40% 在果实膨大前期（6 月 1 日）追施。磷肥（重过磷酸钙：P2O5 46%）和钾肥（硫酸钾：K2O 51%） 在萌芽前期一次性全部施入。施基肥与追肥均采用环状沟施法（距中心干 50 cm 处挖深和宽均约为 30 cm 的环状沟），施肥后各处理均进行常规田间管理，不同处理的生长条件和其他栽培管理保持一致。
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1.3 采样与测定
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1.3.1 样品采集
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土壤样品于香梨坐果期（6 月）、膨果期（8 月）、成熟期（9 月）采集。每个处理采集 3 棵果树的土样，采集土样时，先去除地表凋落物，然后分别在施肥沟两侧用土钻法采集 0～20 cm 土层土样，将施肥沟两侧同层土样混合为 1 个土样，土样经初步破碎混匀后，保存于封口的自封袋中，并放入盛有干冰的保鲜箱中保鲜运回实验室。土壤样品在去除植物根系和大的石块后过 2 mm 孔筛混匀，所有样品分为两部分，一部分于 4℃冰箱保存送至上海派森诺生物科技有限公司测定土壤真菌群落多样性，另一部分室内风干，过 1 mm 筛，用于土壤理化性质分析。
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1.3.2 测定与计算
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1.3.2.1 香梨园土壤理化性质分析
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土壤理化指标的测定方法均参照鲍士旦[18]《土壤农化分析》中的方法测定。
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1.3.2.2 真菌高通量测序分析
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土壤 DNA 提取与聚合酶链式反应（PCR） 扩增：使用 OMEGA 土壤 DNA 试剂盒（M5635-02）（OMEGA Bio-Tek， Norcross，GA，USA），按照制造商说明提取总基因组 DNA 样本，并在进一步分析前保存于-20℃条件下。提取 DNA 的数量和质量分别用 NanoDrop NC2000 分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Waltham， MA，USA）和琼脂糖凝胶电泳进行测定。采用正向引物为 ITS1F（5 ′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3 ′），ITS1R（5 ′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）ITS1 扩增真菌 ITS 基因 V1 区域。将样品加入引物中进行多重测序。PCR 采用 NEB Q5 DNA 高保真聚合酶，将 PCR 反应所需的成分配置完后，在 PCR 仪上于 98℃ 预变性 30 s，使模板 DNA 充分变性，然后进入扩增循环。在每 1 个循环中，先于 98℃保持 15 s 使模板变性，然后将温度降到 50℃，保持 30 s，使引物与模板充分退火；在 72℃保持 30 s，使引物在模板上延伸，合成 DNA，完成 1 个循环。重复这样的循环 25～27 次，使扩增的 DNA 片段大量累积。最后，在 72℃保持 5 min，使产物延伸完整，4℃保存。扩增结果进行 2% 琼脂糖凝胶电泳，切取目的片段，然后用 Axygen 凝胶回收试剂盒回收目的片段。
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高通量测序分析：PCR 产物定量、混样，利用 Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit 对 PCR 产物在 Microplate reader（BioTek，FLx800）上进行定量，然后按照每个样品所需的数据量进行混样。文库构建是利用 Illumina 公司的 TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 进行建库。建库后进行文库质检与定量，对合格的文库，在 MiSeq 机器上利用 MiSeq Reagent Kit V3（600 cycles）进行 2×250 bp 的双端测序。按照 QIIME2 dada2 分析流程或 Vsearch 的分析流程进行序列去噪或 OTU 聚类，对各样本（组） 在不同物种分类学水平的具体组成上进行展示，了解整体概况。上述操作均由上海派森诺生物科技有限公司完成。
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1.4 数据处理
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运用 QIIME2（2019.4）、R 语言进行物种组成的相对丰度、α-多样性指数分析以及基于 Bray-Curtis 距离矩阵的主坐标分析（PCoA）。用 Kruskal-Wallis 检验及 Duncan’s检验对不同处理间的物种组成相对丰度及 α-多样性指数进行比较，并进行显著性标记。土壤理化性质与真菌群落 α-多样性指数的相关性、土壤理化性质与真菌菌门（属）水平优势物种相对丰度的相关性、土壤理化性质对真菌群落结构影响的冗余分析（RDA）均在 Genescloud 平台进行分析与作图。
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2 结果与分析
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2.1 不同施氮处理下土壤理化性质的变化
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如表1 所示，除坐果期 N3 处理有机碳、膨果期 N2 处理电导率降低外，土壤氮素、碳素及土壤电导率水平在各个生育时期均表现为随着氮肥施入量的增加而提高，且显著高于 N0 处理（P<0.05），但碳氮比（C/N）随着施氮量的增加表现为逐渐降低的趋势。坐果期，膨果期土壤 pH 随着施氮量的增加表现为先增加后降低的趋势，在 N3 处理下小于 7；成熟期土壤 pH 表现为不断增加，在 N0 处理时小于 7，其余处理均在 7.25～7.39 之间。
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注：T2：坐果期；T3：膨果期；T4：成熟期。不同字母代表同一时期处理间差异显著（P<0.05）。
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2.2 施氮对土壤真菌群落结构的影响（门水平）
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本研究挑选了相对丰度排名前 10 的真菌菌门来分析土壤真菌群落组成的门水平变化（图1）。由整体菌门的变化可知，子囊菌门（Ascomycota）处于优势地位，相对丰度在 80％～90％之间、担子菌门（Basidiomycota）、被孢霉菌门（Mortierellomycota）的相对丰度也能够维持在大于 1% 的水平，罗兹菌门 （Rozellomycota）和油壶菌门（Olpidiomycota）的相对丰度在 0.1％～1％之间，其余菌门的相对丰度均在 0.1% 以下。
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由施氮处理的变化可以看出，子囊菌门的相对丰度整体表现为施氮后坐果期和膨果期施氮处理较 N0 处理在不同程度上有所升高，但成熟期 N2、N3 处理相对丰度明显下降，组间差异不显著。担子菌门相对丰度整体表现为施氮处理较 N0 处理在不同程度上有所下降（除成熟期 N1、N3 处理外）。被孢菌门相对丰度整体表现为全时期施氮处理较 N0 处理在不同程度上下降，其中在膨果期各处理较 N0 处理分别下降 80％、89％、73％（P<0.05）。罗兹菌门相对丰度表现为随着氮肥的施入而有所下降，但组间差异不显著。油壶菌门相对丰度整体表现为施氮处理较 N0 处理整体呈上升趋势，其中在坐果期 N3 处理较 N0 处理显著增加 379％（P<0.05）。
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2.3 施氮对土壤真菌群落结构的影响（属水平）
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本研究挑选了相对丰度排名前 20 的真菌菌属来分析土壤真菌群落组成的属水平变化（图2）。由整体菌门的变化可知，不同时期的优势菌种不同，检测到的在各时期存在且相对丰度大于 1％的菌种共有 12 种，其中曲霉属（Aspergillus）、顶孢霉属（Acremonium）、链格孢属（Alternari）、葡孢霉属（Botryotrichum）、假裸囊菌属（Pseudogymnoascus）在各自时期相对丰度大于 25％，光黑壳属（Preussia）、小囊菌属（Microascus）、闭小囊菌属（Kernia）在各自时期相对丰度大于 10％左右，瓶毛壳属（Lophotrichus）、爪甲白癣菌（Arthrographis）、被孢霉属（Mortierella）、沃德霉属（Wardomyces）在各自时期相对丰度也在大于 1％的水平。
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图1 施氮量对真菌群落门水平优势物种相对丰度的影响
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注：T2：坐果期；T3：膨果期；T4：成熟期。下同。
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图2 施氮量对真菌群落属水平优势物种相对丰度的影响
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随着生育期的进行，曲霉属、顶孢霉属、链格孢属的相对丰度都表现为施用氮肥后，较 N0 处理显著增加。膨果期 N1 处理下曲霉属较 N0 处理增加显著且相对丰度到达了 48％（P<0.05）；膨果期顶孢霉属 N3 处理较 N0 处理增加显著且相对丰度到达了 33％（P<0.05）；坐果期链格孢属 N3 处理较 N0 处理提升较大，相对丰度到达了 36％。葡孢霉属相对丰度表现为坐果期 N1、N2、N3 处理较 N0 处理分别提升 1012％、2695％、996％。假裸囊菌属相对丰度整体表现为全时期施氮处理较 N0 处理在不同程度上下降，其中 N3 处理降幅显著且达到 99％（P<0.05）。光黑壳属相对丰度整体表现为全时期施氮处理较 N0 处理在不同程度上下降，差异不显著，小囊菌属相对丰度整体表现为 N1 处理全时期较 N0 处理在不同程度上增加，其中成熟期 N1 处理较 N0 处理增幅显著且达到 812％（P<0.05）。被孢霉属相对丰度整体表现为全时期施氮处理较 N0 处理在不同程度上下降，差异不显著。
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2.4 施氮对土壤真菌群落多样性的影响
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对真菌群落 α 多样性指数分析表明，真菌 16S-rRNA 测序文库覆盖度整体超过 99%，表明各处理测序数据达到饱和，其结果能反映真实的样本条件，由图3 可以看出，在施氮后膨果期和坐果期N3处理的 Chao1 和 Observed species 指数最高，成熟期时各施氮处理的 Chao1 和 Observed species 指数明显下降，表现为 N0 处理最高。膨果期和坐果期 N2、N3 处理均增加了土壤的 Shannon、Simpson 和 Pielou’s evenness 指数值，但成熟期明显下降，且 Shannon、Simpson 和 Pielou’s evenness 指数值随生育期进行整体逐渐升高。
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图3 施氮量对土壤真菌群落 α 多样性的影响
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为进一步衡量微生物群落结构的差异，本研究使用 Bray-Curtis 距离算法来分析真菌群落的 β 多样性（图4）。从 PCoA 分析上可以看出，在坐果期、膨果期以及成熟期的最大解释的主坐标成分分别是 30.9%、39.3%、29.6%，不同氮添加浓度下土壤真菌群落有着部分的差异，但是其相异度未达到显著水平。通过 Permanova 检验方法进行组间差异分析，发现 3 个时期下各施肥处理间均无显著差异。
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图4 施氮量对土壤真菌菌群落 β 多样性的影响
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2.5 土壤真菌群落 α 多样性与土壤理化性质的相关分析
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用土壤理化性质与真菌群落 α-多样性指数进行相关性分析，由图5 可知，在坐果期 Good’s coverage 指数与全氮、硝态氮、碱解氮含量显著负相关（P<0.05），与 C/N 极显著正相关（P<0.01）； Chao1、Observed species 指数与 C/N 显著负相关 （P<0.05）。在成熟期 Good’s coverage 指数与 pH、电导率显著正相关（P<0.05），与有机碳含量极显著正相关（P<0.01）；Shannon、Simpson 和 Pielou’s evenness 指数与全碳含量显著负相关（P<0.05）。
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2.6 土壤真菌群落优势物种（门水平）与土壤理化性质的相关分析
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RDA 结果显示（图6），在门水平，土壤理化性质在坐果期、膨果期、成熟期各解释了真菌群落变异的 61.41%、95.14%、97.01%。其中，坐果期无机碳含量对真菌门水平群落影响达到显著水平（P<0.05）； 膨果期全碳、有机碳含量及 pH 对真菌门水平群落影响达到极显著水平（P<0.01）；成熟期电导率对真菌门水平群落影响达到显著水平（P<0.05）。
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挑选相对丰度排名靠前且大于 1％的真菌菌门与土壤理化性质进行相关性分析（图7），在坐果期罗兹菌门与电导率显著负相关（P<0.05）。膨果期子囊菌门与 C/N 显著负相关（P<0.05）；担子菌门与有机碳含量、pH 显著负相关（P<0.05），与全氮含量极显著负相关（P<0.01）；罗兹菌门与电导率极显著负相关（P<0.01）；油壶菌门与全碳、有机碳含量及 pH 显著正相关（P<0.05）。成熟期子囊菌门与有机碳显著负相关（P<0.05）；被孢霉菌门与电导率显著正相关（P<0.05）；担子菌门与全碳、无机碳含量极显著负相关（P<0.01），与 C/N 显著正相关（P<0.05）；罗兹菌门与全碳含量、pH 显著负相关（P<0.05）；油壶菌门与有机碳含量显著正相关（P<0.05）。
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图5 土壤理化性质与真菌 α 多样性的相关关系
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注：* 表示显著相关（P<0.05）；** 表示极显著相关（P<0.01）。图7、图9 同。
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图6 土壤理化性质与真菌群落门水平的冗余分析
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注：TN：全氮，NO3--N：硝态氮，NH4 +-N：铵态氮，AN：碱解氮，SOC：有机碳，SIC：无机碳，TC：全碳，C/N：碳氮比，EC：电导率。图8 同。
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图7 土壤理化性质与真菌群落门水平优势物种的相关关系
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2.7 土壤真菌群落优势物种（属水平）与土壤理化性质的相关分析
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RDA 结果显示（ 图8），在属水平，土壤理化性质在坐果期、膨果期、成熟期各解释了真菌群落变异的 76.63%、92.00%、89.47%。其中，坐果期全氮、铵态氮、碱解氮含量和 C/N 及 pH 对真菌属水平群落影响且达到显著水平（P<0.05）； 膨果期、成熟期电导率对真菌属水平群落影响达到显著水平（P<0.05）。
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图8 土壤理化性质与真菌群落属水平的冗余分析
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挑选相对丰度排名前 8 的真菌菌属与土壤理化性质进行相关性分析（图9），在坐果期，假裸囊菌属与全氮、硝态氮、碱解氮含量显著负相关（P<0.05），与无机碳含量极显著负相关 （P<0.01），与 C/N 极显著正相关（P<0.01）； 葡孢霉属与碱解氮含量显著正相关（P<0.05）。曲霉属与 C/N 显著负相关（P<0.05）。膨果期顶孢霉属与碱解氮含量显著正相关（P<0.05），与硝态氮、铵态氮、无机碳含量及电导率极显著正相关（P<0.01），与 C/N 极显著负相关（P<0.01）；葡孢霉属与无机碳含量显著负相关（P<0.05），与电导率极显著负相关（P<0.01）；光黑壳属与 C/N 显著正相关（P<0.05），与硝态氮、铵态氮、无机碳含量及电导率显著负相关（P<0.05），与碱解氮含量极显著负相关（P<0.01）。成熟期葡孢霉属与有机碳含量显著负相关（P<0.05）；链格孢属与电导率极显著正相关（P<0.01）；小囊菌属与 pH 显著负相关 （P<0.05）；被孢霉属与 C/N 显著正相关（P<0.05），与全碳、无机碳含量极显著负相关（P<0.01）；光黑壳属与硝态氮含量、pH 显著负相关（P<0.05），与铵态氮、有机碳含量极显著负相关（P<0.01）。
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图9 土壤理化性质与真菌群落属水平优势物种的相关关系
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3 讨论
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3.1 施氮对真菌群落门水平的影响
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影响土壤中真菌群落结构的因素很多，如土壤利用类型[19]、土壤物理性质、土壤化学性质和植被类型[20]等。研究发现，施肥能够改变土壤真菌的多样性、丰度以及结构[21]。氮肥的施用不仅能够提供作物生长所需的养分，也影响着土壤中真菌的群落结构[22-23]。本研究发现各处理下的真菌优势菌门（平均丰度 >0.1％）为子囊菌门、担子菌门、被孢菌门、罗兹菌门、油壶菌门。其中相对丰度占比最大的为子囊菌门在 80%～90％之间，担子菌门、被孢菌门在 1% 以上，罗兹菌门、油壶菌门占比在 0.1%～1% 之间，与以往学者的研究相似[24-25]，但在具体相对丰度上有一定差异，可能是因为土壤的质地和作物类型的不同[26]。
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子囊菌门为本试验中含量最高的菌门，其在降解有机质等方面发挥重要作用[27]。前人的大量研究表明子囊菌门在土壤门水平分类中占据优势地位[28-29]，其在土壤中的主要作用是分解木质化的植物碎屑[30]，同时子囊菌门的生长也受氮素的影响较大[31]。邓德雷等[32]的研究表明适量的施氮能够提升子囊菌门的相对丰度，但当施氮量过多时，子囊菌的生长就会受到抑制，这与本研究结果相同，施氮前期子囊菌门相对丰度整体提高，但是后期中高氮处理下的相对丰度明显下降，这可能是由于高氮环境会促进病原真菌的产生，改变真菌的群落结构，不利于作物的正常生长[33]。
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担子菌门是一种具有分解有机物特质的腐生类真菌，在降解土壤凋落物的过程中起到关键作用，是土壤中不可或缺的真菌[34]。本研究表明，膨果期担子菌门相对丰度与有机碳含量、pH 显著负相关（P<0.05），与全氮含量极显著负相关（P<0.01）；成熟期担子菌门与全碳、无机碳含量极显著负相关（P<0.01），与 C/N 显著正相关 （P<0.05），说明担子菌门的相对丰度受土壤碳氮含量变化影响较大，施氮会使得土壤中的氮素增加，相关研究表明其中的一些氮素会降低担子菌门胞外相关分解酶的产生，降低其对木质素的利用从而不利于其生长[35]，这与本试验结果一致，相较 N0 处理，各施氮处理下担子菌门均在不同程度上有所下降（除成熟期 N1、N3 处理外）。施氮还能提高土壤碳素含量，碳源提高能够促进真菌的生长，但本研究中的担子菌门相对丰度在 1％左右，其受影响程度较小。
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被孢霉门在土壤中的主要作用是利用土壤中的多糖物质分解纤维素和半纤维素，来提高土壤中的碳素，增加土壤有机碳含量[36]。本研究发现被孢菌门相对丰度整体随施氮全时期表现为较 N0 处理有不同程度的下降，尤其是在膨果期较为显著，说明被孢菌门与土壤氮素养分密切，施氮对被孢菌门有一定抑制作用。罗兹菌门相对丰度整体表现为施氮后较 N0 处理出现一定程度下降。膨果期罗兹菌门与电导率极显著负相关（P<0.01），成熟期罗兹菌门与全碳含量、pH 显著负相关（P<0.05），说明罗兹菌门受电导率、全碳含量和 pH 的变化影响较大，且罗兹菌门相对丰度在施氮后会受到一定抑制。油壶菌门作为一些植物根部的专性寄生真菌，在土壤真菌群落的占比中通常较低[37]。本研究与此相同，油壶菌门在总相对丰度中占比为 0.1%～1％。施氮能适当提升油壶菌门丰度。相关分析表明，膨果期油壶菌门与全碳、有机碳含量显著正相关 （P<0.05），成熟期油壶菌门与有机碳含量显著正相关（P<0.05），说明油壶菌门与土壤有机碳含量关系密切，在养分循环中有至关重要的作用。
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本文相关分析表明土壤 pH 对真菌群落（门水平）的相对丰度影响较大，担子菌门、罗兹菌门与 pH 显著负相关（P<0.05），油壶菌门与 pH 显著正相关（P<0.05）。这一结果与 Xiao 等[38]研究相似，表明 pH 是影响生物群落结构的重要理化因素之一。
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3.2 施氮对真菌群落属水平的影响
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本研究各处理下的真菌优势菌属（平均丰度 1％）共有 12 个，其中在各时期相对丰度大于 25% 的有曲霉属、顶孢霉属、链格孢属、葡孢霉属、假裸囊属，大于 10%、小于 25% 的有光黑壳属、小囊菌属、闭小囊菌属，大于 1% 的有瓶毛壳属、爪甲白藓菌、被孢霉属、沃德霉属，其余菌属相对丰度均在 1% 以下。
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曲霉属真菌、顶孢霉属、链格孢属 3 类菌属在本研究中相对丰度占据优势地位。结果表明随着施氮量的不同，在属水平上各个处理的优势菌种也有一定的差异，坐果期链格孢属 N3 处理的相对丰度达到了 36%（P<0.05），膨果期时曲霉属相对丰度处于优势，尤其是 N1 处理的相对丰度达到了 48% （P<0.05）；膨果期时 N3 处理顶孢霉属的相对丰度也达到了 33%（P<0.05），都较 N0 处理有显著差异。相关分析发现膨果期曲霉菌和顶孢霉属都与 C/N 显著负相关，这说明这些优势菌种对施氮所引起的氮素升高影响显著，施氮在提高土壤养分的同时也可以提高相关优势菌属的相对丰度。
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葡孢霉属相对丰度在坐果期各施氮处理较 N0 处理提升较大，小囊菌属相对丰度在全时期表现为较 N0 处理显著提升，且成熟期 N1 处理较 N0 处理增幅达到 812%（P<0.05），说明施氮对这两类菌属为促进作用，适量的施氮能够增加其相对丰度。
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相关分析发现，坐果期假裸囊菌属与全氮、硝态氮、碱解氮含量显著负相关（P<0.05），与无机碳含量极显著负相关（P<0.01）。膨果期光黑壳属与硝态氮、铵态氮、无机碳含量及电导率显著负相关（P<0.05），与碱解氮含量极显著负相关 （P<0.01）；成熟期与硝态氮含量、pH 显著负相关 （P<0.05），与铵态氮、有机碳含量极显著负相关 （P<0.01）。膨果期葡孢霉属与无机碳含量显著负相关（P<0.05），与电导率极显著负相关（P<0.01）。这三类菌属的相对丰度都与土壤碳氮含量和理化性质呈负相关关系，进一步说明真菌群落组成受土壤养分的影响较多，添加氮肥可能通过影响土壤理化性质，进而改变土壤真菌群落组成。
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被孢霉属整体表现为相对丰度全生育时期施氮处理较 N0 处理在不同程度上下降，但差异不显著，光黑壳属的相对丰度整体表现也与之相同，相关分析表明膨果期光黑壳属与 C/N 显著正相关 （P<0.05），成熟期，被孢霉属与 C/N 显著正相关 （P<0.05），说明碳氮含量的变化也会对一些相对丰度较小的真菌属类有一定影响。
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不同菌属在不同时期表现出的相对丰度变化有所差异，可能是因为坐果期与膨果期这 2 个时期土壤环境（如温度、水分等）不同，同时在旺盛生长期，土壤微生物加快对土壤养分的分解和代谢；根系生长代谢旺盛，根系分泌物增多，释放土壤养分，可促进微生物繁殖，对此还需进一步的深入研究。
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3.3 施氮对群落多样性的影响
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已有大量研究报道了添加氮条件下的土壤微生物多样性的变化[39-41]，但施肥模式对土壤微生物群落多样性指数的影响存在差异。在α多样性指数中，Chao1 和 Observed species 指数越大，表明群落的丰富度越高；Shannon 和 Simpson 指数越高，表明群落的多样性越高；Pielou’s evenness 指数越高表明群落越均匀；Good’s coverage 指数越高，则样本中未被检测出物种所占的比例越少。本研究结果显示，各施肥处理间真菌群落α多样性的变化主要体现在膨果期到成熟期期之间。随着生育期的进行，坐果期和膨果期 N3 处理的 Chao1 和 Observed species 指数最高，说明施氮能够增加真菌的丰富度，成熟期时各施氮处理的 Chao1 和 Observed species 指数明显下降，表现为 N0 处理最高。膨果期和坐果期 N2、N3 处理增加了土壤的 Shannon、Simpson 和 Pielou’s evenness 指数值，成熟期明显下降，说明中高氮施肥能够提升真菌多样性及群落分布均匀度，出现这一情况的原因可能是在旺盛生长期，梨树对养分需要量增加，微生物加快对土壤养分的分解和代谢；同时，香梨生长后期土壤温度回升，湿度较高，大分子有机物分解，根系生长迅速、代谢旺盛，根系分泌物增多，释放土壤养分，可促进微生物繁殖，从而导致在香梨旺盛生长期土壤中真菌多样性变化较为明显，而成熟期的各项指标都在下降[42]。通过 Permanova 检验方法进行组间差异分析，发现 3 个时期下各施肥处理间均无显著差异，由此可知，氮添加对真菌β多样性无显著影响，3 个生育期土壤样品之间较为分散，说明施氮水平对样品的真菌群落组成结构影响较弱。
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土壤微生物多样性与土壤理化性质密切相关[43]，前人研究发现土壤有机质、速效氮等养分含量和 pH、电导率是影响土壤真菌群落多样性变化的主要因素[44-45]，本研究结果与其相似。在坐果期 Good’s coverage 指数与全氮、硝态氮、碱解氮含量显著负相关（P<0.05），与 C/N 极显著正相关 （P<0.01）；Chao1、Observed species 指数与 C/N 显著负相关（P<0.05）。说明土壤氮养分含量是影响真菌多样性变化的重要因素，适宜的增加氮素供给可获得更多样的微生物群落结构，这与张琦等[46]在灌丛化对林草交错带土壤微生物的影响研究所得结论一致，其次，土壤速效氮养分可被微生物直接利用参与土壤氮代谢过程，影响土壤微生物的活动[47-48]。
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在成熟期，Good’s coverage 指数与 pH、电导率显著正相关（P<0.05），与有机碳含量极显著正相关 （P<0.01）；Shannon、Simpson 和 Pielou’s evenness 指数与全碳含量显著负相关（P<0.05）。说明土壤碳养分含量也是影响真菌多样性变化的重要因素，适宜的控制土壤碳供给可以更好地调节微生物群落结构。
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本研究中土壤真菌群落在门水平，土壤理化性质在坐果期、膨果期、成熟期各解释了真菌群落变异的 61.41%、95.14%、97.01%；在属水平土壤理化性质在坐果期、膨果期、成熟期各解释了真菌群落变异的 76.63%、92.00%、89.47%。表明土壤理化性质是影响真菌群落结构变化的主要因素。RDA 分析发现门水平上，坐果期无机碳含量对真菌门水平群落影响达到显著水平（P<0.05）；膨果期全碳、有机碳含量及 pH 对真菌门水平群落影响达到极显著水平（P<0.01），电导率对真菌门水平群落影响达到显著水平（P<0.05）。属水平上坐果期全氮、铵态氮、碱解氮含量及 C/N、pH 对真菌属水平群落影响达到显著水平（P<0.05）；膨果期、成熟期电导率对真菌属水平群落影响达到显著水平（P<0.05）。说明真菌群落的变化也受土壤养分变化影响。张雪等[49]对新疆艾比湖湿地的研究表明，电导率、pH 和土壤养分含量能够对根际真菌的多样性和群落结构产生较大影响。同时不同土壤微生物群落真菌多样性在 N1、N2 处理下显著高于 N0 处理（部分同样高于 N3 处理），这说明不施氮肥或氮肥过度均会显著降低香梨园土壤真菌多样性，这与刘思博等[50]在不同氮浓度对紫花苜蓿根际土壤真菌群落结构影响上的结果一致。综上所述，在合理范围内理化性质和土壤养分含量变化都对真菌群落水平有促进作用。
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4 结论
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施氮后膨果期和坐果期 N3 处理的 Chao1 和 Observed species 指数最高，成熟期下降，施氮能够增加真菌的丰富度，膨果期和坐果期 N2、N3 处理增加了土壤的 Shannon、Simpson 和 Pielou’s evenness 指数值。同样，土壤理化性质能显著影响微生物的群落组成，有机碳、无机碳、全碳含量及电导率、pH 对真菌门水平群落影响达到显著水平；全氮、铵态氮、碱解氮含量及碳氮比、pH、电导率对真菌属水平群落影响达到显著水平。
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综上所述，可通过氮肥添加改变土壤理化性质直接或间接影响土壤真菌群落组成与群落多样性。但也应适当控制氮肥的施入，根据试验结果分析，中高氮（300～450 kg/hm2）施肥能够提升真菌多样性及群落分布均匀度。土壤真菌群落生物多样性主要受碳氮组分含量和电导率、pH 的影响。本文仅对不同氮肥施入量下，各生育期香梨园土壤真菌结构组成、多样性及其与土壤理化性质间的相关性进行了研究分析，但其影响因素还有很多，后续研究中可以设计更多组不同种类氮肥或有机无机肥配施试验，对库尔勒香梨土壤进行分析，同时不同土壤理化性质如何影响土壤真菌群落结构组成变化的问题也还需进一步继续深入研究。
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摘要
探究长期不同氮素水平对库尔勒香梨园土壤（0 ～ 20 cm 土层）真菌群落结构组成及多样性的影响，为库尔勒香梨生产过程中合理施用氮肥提供理论依据。以长期施肥试验为基础，采用高通量测序技术，研究氮肥施用量分别为 N 0、150、300 和 450 kg/hm2 （分别表示为 N0、N1、N2 和 N3）的 4 个处理下库尔勒香梨园土壤理化性质与土壤真菌群落结构组成以及群落多样性的关系。结果表明，各施肥处理土壤中优势真菌门类均为子囊菌门、担子菌门、被孢菌门；优势真菌属类均为曲霉属、顶孢霉属、链格孢属、葡孢霉属、假裸囊属，碳氮含量和土壤理化性质能显著影响微生物的群落组成，高氮施肥能够增加真菌的丰富度。中高氮（N 300 ～ 450 kg/hm2 ）施肥能够提高真菌多样性及群落中的物种分布均匀度，土壤真菌群落生物多样性主要与碳氮组分含量、电导率、pH 间存在显著相关关系（P<0.05）。
Abstract
The aimed to explore the effects of long-term different nitrogen levels on the structural composition and diversity of soil fungal communities（0-20 cm soil layer）in Korla fragrant pear（Pyrus brestschneideri Rehd.）orchards，and to provide a theoretical basis for the rational application of nitrogen fertilizer in the production process of Korla fragrant pear. Based on the long-term fertilization experiment，the relationships between soil physicochemical properties and soil fungal community composition in Korla fragrant pear orchard under four nitrogen application rates of N 0，150，300 and 450 kg/hm2（expressed as N0，N1，N2 and N3，respectively）were studied by using high-throughput sequencing technology. The results showed that Ascomycota，Basidiomycetes and Mortierella were the dominant fungal groups in the soil of all fertilization treatments. The dominant fungal genera were Aspergillus，Acrosporase，Alternaria，Staphylococcus，and Pseudomonas. Carbon and nitrogen contents and soil physicochemical properties significantly affected the composition of microbial communities，while high nitrogen fertilization increased the richness of fungi. Medium to high nitrogen fertilization enhanced fungal diversity and community distribution uniformity，and soil fungal community biodiversity was mainly affected by carbon and nitrogen components contents，electrical conductivity，and pH.