由于工业排放和农业生产的发展，重金属等不可降解的污染物在土壤中积累，使中国近 20% 的现有耕地被严重污染，对生态环境构成威胁，而土壤重金属污染及相关问题也引起了科学家们的广泛关注^[1]。重金属污染可严重影响植物的生长代谢，且极易在植物体内富集而自身又难以降解，通过食物链的传递进而危害人体的健康^[2]。植物体富集的重金属大多是来自土壤中，已有研究发现，根及根茎类药材中重金属含量与种植土壤中重金属含量呈正相关^[3]，直接影响药材的品质和用药安全。其中，铅（Pb）是重金属污染的主要元素，也是污染较为严重的一种^[4]。Pb 被植物根系吸收能显著改变植物的膜结构和渗透平衡，进而导致叶绿体等重要器官的损伤，降低其光合速率，进而对植物的光合作用产生影响^[5]。

光合作用作为植物物质能量来源的关键代谢过程，对植物的生长发育进程具有重要作用，光合速率、光和荧光参数等相关指标的改变可以反应植物光合作用的强弱和胁迫因子对植物的损害程度。目前重金属 Pb 对人参^[6]、川芎^[7]等根及根茎类药用植物光合作用的影响已有研究，地黄作为根及根茎类中药材，有关 Pb 胁迫对其光合作用影响的研究鲜有报道。

地黄为玄参科植物地黄（Rehmannia glutinosa Libosch.）的新鲜或干燥块根^[8]，具有清热生津，凉血止血的作用，始见于《神农本草经》，是著名的“四大怀药”之一^[9]，不仅用于临床，还用于保健品、食品等，市场需求量较大。土壤是地黄赖以生存的重要载体，土壤重金属污染问题将制约地黄的正常生长发育，甚至对地黄食用性造成巨大威胁^[10]。因此，本试验通过研究不同浓度 Pb 对地黄叶绿素含量、光合特性和叶绿素荧光特性的影响，探究地黄对 Pb 的光合响应特征，以期为解析重金属 Pb 对地黄光合特性的影响机制与农田土地的安全利用及其种植管理提供重要理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

盆栽试验所需土壤采集于河南农业大学试验田，试验田前茬撂荒；供试地黄（Rehmannia glutinosa Libosch.）品种为‘北京 3 号’；所用乙酸铅[（CH₃COO）₂Pb]为国产分析纯。

1.2 试验设计

试验于 2020 年 5—11 月进行。盆栽试验所用土壤风干后粉碎过筛，将 Pb 溶液喷洒至土壤中，混合均匀。土壤陈化两星期后转入塑料盆中，依据温县种植区表层土壤均值在 200 mg·kg^-1[11]和《土壤环境质量标准》（GB 15618—2018）中 Pb 的污染风险管制值，结合预试验，设置对照组 0 mg·kg^-1 及处理组 50、100、200、300 和 400 mg·kg^-1 5 个 Pb 浓度梯度，3 次生物学重复。试验用筒选择上口直径 34.2 cm，下底直径 18.5 cm，高度 22.3 cm 的塑料筒，每筒栽种地黄 1 株，并将其置于试验田进行培养及后期管理。

1.3 测定项目及方法

试验材料分别于 8 月 15 日（膨大初期）、9 月 10 日（膨大前期）、9 月 30 日（膨大中期）、10 月 20 日（膨大后期）和 11 月 10 日（收获期）共 5 个时期取样。每次取样选取不同 Pb 浓度处理下长势一致的 9 株植株，用于测定其相关农艺性状、光合色素、光合及荧光特性。

1.3.1 光合色素含量的测定

参考程贵文方法^[12]稍作改进，采用分光光度法测定叶绿素 a、叶绿素 b 和类胡萝卜素的含量。将地黄叶片去掉中脉后剪碎混合，称取新鲜样品 0.1 g 放入试管中，加入 10 mL 提取液（无水乙醇和与丙酮按照 1∶1 的体积比配置），于黑暗条件下浸提至用肉眼可观察到叶片组织完全变白时，即说明浸提完全，测量其在 663、645 和 470 nm 下的吸光度，提取液调零。叶绿素含量（mg·g^-1）按下列公式计算，设置 3 次重复，取均值进行统计分析。

$\mathrm{叶}\mathrm{绿}\mathrm{素}\mathrm{}\mathrm{a}=（12.72D_{663}-2.59\mathrm{}{D}_{645}）V/（1000W）$

$\mathrm{叶}\mathrm{绿}\mathrm{素}\mathrm{}\mathrm{b}=（22.88\mathrm{}{D}_{645}-4.67\mathrm{}{D}_{663}）V/（1000W）$

$\mathrm{类}\mathrm{胡}\mathrm{萝}\mathrm{卜}\mathrm{素}\mathrm{}=（1000D_{670}-3.27Ca-104Cb）V/229/（1000W）$

式中：D₆₆₃ 表示波长 663 nm 处的吸光值；D₆₄₅ 表示波长 645 nm 处的吸光值；D₄₇₀ 表示波长 470 nm 处的吸光值； V 为提取液的体积（mL）；W 为叶片鲜重（g）；Ca 为叶绿素 a含量（mg·g^-1）；Cb为叶绿素 b含量（mg·g^-1）。

1.3.2 叶绿素荧光及光合特性的测定

采用 Handy PEA 连续激发式叶绿素荧光仪测定叶绿素荧光参数。选取生长中心往外数第三轮功能叶片，避开主叶脉，进行 30 min 暗适应后进行测定。

选择晴朗天气的上午 09：00—11：00 使用 Li-6400XT 光合仪进行测定，选取植株从生长中心往外数第三轮的功能叶片，避开主叶脉选择叶片中间部位进行测定净光合速率、气孔导度、胞间 CO₂ 浓度、蒸腾速率，每个地黄植株测 3 片叶片，取其平均值用于统计分析。

1.4 数据统计分析方法

采用 Excel 2015 整理原始数据，使用 SPSS 25.0 进行单因素方差分析、相关性分析、逐步回归分析和主成分分析，差异显著性检验采用 LSD 法，显著性水平设定为α=0.05。图表采用 Excel 2015 和 GraphPad Prism 制作，采用在线工具 ChiPlot（https：// www.chiplot.online/）进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 铅胁迫对地黄地上部农艺性状的影响

由图1 可见，在地黄膨大前期叶片数随土壤中 Pb 浓度的增加表现为先升高后降低，其余各时期地黄叶片数均逐渐减少，高浓度 Pb（400 mg·kg^-1） 处理下地黄各生育期的叶片数均下降到最低值，分别为 10.33、14.00、12.67、11.33 和 12.00 片· 株^-1，较对照显著（P<0.05） 降低了 63.95%、56.25%、 61.22%、66.34% 和 54.43%（图1A）。在地黄膨大初期最大叶长随土壤中 Pb 浓度的增加逐渐降低，其余各时期变化均为先升高后降低，在地黄膨大前期至膨大后期（9 月 10 日至 10 月 20 日）在 50 mg·kg^-1 Pb 处理下叶长达到最大，分别为 21.00、22.97 和 23.23 cm，较对照升高了 14.55%、16.19% 和 34.30%（图1B）。在地黄膨大初期（8 月 15 日）最大叶宽随土壤中 Pb 浓度的增加逐渐降低，其余各时期均表现为先升高后降低，随生育进程的推进各处理均在地黄膨大中期（9 月 30 日）达到最大值，分别为 8.00、8.57、8.80、7.40、7.13 和 6.50 cm（图1C）。在地黄膨大初期至膨大中期（8 月 15 日至 9 月 30 日）叶厚随着土壤中 Pb 浓度的增加呈现为先升高后降低的趋势，且均在 50 mg·kg^-1 处理下达到最大值，其中在地黄膨大初期至膨大前期（8 月 15 日至 9 月 10 日）叶厚较对照显著（P<0.05）升高了 11.21% 和 12.39%（图1D）。

注：不同小写字母表示同一取样时间不同铅浓度处理间差异显著（P<0.05）；下同。

2.2 铅胁迫对地黄叶片光合色素含量的影响

由图2 可见，随土壤中 Pb 浓度的升高，地黄在整个生育期内的光和色素含量均表现为先升高后降低的趋势，但不同生育期光合色素含量达最大值的 Pb 浓度有所不同。在地黄膨大初期（8 月 15 日），叶绿素 a、叶绿素 b、类胡萝卜素和叶绿素总量在 100 mg·kg^-1 处理下达到最大值，分别为 1.24、1.25、0.56 和 2.49 mg·g^-1，较对照分别增加了 17.03%、22.32%、 21.18% 和 17.74%；在地黄膨大前期（9 月 10 日）叶绿素 a、叶绿素 b、类胡萝卜素和叶绿素总量在 200 mg·kg^-1 处理下达到最大值，分别较对照增加了 18.89%、17.18%、31.91% 和 16.59%；在地黄膨大后期至收获期（10 月 20 日至 11 月 10 日），光合色素均在 50 mg·kg^-1 处理下达到最大值，叶绿素 a 含量分别较对照显著（P<0.05）增加了 47.93% 和 62.16%，叶绿素 b 含量分别较对照增加了 43.86% 和 60.89%，类胡萝卜素含量分别较对照增加了 40.97% 和 48.79%。由此可知，当 Pb 浓度较低时，可以促进地黄的生长，而高浓度 Pb 会抑制地黄的正常生长，使其叶绿素 a、叶绿素 b、类胡萝卜素和总叶绿素含量下降。

2.3 铅胁迫对地黄叶片光合参数的影响

由图3 可知，净光合速率、气孔导度和胞间 CO₂ 浓度在地黄膨大初期至膨大前期（8 月 15 日至 9 月 10 日）随 Pb 浓度的升高逐渐降低，在膨大中期至收获期（9 月 30 日至 11 月 10 日）随 Pb 浓度的升高表现为先升高后降低；蒸腾速率在整个生育期内随 Pb 浓度的升高呈下降趋势。在膨大初期（8 月 15 日）和膨大前期（9 月 10 日）气孔导度和胞间 CO₂ 浓度随土壤 Pb 浓度的增加逐渐降低，且在 50 mg·kg^-1 浓度处理下达到最大值，在 400 mg·kg^-1 浓度下为最小值。在地黄膨大初期（8 月 15 日）蒸腾速率随 Pb 浓度升高而下降，在膨大前期至收获期 （9 月 10 日至 11 月 10 日）随 Pb 浓度的增加表现为先升高后下降的变化趋势。由此可知，高浓度 Pb 处理会显著抑制地黄叶片的净光合速率、气孔导度、胞间 CO₂ 浓度及蒸腾速率参数。

2.4 铅胁迫对地黄叶绿素荧光参数的影响

由图4 可知，电子传递速率（ETR）、光合量子产量[Y（Ⅱ）]、光化学淬灭系数（qP）、非化学淬灭系数（NPQ）、最大荧光（Fm）和初始荧光 （Fo）在地黄整个生育期内均表现为低浓度促进、高浓度抑制。qP 在地黄整个生育期内随 Pb 浓度的升高逐渐降低，Pb 浓度越高，qP 降低幅度越大，且均在高浓度 Pb（400 mg·kg^-1）处理下降到最低值，分别较对照降低了 30.90%、30.76%、25.15%、 51.94% 和 64.85%；在地黄膨大初期至中期（8 月 15 日至 9 月 30 日），ETR、Y（Ⅱ）、Fm 和 Fo 随 Pb 浓度的升高呈先升高后降低的趋势，在膨大后期至收获期（10 月 20 日至 11 月 10 日）则逐渐降低；在地黄膨大后期至收获期（10 月 20 日至 11 月 10 日）NPQ 在高浓度 Pb（400 mg·kg^-1）处理下较对照分别降低了 58.17%、67.25%。

2.5 各指标间相关性分析

由图5 可知，叶绿素 a 与叶绿素 b、叶绿素总量达到极显著正相关，相关系数分别为 0.99 和 1.00； 净光合速率与胞间 CO₂ 浓度、最大荧光和初始荧光达到极显著正相关，相关系数分别为 0.93、0.96 和 0.98；气孔导度与蒸腾速率、胞间 CO₂ 浓度、Y（Ⅱ）和 Fm 均达到极显著正相关，相关系数分别为 0.99、0.98、0.92 和 0.95；蒸腾速率与胞间 CO₂ 浓度、Fm 和 Fo 达到极显著正相关，相关系数分别为 0.99、0.98 和 0.93；ETR 与 Y（Ⅱ）、qP、NPQ 均达到极显著正相关，相关系数分别为 0.95、1.00 和 1.00。所有单项指标间都存在或大或小的相关性，使反映的信息发生重叠，简单相关分析较难准确评价地黄对铅的耐受性，进行耐受性综合评价更具有可比性和准确性。

注：X₁～X₁₄ 依次为叶绿素 a、叶绿素 b、叶绿素总量、类胡萝卜素、净光合速率、气孔导度、蒸腾速率、胞间 CO₂ 浓度、电子传递速率、光合量子产量、光化学淬灭系数、非化学淬灭系数、最大荧光、初始荧光。下同。

由表1 和表2 可知，运用主成分法对各指标进一步分析，可以把原来的 14 个单项指标转化成 2 个综合指标，这两个综合指标的累积贡献率分别为 54.537% 和 42.328%，总贡献率为 96.864%，说明这两个综合指标可以概况 14 个指标所包含的 96.864% 的信息^[13]。通过对地黄各生长生理指标进行隶属函数综合分析，以综合评价其对 Pb 的耐受性，用综合评价值作为标准来判别地黄对各浓度 Pb 的耐受性强弱。地黄在光合特性方面对 6 种浓度 Pb 的耐受性顺序为 50 mg·kg^-1 处理 >100 mg·kg^-1 处理 >0 mg·kg^-1 处理 >200 mg·kg^-1 处理 >300 mg·kg^-1 处理 >400 mg·kg^-1 处理。

注：μ（1）、μ（2）为综合指标值，R1、R2 为隶属函数值。

3 讨论

3.1 铅胁迫抑制地黄光合色素含量的积累

叶绿素是植物进行光合作用中吸收光的主要色素，叶绿素含量的高低直接影响植物光合作用能力的强弱，决定其新陈代谢能否正常进行^[13]。重金属胁迫会破坏光合过程的完整性，进一步影响植物的光合作用^[14]，通过叶绿素含量的变化可以反映重金属对植物的损害程度。本研究结果表明，叶绿素 a、叶绿素 b、类胡萝卜素和总叶绿素含量在地黄整个生育期内随土壤中 Pb 浓度的升高均表现为先升高后降低。这与在不同 Pb 浓度胁迫下活血丹叶片叶绿素含量呈先增后减的变化趋势相一致，且低浓度 Pb 处理可促进其生长，而高浓度 Pb 则抑制生长^[15]；薛文秀等^[16]研究表明，低浓度 Pb 可以增强叶绿体的酶活性，从而促进植物体内叶绿素的合成，高浓度 Pb 可加速植物体内叶绿素的分解，这与本研究结果相符。Pb 胁迫下之所以会降低植物中叶绿素含量，是由于 Pb 元素影响了植物光合作用的进程，光合产物的输出减少，从而破坏叶绿体的结构，导致叶绿素合成减少^[17]。

3.2 铅胁迫抑制地黄叶片光合参数

当植物受到 Pb 毒害时，光合过程会受到一定程度的破坏，影响光合产物和其供能，从而抑制植物的生长^[18-19]。净光合速率可直接体现光和系统的功能，是判断植物光和系统正常与否的主要指标，而气孔导度和胞间 CO₂ 浓度是评价气孔限制作用的重要指标，二者以相同的方向变化时，又可作为判断植物光合作用下降的主要依据^[20-21]。本研究表明，地黄对 Pb 胁迫有一定的耐受性，当 Pb 浓度超过了地黄的耐受范围就会抑制其光合作用的正常进行。在地黄膨大初期叶片的蒸腾速率随 Pb 浓度的升高则逐渐降低，而膨大前期至收获期呈现为先升高后降低的变化趋势，这与在活血丹中的研究结果类似，当 Pb 浓度较低时，活血丹叶片的蒸腾速率升高的幅度较小，超过一定浓度其叶片的蒸腾速率就显著降低^[15]。从地黄不同生育期叶片的气孔导度和胞间 CO₂ 浓度变化来看，在高浓度 Pb 胁迫下气孔导度和胞间 CO₂ 浓度显著降低，且与同时期的净光合速率变化趋势一致，由此可见，Pb 胁迫对地黄叶片光合能力的抑制作用可能是气孔限制引起的。

3.3 铅胁迫对地黄叶绿素荧光参数及生长的影响

叶绿素荧光动力学参数能够较好地反映植物体内光合作用的信息，全面反映植物叶片光合作用中能量的吸收和消耗，较为完整地描述植物光合生理的动态变化过程^[22-23]。余国源^[24]研究表明 Pb 处理可降低伞房决明光合电子的传递速率，高浓度 Pb 胁迫下 Fm、qP 和 NPQ 值显著下降，而 Fo 值则显著上升，本研究也得到了类似结果，在地黄生育后期 ETR 随着 Pb 浓度的升高逐渐降低，表明其光合电子的传递速率降低，从而降低了其净光合速率。Fm 在高浓度 Pb 处理下（>300 mg·kg^-1） 显著降低，表明地黄产生了光抑制现象，且高浓度 Pb 胁迫下对地黄光系统Ⅱ的潜在活性有一定的破坏作用。qP 是由光合作用引起的荧光淬灭，反映植物光合活性的高低；NPQ 则是由热耗散引起的荧光淬灭，反映光保护能力的强弱。Pb 浓度大于 200 mg·kg^-1 时，地黄各生育期 qP 和 NPQ 值的变化趋势一致，均是降低的，表明在 Pb 胁迫下地黄的光和系统被破坏，其光合活性降低、光保护能力较弱。本研究发现，在地黄膨大初期 Fo 值均显著高于对照，地黄膨大前期至收获期高浓度 Pb 处理（>300 mg·kg^-1）下则显著低于对照，这与余国源^[24]的研究结果相反，可能是地黄在不同生育期对 Pb 的耐受能力强弱存在差异。

植物对重金属的耐受性是一种多因素共同作用的复杂机制，在不同生育时期可通过相应指标的一系列反应来表示。本研究表明，随着 Pb 处理时间的延长，地黄的光合系统造成了不可逆的损伤，导致光合速率的降低，进而影响地黄的生长。在 0～100 mg·kg^-1 的 Pb 处理下，地黄通过吸收光能，增强光合作用对抗 Pb 胁迫的能力，而高浓度 （>100 mg·kg^-1）的 Pb 处理对地黄的生长产生显著的抑制作用，在细胞膜脂氧化和气孔限制的影响下，地黄光合作用减弱，生长受到一定的伤害。

4 结论

在地黄整个生育期内，随着 Pb 浓度的升高，叶绿素 a、叶绿素 b、类胡萝卜素和叶绿素总含量均表现为先升高后降低。ETR、Y（Ⅱ）、NPQ、 Fm 和 Fo 均表现为低浓度促进、高浓度抑制，其中 ETR 和 Y（Ⅱ）在地黄生育后期随着 Pb 浓度的升高逐渐降低，qP 在整个生育期内逐渐降低，Pb 浓度越大，降低幅度越大。地黄在 6 种 Pb 浓度处理下，其光合特性的耐受性强弱为 50 mg·kg^-1 处理 >100 mg·kg^-1 处理 >0 mg·kg^-1 处理 >200 mg·kg^-1 处理 >300 mg·kg^-1 处理 >400 mg·kg^-1 处理，当超过一定浓度时地黄对光合特性的耐受性逐渐降低。

本研究解析了不同浓度 Pb 处理对地黄不同生育期内生长指标及光合特性的影响，表明 Pb 胁迫对地黄的生长具有明显的抑制作用，该研究仅从生理方面解析了地黄对 Pb 胁迫响应的关系，仍需更系统地探究铅胁迫对地黄中有效成分的影响，这也将为深入探讨地黄对重金属胁迫的应答机制提供理论依据。

参考文献