烟草是我国重要的经济作物，在保障农民收入和国家税收等方面具有重要作用。山东省是国内种植烤烟历史最为悠久的地区之一，其独特自然气候条件为烟草的种植提供了天然优势。烟草业作为山东省传统的农业经济作物，具有极大的经济价值。近年来，随着烟草种植区连作年限的增加，土壤肥力不断下降，土传病害病原菌不断积累以及不合理的化肥和化学农药的使用，导致烟草青枯病危害范围扩大，流行速度加快，造成了严重的经济损失。

烟草青枯病是由茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的细菌性土传病害^[1]，茄科雷尔氏菌存在于土壤中或遗留在土壤中的病残体上，主要通过病土、病残组织及带菌肥料等初侵染源进行侵染，病原菌多从烟草植株根部的伤口侵入^[2]，在发病后期可导致整株烟草的死亡^[3]，严重影响烟草的产量，进而造成严重的经济损失。目前针对烟草青枯病的研究主要集中在合理耕作、化学防治以及研发生防菌剂等产品方面^[4]。近年来相关研究表明，病害的发生发展与土壤微生物之间相互作用以及微生物群落失衡密切相关^[5]。从烟草青枯病的病害循环过程来看，土壤及其微生物群落结构对烟草青枯病侵染过程存在着一定的影响，而这一侵染过程同时也会反作用于土壤微生物菌落结构。因此，随着国家绿色防控的需要以及测序技术的发展，以调节烟草根际土壤微生态环境为手段来抑制土传病害的发生正成为研究热点^[6]。有研究^[7]发现，烟草青枯病抑病土壤中有益细菌主要存在于放线菌门（Actinobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes） 和蓝藻门（Cyanobacteria）。从属水平上看，抑病土壤中慢生根瘤菌属（Mesorhizobium）、亚硝化螺菌属（Nitrosospira）、贪铜菌属（Cupriavidus） 等细菌属的相对丰度显著高于发病土壤。与未发病土壤相比，烟草青枯病发病土壤细菌群落结构多样性更高，鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、节杆菌属（Arthrobacter）、假单胞菌属（Pseudomonas）相对丰度的增加可能是降低烟田青枯病发病的关键因素^[8]。樊俊等^[9]研究表明，烟草青枯病的发生对鞘氨醇单胞菌属、土壤红杆菌属（Solirubrobacter）、根瘤菌属（Rhizobium）的 OTUs 数量有显著降低效果，可认为鞘氨醇单胞菌属、根瘤菌属的 OTUs 数量与病情指数的相关性达到显著水平（P<0.05），是影响烟草青枯病发生的关键因子。

土壤微生物具有数量众多、种类丰富和功能复杂等特点，随着微生物组学技术的不断发展，从土壤微生物这一角度解析烟草青枯病发病特点，为烟草青枯病防治策略的研究提供了更广阔的思路。虽然相关研究表明茄科雷尔氏菌数量不是烟草是否发病的限制性因素^[10]，但对烟草青枯病整个发病过程中，土壤微生物之间互作关系的研究尚在起步阶段。本研究通过对山东省沂水县四十里烟站烟草青枯病发生土壤，以一定时间间隔来研究从未发病到发病，烟草青枯病整个发病过程中，随着时间变化，土壤微生物群落结构的动态变化过程。通过对土壤微生物群落结构动态变化的解析，明确烟草青枯病发病过程中不同阶段烟草土壤中的优势菌群及其随时间变化的趋势，将这一动态变化过程和病原菌相结合进行相关性网络分析，发现潜在的有益细菌菌属，明确潜在的病害发生预警微生物和新的生防微生物资源，为防控烟草青枯病，避免烟草产量损失，提升烟草产量和品质提供借鉴和参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

自山东省临沂市沂水县四十里烟站，通过定地块连续动态采样，采用五点取样法分别采集烟苗移栽前、青枯病病发初期、青枯病发生后间隔一定时期，共计 24 份烟草根际土壤样品（表1）。

1.2 土壤基因组的提取与检测

利用 FastDNA Spin Kit For Soil（MP） 试剂盒提取 DNA。研钵灭菌后加入液氮，将 0.5 g 新鲜土壤样品研磨至粉状，装入 Lysing Matrix E tube 中，按照 MP 试剂盒说明书完成基因组提取，随后利用核酸定量仪（Nanodrop one）测定提取的 DNA 核酸浓度与纯度，并将 DNA 于-20℃冰箱中保存备用。

1.3 16S rRNA PCR 扩增及扩增子样品的准备

以土壤 DNA 为模板，利用带有不同 barcode 序列的 V3～V4 区通用引物 534F（5′-CCAGCAGCCG CGGTAAT-3′）和 783R（5′-ACCMGGGTATCTA ATCCKG-3′）进行 16S rRNA 扩增^[11]。50 μL PCR 扩增体系包含 2×Mix 25 μL，上下游引物各 10 ng，模板 DNA 30 ng，ddH₂O 补足至 50 μL；PCR 反应程序：95℃预变性 3 min；94℃变性 45 s，53℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，共 35 个循环；72℃延伸 10 min。扩增结束后，使用 OMEGA 胶回收试剂盒进行胶回收，并经 Nanodrop 检测浓度。按照 marker 250 bp 条带的净光密度值标准化后进行等质量 DNA （150 ng）混样，采用双端 Nova-PE250 模式在北京奥维森基因科技有限公司进行测序。

1.4 扩增子数据处理和分析

将包含正向、反向序列文件的 16S rRNA 基因原始测序数据与 barcode 序列文本文件上传至 Galaxy 平台；去除 barcode 序列与正反向引物序列；利用 Flash 工具将正反向序列拼接；去除非细菌序列后生成降维的特征表进行下游分析^[12]。将序列按照 97% 的相似度水平进行聚类，生成 OTU（Operational Taxonomic Units）表进行后续分析。利用 Chao1 和 Shannon 指数来表征根际土壤微生物群落 α 多样性；基于 Bray-Curtis 相异性指数对微生物群落相似性进行主成分分析（Principle coordinate analysis，PCoA）；利用 Heatmap 将 24 份样品中组间差异微生物更直观地呈现； 基于 LDA>2，P<0.01 参数计算 LEfSe（LDA Effect Size），发现和解释高维度数据生物标识，获取差异菌群； 基于 SparCC 算法进行群落相关性网络分析，利用 Gephi（v 0.9.2） 对网络化数据进行分析；使用在线平台 MicrobiomeAnalyst（https：//www. microbiomeanalyst.ca/） 和 ImageGP（http：//www.ehbio. com/ImageG/）进行数据可视化；利用 SPSS 27.0 完成方差分析^[13]。

2 结果与分析

2.1 烟草根际土壤细菌群落的组成分析

山东省沂水县四十里烟站 24 份烟草根际土壤样品共产生 588192 条 16S rRNA 基因序列。利用 RDP 数据库注释后，所有各个采样时期样本共检测到 60个细菌纲（图1A），以α-变形菌纲（Alphaprotobacteria）、γ-变形菌纲（Gammaprotobacteria）、酸杆菌纲（Acidobacteriae）、放线菌纲（Actinobacteria）为主。其中，γ-变形菌纲、放线菌纲（Actinobacteria）、纤线杆菌纲（Ktedonobacteria）、拟杆菌纲（Bacteroidia） 等菌纲在青枯病病发初期的样品中显著富集，而酸杆菌纲在移栽前时期的样品中显著富集（SS_A= 4884.33a，SS_B=1382c，SS_C=2782.67bc，SS_D= 3118.67b，SS_E=3273ab，SS_F=2670.67bc，SS_G= 3373ab，one-way ANOVA，P=0.017）。在属水平（图1B），可以观察到假节杆菌属（Pseudarthrobacter）、副伯克霍尔德氏菌属（Paraburkholderia）、芽孢菌属（Bacillus）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas） 在青枯病病发初期的样品中显著富集。整体来看，青枯病病发初期的烟草根际土壤微生物群落组成与移栽前存在显著差异，青枯病的发生显著影响烟草根际土壤微生物的群落结构。

注：A 图为纲水平根际细菌群落组成；B 图为属水平根际细菌群落组成；图注纲水平只列出百分比前 10 的菌纲，属水平只列出百分比前 20 的菌属。

2.2 烟草根际土壤细菌多样性分析

Alpha 多样性分析通过 Chao1 和 Shannon 指数来描述烟草根际土壤的微生物组成的丰度和丰富度差异。综合分析不同生长时期烟草根际土壤样品的根际微生物多样性，发现青枯病病发初期土壤样品的多样性指数均值与中位数均小于其他时期土壤样品（图2），这表明青枯病的发生会导致烟草根际土壤微生物的丰度和丰富度显著下降。

比较各个时期土壤样品的细菌群落差异，发现在 OTU 水平和属水平下，移栽前的土壤样品（SS_ A）与青枯病病发初期之后的土壤样品（SS_C～G） 的多样性指数间不存在显著性差异，但青枯病病发初期（SS_B）土壤样品的多样性指数与其他时期土壤样品存在显著差异，土壤样品的微生物丰度和丰富度呈现显著下降趋势（图2）。

基于 Bray-Curtis 相异性指数计算样品间微生物多样性的差异，发现青枯病病发初期（SS_B） 的烟草根际细菌群落结构在 OTU 水平和属水平上均显著区别于其他时期的烟草根际细菌群落结构 （OTU 水平：P<0.01，R² =0.39575，属水平：P<0.01， R² =0.43392，图3），青枯病的发生显著地改变土壤微生物群落组成，与 α 多样性结果保持一致。而青枯病发病后各个时期（SS_C～G）土壤样品的微生物群落结构与移栽前的土壤样品的微生物群落结构无显著差异。

2.3 不同时期烟草根际土壤菌属差异

通过构建微生物表达量热图，将 24 份烟草根际土壤样品在属水平进行数据可视化，并进行聚类分析（图4），结果表明，移栽前（SS_A）、青枯病病发初期（SS_B）的土壤样品中属水平微生物表达模式明显区别于青枯病状发生后（SS_C～G）的土壤样品，移栽前的土壤样品与青枯病病发初期的土壤样品也存在着显著差异的菌属。而从树状聚类分析来看，移栽前这一时期的土壤样品虽然存在与青枯病状发生后的土壤样品显著差异的菌属，但移栽前表达量高的菌属在青枯病状发生后依然存在明显的表达，而在青枯病病发初期则表达量明显下降。这再次说明青枯病的发生显著改变土壤微生物群落组成，且青枯病病发初期（SS_B）群落组成改变尤为明显。

注：A 为不同采样时期样品属水平的 Chao1 指数对比；B 为不同采样时期样品属水平的 Shannon 指数对比；C 为不同采样时期样品 OTU 水平的 Chao1 指数对比；D 为不同采样时期样品 OTU 水平的 Shannon 指数对比；图中◆为平均值。

注：A 图为 OTU 水平的 β 多样性分析；B 图为属水平的 β 多样性分析。

2.4 不同时期烟草根际细菌菌群网络相关性分析

通过构建相关性网络发现，鞘氨醇菌属、黄色土壤杆菌属（Flavisolibacter）、嗜酸杆菌属 （Acidibacter）、FCPS473、o_B12-WMSP1、c_ Acidobacteriae 等在相关性网络构成中与其他微生物类群具有更高的关联性，同时也是相关性网络图中的重要组成部分（图5A）。而从网络节点微生物分析图（图5B）来看，寡养单胞菌属、链霉菌属（Streptomyces）、小粒胞菌属（Granulicella）的微生物为连接节点（Connector hub）；黄色土壤杆菌属、无色杆菌属（Achromobacter）、出芽单胞菌属（Gemmatimonas）、居土杆菌属（Humibacter）、雷夫松氏菌属（Leifsonia）、弯曲杆状菌属（Flexivirga）、 Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium 等为模块节点（Module hub），其中寡养单胞菌属、 FCPS473、小粒胞菌属、Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium 在属水平的物种注释柱状图中占比靠前（图1B），并且在青枯病病发初期 （SS_B）的丰富度变化最为显著。

注：A 图为烟草根际土壤微生物网络；B 图为网络节点的 Zi-Pi 分析；C 图为不同采样时期根际土壤样品间丰度差异分析；D 图为 SS_B 时期 LEfSe 与网络关键节点 OTU 的 Venn 分析。

进一步使用 LEfSe 来分析不同时期根际样品间的差异微生物类群（图5C），通过比较发现，OTU_269 克雷伯氏菌属（Klebsiella）、OTU_2567 肠杆菌属 （Enterobacter）、OTU_169（Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia）、OTU_6515 链霉菌属、OTU_8201 新鞘氨醇菌属（Novosphingobium）、OTU_7655 鞘氨醇菌属、OTU_4926 出芽单胞菌属等 LDA 值均 >2，表明在组间存在显著差异，同时相比于移栽前，在青枯病病发初期（SS_B）的根际土壤中占比显著升高。

结合 LEfSe 与相关性网络分析，通过 Venn 图寻找二者之间的共有 OTU（图5D），根据这些共有 OTU 获得了与烟草青枯病关联性较高的关键微生物类群（表2），也发现烟草根际微生物群落存在改变菌群结构来响应病原菌侵染的特点。

3 讨论

烟草青枯病在我国主要产烟省区普遍发生，甚至在个别年份暴发流行，给我国烟草生产造成巨大损失^[14-15]。目前针对烟草青枯病，防治手段仍然以化学防治为主，优化栽培措施为辅^[4]。近年来，随着绿色发展的需求，生物防治逐渐成为较为普遍的防治手段，然而，应用于生物防治的微生物菌剂存在菌株来源单一、大田中实际防效波动较大、防效不稳定等问题，单纯地施用微生物菌剂难以达到防治需求^[16]。微生物组学是近年来探究植物-微生物互作的热点方向，研究植物根际微生物组成随植株健康状态变化，可为有益生防微生物的筛选和微生物制剂、肥料的合理利用提供参考^[17-19]。

已有研究表明，植物发病与否并不单独由病原菌和有益微生物的丰度决定，而是受多种微生物之间的相互作用共同影响^[20]；同时，微生物多样性的降低是土传病害发生的重要原因^[6]；樊俊等^[9]研究发现，鞘氨醇单胞菌属、根瘤菌属的 OTUs 数量与病情指数具有显著相关性（P<0.05），是影响烟草青枯病发生的关键因子；黎妍妍等^[21] 也发现，鞘氨醇单胞菌属、出芽单胞菌属、假单胞菌属、溶杆菌属（Lysobacter）、链霉菌属等有益细菌的相对丰度在青枯病发生阶段显著升高。本研究发现，与移栽前烟草根际土壤微生物多样性相比，青枯病病发初期根际土壤微生物多样性显著降低，与很多相关报道的结论相一致^[6]。但是随着青枯病的发展，后续根际土壤微生物多样性呈现恢复到移栽前水平的趋势。植物土传病害的发生与植物根际微生物多样性等密切相关，针对四十里烟站，本研究推测，受到病原菌的侵染时，植物存在快速响应机制，能够快速招募有益微生物，提升有益微生物丰度。青枯病病发初期，随着茄科雷尔氏菌丰度的升高，原有根际土壤微生物群落结构被破坏，除了与病原菌相关性较强的微生物外，其他微生物类群的生存空间被压缩，致使烟草根际土壤微生物多样性降低（图2），同时在青枯病病发初期根际土壤样品（SS_B）中芽孢杆菌属、寡养单胞菌属、Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium、假节杆菌属等有益细菌显著富集^[22-26]。而随着病情的发展，根际土壤微生物的多样性逐渐趋于动态平衡，恢复到与移栽前根际土壤样品（SS_A）的多样性指数间无显著性差异。

微生物作为土壤生态系统中最活跃的部分^[27]，其动态变化能够在一定程度上对病害的发生起到预警作用，并且对微生物群落结构的调控也能够起到防治病害的效果。而通过构建从未发病到发病以及发病后的植株发病动态过程的根际土壤微生物互作网络以及 LEfSe 分析，并通过 Venn 图获得二者之间共有的 OTU 类群，发现这些 OTU 属于鞘氨醇菌属、黄色土壤杆菌属、寡养单胞菌属、链霉菌属、小粒胞菌属、无色杆菌属、出芽单胞菌属、居土杆菌属、雷夫松氏菌属、弯曲杆状菌属、束缚菌属（Conexibacter）、Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium 等，它们在整个病害发生动态过程中占据重要网络位置，其中，鞘氨醇菌属、黄色土壤杆菌属、链霉菌属为已经报道过的具有一定功能，对根际土壤健康起稳定作用的菌属^[28-30]，而小粒胞菌属、无色杆菌属、出芽单胞菌属、居土杆菌属、弯曲杆状菌属、束缚菌属等为报道较少或尚未被报道的菌属，这些菌株与青枯病的发生存在潜在的作用关系，监测土壤中这些微生物的丰度可以对青枯病的发生起到预警作用，同时也丰富了微生物生防制剂开发的菌种来源，为青枯病的防治提供新的生防资源。

4 结论

本研究重点调查了山东省沂水县四十里烟站的烟草植株发病情况，采集了烟草植株从未发病到病症显现再到发病后期的根际土壤样品。通过微生物组学分析发现，四十里烟站烟草的青枯病发生会显著降低根际土壤微生物的多样性，在发病 7 d 后根际土壤微生物的多样性指数能恢复到发病前的状态。本研究通过结合共现性网络及差异菌群分析，最终在烟草发病动态过程中发现小粒胞菌属、无色杆菌属、出芽单胞菌属、居土杆菌属、弯曲杆状菌属、束缚菌属与青枯病的发生存在潜在的作用关系。

参考文献