花生是世界上五大油料经济作物之一，广泛种植在亚洲、非洲、南美洲等发展中国家和美国等一些发达国家^[1]。同时，花生也是我国主要的油料作物和经济作物之一，是国产植物油的第二大来源，因其具有良好的耐脊、固氮、经济效益高等特性，近几年在我国种植面积大幅度提高^[2]。在同一块土壤上连续种植同种或同科植物即使是正常的种植管理模式下，作物也会出现长势变弱、病虫害加剧、品质以及产量降低的现象，这种现象叫做连作障碍^[3]。曹云娥等^[4]发现，大规模化和集约化地种植番茄导致番茄土壤微生物种群结构失衡、理化性状恶化、病虫害加重等一系列连作障碍问题。李杨等^[5]发现，黄瓜作为我国设施园艺生产的主要蔬菜作物，逐年增加的栽种面积以及超量施用农药和化肥造成了土壤理化条件改变、健康状况恶化、连作障碍等严重问题。石程仁等^[6]发现，我国花生生产区相对集中，加上种植效益和环境条件等各方面因素的影响，花生连作现象普遍。连作障碍已成为当前我国花生生产面临的突出问题之一。

芽孢杆菌（Bacillus）广泛存在于自然界中，因其具有抗逆性强、耐高温、生防效果好等优点，已成为理想的土传病害的生防菌资源^[7]。近年来，关于贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）作为一种新型生防菌的报道也越来越多，研究主要集中在促进植物生长、拮抗病原菌、诱导植物强化细胞壁、积累防御酶和产生抗菌物质等防御反应等方面^[8]。 Wei 等^[9]研究发现，贝莱斯芽孢杆菌 YW17 可以通过分泌抗真菌脂肽、蛋白质和挥发性物质来抑制致病性尖孢子镰刀菌，从而间接保护了人参免受致病真菌感染。Wang 等^[10]研究发现，贝莱斯芽孢杆菌 Yb-1 对辣椒炭疽病的防治效果为 59.45%，因此贝莱斯芽孢杆菌 Yb-1 对辣椒炭疽病具有良好的生防潜力，能够促进植物生长。申云鑫等^[8]研究发现，贝莱斯芽孢杆菌 SH-1471 具有丰富的抗生素合成基因，同时具有产蛋白酶、解磷、固氮等生物活性，可以显著降低番茄枯萎病的发病率，并对番茄幼苗农艺性状具有显著的促进作用。综上所述，贝莱斯芽孢杆菌在植物病害生物防治方面以及促进植物生长方面具有广阔的应用前景。

虽然贝莱斯芽孢杆菌对植物病原菌的抑菌作用以及促生功能已经有了大量研究报道^[11]，但目前尚未有将贝莱斯芽孢杆菌用于解决土壤连作障碍问题的研究。本试验通过实验室前期从连作花生土壤中筛选、鉴定得到一株编号为 QL-2 的贝莱斯芽孢杆菌来探究其对连作花生土壤的影响。进一步通过测定花生地下和地上部分生长的农艺性状、土壤理化性质、土壤酶活性以及土壤微生物多样性来揭示贝莱斯芽孢杆菌 QL-2 对连作花生土壤连作障碍问题的防治效果。以期将贝莱斯芽孢杆菌作为一种新型微生物菌剂，为解决土壤连作障碍问题提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株贝莱斯芽孢杆菌 QL-2 由天津科技大学食品科学与工程学院实验室于连作土壤的健康花生根系土壤中分离、鉴定并保存；供试花生品种为鲁花 28 号花生种子，由山东鲁花集团有限公司提供；供试贝莱斯芽孢杆菌微生物菌剂（有效浓度为 10⁶ CFU/mL），由天津科技大学食品科学与工程学院实验室提供；供试普通基肥为市售三元复合肥，其成分含量为 N∶P₂O₅∶K₂O=15∶15∶15。

1.2 试验地点

试验于 2022 年 5—9 月在山东省莱阳市鲁花花生种植试验基地（37°06′36.71″N，120°33′ 38.92″ E）进行。该区属典型的北温带大陆性季风气候，年平均温度为 8～19℃，年降水量为 655.6 mm。供试土壤为花生连作 5 年土壤。土壤为典型的砂壤土，基本性状如下：碱解氮 30.38 mg/kg，有效磷 42.07 mg/kg，速效钾 94.65 mg/kg，pH 值 5.72。

1.3 试验设计

田间示范设置对照组和试验组，试验组与对照组之间设隔离带。设 3 个处理：对照组（CK）：面积 0.33 hm²，施用普通基肥，用量为 450 kg/hm²，采用当地常规播种方式，除草、病虫害防治、控旺等采用常规管理措施。试验组一（T10）：面积、品种、播种方式、田间管理技术均同对照组。在此基础上，微生物菌剂于花生播种期以 150 L/hm² 的用量与普通基肥一起混匀，随机械均匀地撒施于土壤中。试验组二（T20）：面积、品种、播种方式、田间管理技术均同对照组。在此基础上，微生物菌剂于花生播种期以 300 L/hm² 的用量与普通基肥一起混匀，随机械均匀地撒施于土壤中。花生于 2022 年 5 月 15 日种植，2022 年 9 月 5 日收获。

1.4 样品采集与测定

1.4.1 采样时间

分别于播种期（5 月 15 日）、花针期（7 月 14 日）、成熟期（9 月 5 日）采取土样、植株样。

1.4.2 样品采集

按照 S 形 5 点取样法，每个小区采集 0～20 cm 耕层土壤混匀，一部分空气干燥后过 2 mm 筛子用于土壤理化性质和酶活性的测定。另一部分储存在-80℃用于微生物分析^[12]。在花针期和成熟期，每个小区随机抽取 3 株，测定植株主要农艺性状。

1.4.3 测定方法

花生的叶片面积使用便携式激光叶面积仪（CI202，Walz，Camas，USA）测定；花生的根系直径和茎秆直径使用镀铬游标卡尺（型号 CHILON 3C2370） 测定。

土壤的 pH 值按照 NY/T1121.2—2006《土壤检测第 2 部分：土壤 pH 的测定》中的方法测定（水土比 2.5∶1）。土壤的碱解氮、有效磷和速效钾含量分别通过扩散吸收法、碳酸氢钠浸提-比色法和乙酸铵浸提-火焰光度法来测定^[13]。

参考关松荫^[14]的方法测定脲酶、蔗糖酶、蛋白酶、过氧化氢酶和酸性磷酸酶 5 种土壤酶的活性。其中脲酶活性采用苯酚钠-次氯酸钠比色法测定，蔗糖酶活性采用 3，5-二硝基水杨酸比色法测定，蛋白酶活性采用茚三酮比色法测定，过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法测定，酸性磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法测定。

使用 Fast Soil DNA 试剂盒（Omega Biotek，Inc.） 进行土壤基因组 DNA 提取。使用 Nano Drop NC2000 UV-vis 分光光度计（Thermo Fisher Scientific， Waltham，MA，USA）测定最终的 DNA 浓度和纯化，并使用 1% 琼脂糖凝胶电泳检查 DNA 纯度。使用以下细菌引物扩增 DNA 样品中 16S rRNA 的 V3～V4 区域：338F（ACTCCTACGGGGGGCAGCA） 和 806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）^[15]。使用条形码引物 ITS1F（CTTGGTCATTTAGAGGAAGAAGTAA）和 ITS2R（GCTGCGTTCTTCATCGATGC）在真菌 ITS 序列区域中扩增真菌 rRNA^[16]。PCR 扩增程序：95℃预变性 3 min，27 个循环（95℃变性 30 s， 55℃退火 30 s，72℃延伸 45 s），72℃稳定延伸 10 min。PCR 扩增体系（20μL）：5×FastPfu Buffer4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2μL，5 μmol/L 上游引物 0.8μL，5μmol/L 下游引物 0.8μL，FastPfu 聚合酶 0.4μL，BSA 0.2μL，模板 DNA 10 ng，补足 ddH₂O 至 20 μL。PCR 产物的建库与测序在上海美吉生物医药科技有限公司完成，测序平台为 Illumina Miseq PE300。

1.5 数据分析

所有试验均设 3 次重复。采用 Excel 2016 进行基础数据处理，SPSS 17.0 进行数据的显著性分析，不同小写字母表示组间差异显著（P<0.05）。使用 Fastp 等软件对原始测序序列进行质控和拼接。优化的数据使用 Uparse 软件，在 97% 的相似度水平下进行操作分类单元（OTU）聚类分析。用 RDP classifier 对 OTU 代表序列进行物种分类注释，细菌比对 Silva 数据库，真菌比对 Unite 数据库，置信度阈值设置为 0.7。基于分类学信息，在各分类水平上进行群落结构的统计分析。使用 Qiime、Mothur、 Mega 等软件绘制样品序列的菌群可视化分析图。以上分析在上海美吉生物医药科技有限公司的生信云分析平台（https://cloud.majorbio.com/）完成。

2 结果与分析

2.1 不同处理对花生生长农艺性状的影响

不同处理对花生生长农艺性状的影响如图1 所示。对花针期和成熟期花生的叶片面积、茎杆直径、根系直径测定的结果（表1）表明，花生的叶片面积、茎秆直径、根系直径具有显著差异（P<0.05）。在花针期，与 CK 组相比，T10 和 T20 组的叶片面积、茎杆直径以及根系直径均具有显著差异（P<0.05），T10 和 T20 组之间除叶片面积外，其他农艺性状均具有显著差异（P<0.05）。T10 组的叶片面积、茎秆直径和根系直径较 CK 分别提高了 22.80%、18.60% 和 24.49%；T20 组的叶片面积、茎秆直径和根系直径较 CK 分别提高了 27.03%、34.88% 和 42.86%。在成熟期，与 CK 组相比，T10 和 T20 组的叶片面积、茎杆直径、根系直径均具有显著差异（P<0.05）， T10 和 T20 组之间只有根系直径表现出了显著差异 （P<0.05）。T10 组的叶片面积、茎秆直径和根系直径较 CK 分别提高了 26.01%、13.73% 和 16.07%；T20 组的叶片面积、茎秆直径和根系直径较 CK 分别提高了 34.75%、19.61% 和 39.29%。

注：花针期（左）和成熟期（右）花生的叶片面积（A）、茎秆直径（B）以及根系直径（C）如图所示。

注：同一列不同小写字母表示处理组间差异显著（P<0.05）。下同。

2.2 不同处理对土壤理化性质的影响

土壤理化性质均受到了微生物菌剂的影响 （表2）。结果表明，在播种期，与 CK 组相比，T10和 T20 组的土壤理化性质无显著差异（P>0.05）。在花针期，与 CK 组相比，T20 组的碱解氮和速效钾含量具有显著差异（P<0.05）。T10 组的土壤碱解氮、有效磷、速效钾的含量分别增加了 18.01%、 5.36%、3.21%，pH 值降低了 2.51%；T20 组的土壤碱解氮、有效磷、速效钾的含量分别增加了 55.42%、 13.87% 和 12.53%，pH 值降低了 5.21%。在成熟期，与 CK 组相比，T10 组的碱解氮和有效磷含量具有显著差异（P<0.05），T20 组的碱解氮、有效磷和速效钾含量均具有显著差异（P<0.05）。T10 组的土壤碱解氮、有效磷、速效钾的含量分别增加了 22.09%、12.03%、7.92%，pH 值降低了 4.12%； T20 组的土壤碱解氮、有效磷、速效钾的含量分别增加了 43.24%、19.01%、19.29%，pH 值降低了 5.15%。

2.3 不同处理对土壤酶活性的影响

对土壤中脲酶、蔗糖酶、蛋白酶、过氧化氢酶和酸性磷酸酶测定结果（表3）表明，在播种期，与 CK 组相比，T10 和 T20 组的酶活性均无显著差异（P>0.05）。在花针期，与 CK 组相比，T10 组的蔗糖酶活性具有显著差异（P<0.05），T20 组的除蛋白酶、过氧化氢酶活性外，其他酶活性均具有显著差异（P<0.05）。T10 组的脲酶、蔗糖酶、蛋白酶和酸性磷酸酶的活性分别提高了 4.35%、72.05%、 2.24% 和 2.44%；T20 组的脲酶、蔗糖酶、蛋白酶和酸性磷酸酶的活性分别提高了 32.61%、133.46%、 7.61% 和 32.11%。在成熟期，与 CK 组相比，T10和 T20 组的脲酶、蔗糖酶和酸性磷酸酶活性具有显著差异（P<0.05）。T10 组的脲酶、蔗糖酶、蛋白酶和酸性磷酸酶的活性分别提高了 12.28%、 70.59%、1.83% 和 15.92%；T20 组的脲酶、蔗糖酶、蛋白酶和酸性磷酸酶的活性分别提高了 18.42%、 120.59%、10.55% 和 38.37%。

2.4 不同处理对土壤微生物群落的影响

基于高通量测序技术对连作花生土壤样本 CK 和 T20 组的细菌和真菌的种类和相对丰度进行分析（图2）。所有土壤样本中的前五大优势细菌门为放线菌门 （Actinobacteria，相对丰度为 16.4%～43.6%），其次是变形菌门（Proteobacteria，相对丰度 27.1%～43.0%）、厚壁菌门（Firmicutes，相对丰度 9.9%～22.9%）、酸杆菌门（Acidobacteria，相对丰度 4.9%～16.1%）、绿弯菌门（Chloroflexi，相对丰度 1.7%～3.4%）。在每个土壤样本中，前五大优势细菌门涵盖了土壤样本中超过 97.53% 的细菌。此外，粘菌门 （Myxococcota）、拟杆菌门（Bacteroidota）和其他菌门存在于所有土壤样品中，其相对丰度分别为 0.38%～1.4%、0.08%～1.0% 和 1.9%～4.1%。在播种期，CK 和 T20 组的细菌种类和相对丰度无明显差异。在花针期，与 CK 组相比，T20 组提高了酸杆菌门的相对丰度。在成熟期，与 CK 组相比， T20 组降低了酸杆菌门的相对丰度，提高了放线菌门的相对丰度。在分类的真菌门中，所有土壤样本中的前五大优势真菌门分别为子囊菌门（Ascomycota，相对丰度 45.58%～88.01%）、担子菌门（Basidiomycota，相对丰度 5.59%～23.35%）、被孢菌门 （Mortierellomycota，相对丰度 2.30%～27.34%）、未分类真菌门（unclassified_k__Fungi，相对丰度 0.18%～6.39%） 和壶菌门（Chytridiomycota，相对丰度 0.34%～6.37%）。在每个土壤样本中，前五大优势真菌门涵盖了土壤样本中超过 98.51% 的真菌。在播种期，CK 和 T20 组的真菌种类和相对丰度无明显差异。在花针期和成熟期，与 CK 组相比，T20 组降低了子囊菌门的相对丰度，提高了被孢菌门的相对丰度。

注：细菌（A）和真菌（B）在门水平下的相对丰度。Seed-CK 为播种期 CK 组；Seed-S 为播种期 T20 组；Flower-CK 为花针期 CK 组；Flower-S 为花针期 T20 组；Mature-CK 为成熟期 CK 组；Mature-S 为成熟期 T20 组。

对土壤样本 CK 和 T20 组中相对丰度前 50 的细菌属和真菌属的聚类分析如图3 所示。对于细菌属，花针期 T20 组和成熟期 CK 组聚为一簇；播种期 CK 组和播种期 T20 组聚为一簇，然后与花针期 CK 组和成熟期 T20 组聚为一簇。微生物群落热图分析结果表明，优势细菌属褚氏杆菌属（Chujaibacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）、热酸菌属（Acidothermus）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）存在于土壤样本的各个时期。随着作物的生长，在花针期，T20 组提高了芽孢杆菌属、热酸菌属和鞘氨醇单胞菌属的相对丰度，降低了褚氏杆菌属和类芽孢杆菌属的相对丰度。在成熟期，T20 组提高了褚氏杆菌属、芽孢杆菌属和热酸菌属的相对丰度，降低了类芽孢杆菌属和鞘氨醇单胞菌属的相对丰度。对于真菌属，播种期 CK 组和播种期 T20 组聚为一簇；花针期 CK 组和成熟期 CK 组聚为一簇，然后与花针期 T20 组聚为一簇；成熟期 T20 组与其他分支聚为一簇。微生物群落热图分析结果表明，优势真菌属曲霉菌属 （Aspergillus）、篮状菌属（Talaromyces）、被孢霉属 （Mortierella）、陶氏菌属（Tausonia）存在于土壤样本的每个时期。随着花生的生长，在花针期和成熟期，T20 组提高了篮状菌属和被孢霉属的相对丰度，降低了曲霉菌属的相对丰度。

注：A 和 B 分别为细菌和真菌在属水平下的群落热图。其中，Seed-CK 为播种期 CK 组；Seed-S 为播种期 T20 组；Flower-CK 为花针期 CK 组；Flower-S 为花针期 T20 组；Mature-CK 为成熟期 CK 组；Mature-S 为成熟期 T20 组。

3 讨论

3.1 贝莱斯芽孢杆菌对花生生长的影响

有研究表明，叶片上的气孔是植物进行光合作用的重要器官，光合作用为植物生长提供物质和能量，是作物产量形成的基础^[17]。根系是植物吸收传导矿物质营养和水分的重要器官，是植物生长发育的动力来源，其生长状况直接影响地上部生长发育及最终产量形成^[18]。Elsoud 等^[19]研究发现，贝莱斯芽孢杆菌菌株 MOST-IAA 可用于增加土壤肥力或生物技术上用于生产吲哚-3-乙酸（IAA），以应用于植物生长改良。本研究表明，添加贝莱斯芽孢杆菌 QL-2 促进了花生地上部分以及根系的生长，为花生的生长发育提供了营养。这可能是由于贝莱斯芽孢杆菌 QL-2 的次级代谢产物产生了 IAA，从而改良了花生的生长。花生网斑病的发生严重影响植株光合效率，并可能造成叶片提早脱落，影响花生后期成熟，给花生产量造成重大损失^[20]。臧超群等^[21]研究发现，贝莱斯芽孢杆菌 BP-1 发酵原液稀释 200 倍后，对花生网斑病的田间防治效果达 60.65%。这与图1 中右 A 显示的结果一致，说明了贝莱斯芽孢杆菌 QL-2 菌液有可能对花生网斑病具有较好防治效果。

3.2 贝莱斯芽孢杆菌对土壤理化性质的影响

土壤肥力指标的变化对于作物的产量和品质具有一定的影响^[22-23]。大量研究表明，施用微生物菌剂可以促进土壤养分的转化，提高土壤有效养分的含量，进而提高土壤肥力，缓解作物因生长繁殖而消耗的养分^[24-27]。本研究结果表明，添加贝莱斯芽孢杆菌 QL-2 提升了土壤碱解氮、有效磷、速效钾的含量，降低了土壤 pH 值。土壤肥力的提高为花生提供了充足的养分，有利于花生的生长。但过酸的土壤反而会不利于花生的生长，贝莱斯芽孢杆菌 QL-2 对土壤引起的酸化问题需要继续深入研究。

3.3 贝莱斯芽孢杆菌对土壤酶活性的影响

土壤酶是土壤中重要的生物活性物质，与土壤物质循环和养分供应能力紧密相关，是评价土壤肥力和土壤环境质量的重要指标^[28]。土壤中脲酶、蔗糖酶、蛋白酶、过氧化氢酶和磷酸酶均参与了土壤的生物化学反应^[29]。其中，土壤蛋白酶和脲酶是土壤中参与有机态氮转化的2种关键酶，脲酶是将土壤中有机氮转化为植物和微生物可以利用的无机氮，也是唯一可以水解土壤中尿素的水解酶；蛋白酶作用于有机氮的矿化，将土壤中植物残体中的蛋白质和肽类物质分解为氨基酸^[30]。蔗糖酶直接参与有机物质的代谢过程，其活性与土壤肥力呈正相关^[31]；过氧化氢酶能减轻土壤中过氧化氢对植物的毒害^[32]；磷酸酶可以提高土壤中有效磷的含量^[33]。有研究发现，多种微生物菌剂对连作障碍均有缓解作用，提高了连作烤烟和连作棉花土壤中脲酶、蔗糖酶、磷酸酶和过氧化氢酶活性^[34-35]。本研究结果表明，贝莱斯芽孢杆菌 QL-2 提高了土壤中脲酶、蛋白酶、蔗糖酶和酸性磷酸酶的活性，但对过氧化氢酶的酶活性无影响，这与上述研究结果不一致。张立恒等^[36]研究发现，接种淡紫拟青霉、木霉和重茬 EB 3 种微生物菌剂均降低了土壤过氧化氢酶活性。微生物菌剂的类型和作物的种类有可能是导致其对连作土壤中过氧化氢酶活性产生不同影响的原因之一。基于以上研究结果表明，贝莱斯芽孢杆菌 QL-2 能提高连作花生土壤中脲酶、蛋白酶、蔗糖酶和磷酸酶的活性，但无法减轻土壤过氧化氢对花生的毒害影响。

3.4 贝莱斯芽孢杆菌对微生物群落的影响

土壤微生物多样性是评价土壤环境的重要指标，指示土壤微生物群落的稳定性，在保持土壤质量和生态系统稳定性等方面具有重要意义^[37]。放线菌能合成多种抗生素及分泌蛋白酶、淀粉酶、几丁质酶等多种水解酶，在防御植物病害中有重要的作用^[38]。外源添加贝莱斯芽孢杆菌改变了土壤微生物中优势菌门的相对丰度，使得放线菌门、被孢菌门的相对丰度提高，子囊菌门的相对丰度降低。有许多种类的子囊菌是重要的植物病原菌，可以引起植物严重病害，子囊菌的营养方式有腐生、寄生和共生，寄生植物可引起植物病害^[39]。吴振强等^[39]研究发现，感染枯萎病辣椒植株的子囊菌门比健康辣椒植株的相对丰度大大提高，而健康辣椒植株的被孢菌门的相对丰度高于感染枯萎病的辣椒植株。这与本研究结果一致，放线菌门相对丰度的提高以及子囊菌门相对丰度的降低可能是防治花生发生虫病害的关键作用之一。Wu 等^[40]研究表明，褚氏杆菌在硫丹胁迫下具有降解有机氯农药的潜能。Zhou 等^[41]研究表明，鞘氨醇单胞菌依赖趋化作用降解多环芳烃，具有生物修复的潜能。杨文玲等^[42]研究表明，芽孢杆菌因生长快、表面积大、抗逆性强等优点在重金属污染土壤修复方面表现出了广阔的应用前景。张丽芳等^[43] 研究表明，花生极易受黄曲霉毒素的污染，黄曲霉毒素主要是由黄曲霉菌和寄生曲霉菌等真菌产生的一类次生代谢产物。本研究结果表明，外源添加贝莱斯芽孢杆菌重塑了土壤微生物群落结构，促进了潜在土壤有益微生物类群的富集，下调了有害微生物的相对丰度。

4 结论

在本研究的田间示范种植试验中，施加贝莱斯芽孢杆菌 QL-2 微生物菌剂（有效浓度为 10⁶ CFU/ mL）能够有效促进花生根系、茎秆以及叶片的生长，增加土壤碱解氮、有效磷和速效钾的含量，提高土壤脲酶、蔗糖酶、蛋白酶以及酸性磷酸酶的活性。此外，施加贝莱斯芽孢杆菌 QL-2 微生物菌剂 （有效浓度为 10⁶ CFU/mL）能够重塑连作花生土壤原本的微生物群落结构，促进土壤有益微生物芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌、褚氏杆菌等的富集以及抑制土壤有害微生物曲霉菌、子囊菌等的生存。贝莱斯芽孢杆菌 QL-2 微生物菌剂为解决花生土壤连作障碍问题提供了一种新型且环保的策略，但不同作物导致的土壤连作障碍问题需要进一步的试验来验证。

参考文献