黑土地是宝贵的环境资源，具有高肥力、高生产力和易耕种的典型特征。但由于气候变化以及人为因素的影响，近年来发现黑土层变薄，耕作层变浅，土壤有机质含量降低，生态功能减弱，从而严重影响了黑土的可持续利用^[1]。生物炭会改善土壤性质，提高土壤利用的可持续性。相关研究表明，生物炭由于其特殊的结构和理化性质可以提高土壤保肥和持水的能力^[2]，促进作物对营养物质的吸收，进而促进作物生长和农作物产量的提高^[3]。

土壤微生物在土壤生态系统中发挥着不可或缺的作用。土壤微生物参与了许多对土壤有益的生理代谢活动，可以有效地调节土壤养分循环和有机质的转化，通过生物固氮作用增加土壤的氮含量^[4]。氮素是植物生长必要的营养元素之一。土壤中氮素含量的高低影响着作物产量以及土壤微环境的变化。氮素施加量过高会降低氮素的利用效率^[5]。生物炭富含大量的碳元素，可以为微生物活动提供能源物质，进而调节菌群代谢活动。生物炭可提高土壤有机碳的分解能力，促进微生物繁殖^[6]。生物炭与氮、磷、钾肥配施会导致土壤微生物的总生物量特别是细菌数量增加^[7]。但也有相关研究认为生物炭的施加对土壤微生物无显著影响，Dempster 等^[8] 研究发现，生物炭改良后土壤的微生物物种数量以及群落结构不发生显著改变。有研究发现，生物炭不能增加土壤微生物分解所利用的底物，对微生物群落影响较小^[9]。生物炭可以为土壤微生物提供生存空间以及碳源和氮源等养分，通过改善土壤性质进而促进微生物的生长。

土壤微生物易受外界环境因素的影响，不同土壤理化指标对土壤微生物群落的影响不同。土壤微生物可参与养分循环和有机质转化，而生物炭则可以改善土壤结构以及养分循环，进而直接或间接改变微生物的代谢活动、土壤微生物的群落组成以及物种丰度^[10]。氮肥的添加可以增加土壤微生物的数量，但过量的氮肥会抑制硝化细菌和固氮菌等有益微生物，改变微生物丰度，严重影响稻田生态系统的稳定和可持续发展^[11]。土壤中的氮素主要以有机态的形式存在，必须经过矿化作用转化为无机氮才能被植物吸收利用^[12]，而土壤矿化过程受土壤微生物调节。微生物既可直接通过分解代谢将有机氮转化为无机氮，又会在分解有机质过程中释放部分酶，进而促进有机氮的分解和转化。氮肥中的溶解性氮有助于微生物转化为生物质，促进微生物的生长和繁殖^[13]。

生物炭与氮肥配施能显著改变土壤条件，提高土壤肥力。但目前关于生物炭对土壤微生物的影响研究主要以单施生物炭为主，对于生物炭与氮肥配施条件下土壤微生物与土壤环境的互馈关系尚不明确。水稻土作为我国重要的耕作土壤之一，其具有保水保肥能力强、含水量大及土壤环境稳定等特性。这些土壤特性不仅促进了水稻的健康生长，更在保障我国粮食安全和维持农业生态平衡等方面发挥着重要作用。因此，本研究通过施加不同水平的生物炭和氮肥，探究生物炭与氮肥配施条件下土壤细菌群落的变化规律，提出了最佳的炭-氮基肥配施模式^[14]，为生物炭改良水稻土壤微生物生态系统的研究提供理论依据。

1 . 材料与方法

1.1 试验区概况

试验于 2021 年 5—10 月在黑龙江省哈尔滨市东北农业大学水利与土木工程学院试验中心 （45°45′28.66″N，126°43′45.54″E）进行。试验区四季分明，年平均降水量 569.1 mm，降水主要集中在 6—9 月，占全年降水量的 60%。全年最低气温和最高气温分别出现在 1 月和 7 月，1 月平均气温约为-19℃，7 月的平均气温约 23℃，年平均气温为 3.6℃。全年日照时间 2460～2786 h，日照率 61%。年平均相对湿度大于 68%，年平均蒸发量约 1500 mm，年无霜期约 145 d。

1.2 试验设计

试验用土为黑钙土，理化性质为 pH=6.3，土壤容重 1.36 g·cm^-3，孔隙度 61.8%，饱和含水率 50%，有机质含量 34.83 g·kg^-1，全氮含量 1.10 g·kg^-1，全磷含量 0.45 g·kg^-1，全钾含量 0.35 g·kg^-1。所用生物炭购于辽宁金和福开发有限公司，由玉米秸秆在 450℃无氧条件下烧制而成，其粒径为 1.5～2.0 mm，比表面积 84.3 m² ·g^-1，电导率 1.2 dS·m^-1，全碳质量分数 70.38%，全氮质量分数 1.53%，全磷质量分数 0.73%，全钾质量分数 1.66%，灰分质量分数 25.7%，pH=9.36。试验用化肥为尿素（N 46%），磷酸二铵（N 15%，P₂O₅ 42%），氯化钾 （K₂O 60%）。供试水稻品种为龙庆稻 5 号。

试验在试验场的移动式遮雨棚内进行。采用盆栽试验，试验盆直径 34 cm，高 43 cm。土壤自然风干破碎后过筛，每盆装干土 10 kg，将生物炭与土壤均匀混合后装盆沉积 1 周备用。试验设置 2 个因素，生物炭与氮肥，其中生物炭的用量设置 3 个梯度（占每盆土壤质量百分比）：0%、 2.5%、5%，氮肥的用量设置 3 个梯度：100、125、 150 kg·hm^-2。共计 9 个处理，并建立 CK 为对照组（当地大田施肥标准：不施加生物炭，氮肥施加 110 kg·hm^-2），每个处理 3 次重复。所有处理磷肥（以 P₂O₅ 计）和钾肥（以 K₂O 计）用量相同，分别为 45 和 80 kg·hm^-2，如表1 所示。其中磷肥做底肥一次性全部施入，氮肥按基肥∶分蘖肥∶促花肥∶保花肥 =4∶3∶2∶1 分 4 次施入，钾肥按基肥∶穗肥 =1∶1 分两次施入。常规的水稻种植方式与我国水资源利用率和劳动力成本之间存在的问题日益突出，而旱直播省去了传统水稻种植复杂的工序，具有省时、省水、省工的优势，可提高水稻生产效率^[15]。因此，试验水稻种植方式为旱直播，每盆 6 穴，灌溉方式为控制灌溉，不同生育阶段的水分管理如表2 所示，当土壤含水率达到控水标准下限时，及时灌水至控制上限。

注：mm 表示灌溉水层，% 表示土壤含水量。

1.3 土壤样品采集

待将成熟植株小心移走后，从盆栽中取 5 cm 深度处的新鲜土壤，将土壤随机分成 3 部分，第一部分快速浸入液氮中，保存于医用超低温冰箱中用于高通量测序分析；第二部分用于土壤无机氮含量测定；第三部分在室温下风干，用于土壤氮、磷、钾等养分含量测定。每个处理取 3 个重复样品。

1.4 DNA 提取和 PCR 扩增

选择 CTAB 法采用 Qubit dsDNA HS 试剂盒对各样本进行微生物组总 DNA 的提取，并通过琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 纯度，同时采用紫外分光光度计对 DNA 进行定量。得到的模板 DNA 用 25 μL 超纯水稀释。利用通用引物 341 （5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'）和 805R（5'-GA CTACHVGGGTATCTAATCC-3'）扩增土壤细菌基因组 16S_V3V4 区域^[16]。在 98℃ 30 s、98℃ 10 s、 54℃ 30 s、72℃ 45 s、72℃ 10 min 的条件下，采用 42.5 μL 反应体系（含 50 ng DNA 模板）扩增指定区域的 DNA 片段。每个样品扩增 3 个重复。PCR 扩增产物质量经 2% 琼脂糖凝胶电泳确认。随后采用 AMPure XT beads（Beckman Coulter Genomics， Danvers，MA，USA）回收试剂盒对上述扩增产物进行胶回收。PCR 产物由 AMPure XT beads 纯化，并经 Qubit（Invitrogen，USA）定量。

1.5 16S rDNA 测序和生物信息分析

对纯化后的 PCR 产物采用 Agilent 2100 生物分析仪（Agilent，美国）和 Illumina（Kapa Biosciences， Woburn，MA，美国）的文库定量试剂盒进行评估，质控合格的文库浓度均在 2 nmol·L^-1 以上。将合格的各上机测序文库梯度稀释后，根据所需测序量按相应比例混合，并经 NaOH 变性为单链后进行上机测序；采用 NovaSeq 6000 测序仪进行 2×250 bp 的双端（paired-end）测序，相应试剂为 NovaSeq 6000 SP Reagent Kit（500c ycles）。基于 fqtrim 0.94，在特定的过滤条件下对原始数据进行质量过滤，获得高质量的 clean tags。采用 Vsearch 2.3.4 对嵌合体序列进行过滤。通过 qiime dada2 denoise-paired 调用 DADA2 进行长度解调和去噪，获得特征序列和其丰度表格。将 clean data 分配给不同操作分类单元。选用 Chao1、Shannon 指数评估组内各样本物种多样性，采用 QIIME2 计算样本物种多样性。Beta 多样性进行主坐标分析（PCoA）、非度量尺度分析（NMDS），用 QIIME2 计算和 R 3.5.2 绘制。用 SILVA 数据库对全部扩增子序列变体（ASV）进行物种分类注释。采用 LEfSe 算法确定不同组间在丰度上差异显著的标志性物种，阈值取为 10³。基于同源群聚类（COG）通路公共数据库，利用 PICRUSt2 在线程序比较微生物预测功能。

1.6 土壤养分指标测定

将干燥后的土壤与浓硫酸和混合加速剂进行消煮分解，采用凯氏定氮法测定土壤全氮含量^[17]。采用重铬酸钾容量法-外加热法在土样中加入重铬酸钾和浓硫酸，放入电热恒温水浴锅中 100℃恒温 30 min 后测定土壤有机质含量^[18]。取样品放在烧杯中加入无 CO₂ 的蒸馏水，使用玻璃电极法测定土壤 pH 值^[19]。将样品与氯化钾溶液混合振荡 1 h，静置后过滤，测得浸提液在 220 和 275 nm 处吸光值，计算校正吸光值 A，建立 A 值和硝态氮之间的相关曲线进而得到土壤硝态氮含量^[20]。在浸提液中加入苯酚溶液和次氯酸钠碱性溶液，摇匀后静置进行比色测定土壤铵态氮含量^[21]。样品用稀酸和稀碱调节 pH 至溶液呈微黄色，加入钼锑抗显色剂，使用紫外可见光光度计得到吸光值，通过标准曲线回归获得土壤全磷含量^[22]。适当稀释样品，在火焰光度计上先调零度，通过标准曲线的最高浓度点调至相应浓度反复调至稳定，直接读取得到土壤全钾含量^[23]。

1.7 数据处理

采用 SPSS 25.0 对得到的样本的土壤养分指标和 α 多样性指标（Chao1、Shannon）进行正态检验和方差齐性检验，之后进行双因素方差分析和 LSD 多重比较，显著性水平取 0.05，结果用平均值标准差表示。利用 Origin 2021 绘制多样性指数的直方图和稀疏曲线。采用 R 3.6.3 的 plotrix 包绘制花瓣图。对于得到的 ASV 和特征丰度，采用 R 3.6.3 的 vegan 包进行 PCoA 和 NMDS，判断各样本组内的相似性以及组间的差异性，并利用冗余分析（RDA）研究各处理的标志性物种与土壤养分指标之间的关系。

2 结果与分析

2.1 土壤养分指标

各处理的土壤养分指标见表3，C1N1 处理的 pH 显著低于 CK，其余各处理的 pH 均高于 CK， C3N3 处理 pH 最大，呈碱性，其他处理土壤均为中性（7.02～7.44）^[24]。各处理土壤有机质和全钾含量无显著差异，C3N1 处理全氮和全磷含量均显著高于 CK，C2N2、C2N3 和 C3N2 处理的硝态氮含量显著高于 CK，C1N1 处理和 C1N3 处理的硝态氮含量显著低于 CK，除 C3N2 处理外其他处理的铵态氮含量均显著低于 CK。

注：表中数据为平均值 ± 标准误差（n=3）；同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

2.2 测序数据统计与质控

各处理 ASV 数目情况如图1 所示，各处理有 839 个重合 ASV，CK、C1N1、C1N2、C1N3、C2N1、 C2N2、C2N3、C3N1、C3N2、C3N3 组分别有 5538、 5276、4378、5585、4906、4498、5051、4202、 4625、2509 个特有的 ASV。各处理质控如表4 所示，从 30 个样本中共获得 1822384 条 reads。根据表4 可知，GC 含量的平均百分比为 56.16%，Q20 的平均百分比为 97.21%，表明此次测序具有较好的可信度。共筛选出 1798928 个序列，其中 CK 组 187627 个序列，C1N1 组 204442 个序列，C1N2 组 171674 个序列，C1N3 组 210808 个序列，C2N1 组 208628 个序列，C2N2 组 186474 个序列，C2N3 组 197666 个序列，C3N1 组 175360 个序列，C3N2 组 176204 个序列，C3N3 组 80045 个序列。

注：Q20 表示有效数据中数据质量≥ Q20 的数据比例；Q30 表示有效数据中数据质量≥ Q30 的数据比例；GC 表示有效数据中数据 GC 含量。

2.3 α多样性

采用 Chao1 和 Shannon 指数进行 α 多样性分析。通过多重比较可以发现，C3N3 处理细菌群落的物种丰富度和多样性显著低于其他处理（图2a、 b）。为直观地显示出各处理之间物种多样性的差异，绘制了稀释曲线（图2c），各处理的菌种稀疏曲线呈扁平化趋势，表明测序深度足以覆盖各土壤样品内全部细菌菌群。

2.4 β多样性

基于 unweighted_unifrac 距离进行 PCoA 和 NMDS 分析，得到生物炭与氮肥配施对土壤细菌群落β 多样性的影响（图3）。在 PCoA 的结果中（图3a），不同颜色代表不同分组，样品距离越近，说明样品之间的微生物组成结构越相似，差异性越小。主坐标分析的 PCoA1 和 PCoA2 对样本差异的解释度分别为 11.37% 和 8.22%，P 值为 0.002，该检验的可信度较高。NMDS 是β多样性的另一个重要的分析方法，其结果由胁迫系数进行评估。根据图3b 可知 NMDS 分析的胁迫系数为 0.09，说明该图反映了一个数据较好的排序，生物炭与氮肥的施加对土壤菌群β多样性具有较显著影响。细菌群落在 unweighted_unifrac 矩阵算法下 CK 处理与 C1N1 处理距离最近，C3N3 处理距离最远，表明高浓度的氮肥与生物炭配施会显著改变土壤细菌群落的结构。

注：a 为 Chao1 指数；b 为 Shannon 指数；c 为稀疏曲线。柱状图上的误差线为标准误差，不同小写字母表示不同处理间的差异显著（P<0.05）。

注：a 为 PCoA 分析；b 为 NMDS 分析。

2.5 微生物物种组成

各处理的土壤微生物群落的物种组成见图4。在门水平上，优势菌是 Proteobacteria、Acidobacteria、 Gemmatimonadetes 和 Actinobacteria，共占土壤细菌总数的 78.14%。生物炭与氮肥的联合施加使 Proteobacteria 和 Gemmatimonadetes 门相对丰度降低，Acidobacteria 和 Actinobacteria 的相对丰度增加。 Proteobacteria 相对丰度在 C3N2 组最低，C1N3 组最高；Gemmatimonadetes 相对丰度在 C1N2 组最低， C3N3 组最高；C3N1 组 Acidobacteria 相对丰度最高，C3N2 组 Actinobacteria 相对丰度最高（图4a）。在纲水平上，与对照组相比，Betaproteobacteria 和 Deltaproteobacteria 的相对丰度随氮肥的添加而增加，但随着生物炭的施加相对丰度降低（图4b）。在科水平上，Betaproteobacteria_unclassified 在 C1N2 组相对丰度最高，C2N3 组相对丰度最低；Acidobacteria_unclassified 的相对丰度在施加高浓度的生物炭时会随着氮肥的施用量增加而降低； Alphaproteobacteria_unclassified 在 C3N3 组相对丰度最高（图4c）。在属水平上，各处理之间有 6 种细菌属差异显著，Betaproteobacteria_unclassified 和 Deltaproteobacteria_unclassified 的相对丰度在 C1N2组最高，C2N3 组最低；Acidobacteria_unclassified、 Alphaproteobacteria_unclassified、Actinobacteria_ unclassified 和 Gemmatimonadetes_unclassified 在低浓度生物炭时相对丰度最低，而施用高浓度生物炭时相对丰度最高（图4d）。

注：a 为门水平；b 为纲水平；c 为科水平；d 为属水平。

2.6 高级分析

采用 PICRUSt2，在不同浓度氮肥和生物炭条件下预测土壤微生物菌群的功能差异。在施加不同水平的氮肥时，共鉴定出 13 个表达水平差异显著的功能通路（图5a），其中仅“1，2-苯乙酰-辅酶 A 环氧化物酶，催化亚单位”通路表达水平在施加较高浓度的氮肥时显著受到抑制，而其余生物学通路在高浓度氮肥处理下均被激活。在施加不同水平的生物炭时，共有 26 个通路差异显著（图5b），这些通路均在低浓度生物炭处理中被激活。

注：图 a 为不同水平氮肥；图 b 为不同水平生物炭。

为找到各处理在丰度上有显著性差异的物种，采用 LEfSe 分析筛选各组生物标志物（图6a）。结果显示，Spirochaetales 和 Gaiellaceae 是对照组的标志物种，Verrucomicrobia_unclassified、Verrucomicrobia_subdivision_3_unclassified、Geobacter、Opitutaceae、 Polyangiaceae_unclassified 是 C1N1 组的标志物种，Gallionella、Anaerolineae 和 Candidatus_Nomurabacteria_unclassified 是 C1N2 组的标志物种，Methylophilaceae、 Sideroxydans、Polyangiaceae 和 Verrucomicrbia_subdivision_3 是 C1N3 组的标志物种，Elusimicrobia_unclassified 是 C2N1 组的标志物种，Fibrobacteres_unclassified 和 Verrucomicrobiales 是 C2N2 组的标志物种，Rubrobacteria 和 Caulobacteraceae 是 C2N3 组的标志物种，Caldilineaceae_unclassified 是 C3N1 组的标志性物种，Candidatus_Saccharibacteria_unclassified 和Sphingomonas 是 C3N2 组的标志物种，Devosia 是 C3N3 组的标志物种。

注：a 为差异分析；b 为冗余分析。

通过 RDA 分析了解各个样本标志物种与土壤养分指标之间的关系（图6b），每个点代表一个样本，两点之间的距离越接近，说明两个样本的群落结构组成相似度越高；红色箭头表示土壤养分指标，蓝色箭头表示样本标志物种，当二者之间夹角为锐角时表明标志物种与土壤养分指标为正相关，钝角时为负相关。结果表明，硝态氮、全磷和 pH 对标志物种的影响极显著（P<0.01），全氮对标志物种的影响显著（P<0.05），它们是标志物种的主要驱动因子。其中 pH 与 Sphingomonas 和 Devosia 显著正相关，硝态氮与 Methylophilaceae、Candidatus_ Saccharibacteria_unclassified 和 Polyangiaceae_ unclassified 显著负相关，全磷与 Verrucomicrobia_ unclassified 极显著负相关，全氮与 Caulobacteraceae 显著正相关。

3 讨论

土壤微生物是构成土壤肥力的重要因素，土壤微生物丰度较高表明土壤营养供给充足，微生物活性较高^[25]。土壤中微生物的组成及其活性对土壤肥力也会产生影响^[26]。生物炭可以改变微生物所在生态域的理化性质，进而影响土壤微生物的活性和群落结构。Jing 等^[7]发现，生物炭与氮、磷、钾肥联合施加会改变微生物的丰度与群落结构。在本研究中，C3N3 处理显著降低了细菌群落的物种数量及其多样性。这可能是由于低施氮量对土壤中的微生物数量有积极影响，且生物炭对土壤微生物丰度的促进作用存在阈值，当生物炭施加量过高时会导致微生物丰度降低^[27]。此外，C3N3 土壤微生物丰度显著低于其他处理可能与其土壤 pH 发生变化有关，土壤 pH 能够通过影响土壤基质的组成、化学性质和利用效率对土壤微生物群落的组成和多样性产生影响。

生物炭与氮肥配施能够影响土壤环境，进而改变土壤微生物的群落结构。在本研究中，各处理的细菌群落结构之间存在着一定的差异性，且各组菌群物种组成也存在显著差异，表明施加不同量的生物炭与氮肥会使微生物的群落组成发生变化，这与前人关于生物炭和氮肥配施对土壤微生物群落结构的影响结论一致^[28]。在作物生产过程中配施不同量的生物炭与氮肥会改变作物土壤的微生物组成。生物炭和氮肥的配施对微生物组成的影响是复杂且多因素的过程，可通过改变土壤理化性质、微生物之间的竞争关系等影响微生物群落组成。Song 等^[29]研究发现，生物炭和氮肥配施影响了土壤中有效钾、pH、总氮和总溶解性氮进而影响了土壤微生物群落结构。有研究发现，生物炭配施无机肥可减少作物氮的限制，削弱植物-微生物对氮的竞争，通过直接输入矿质养分以及生物炭与无机肥的间接效应影响微生物^[30]。生物炭具有较强的吸附能力且呈碱性，施加到土壤后可以吸附土壤中的营养物质，同时中和酸性土壤提高 pH，进而为微生物提供丰富的营养物质和附着点以及适宜的生长环境，促进微生物的生长和繁殖^[31]。

Proteobacteria 门多存在于营养丰富的土壤环境中，并通过为土壤供氮维持土壤生态的稳定性^[32]。在本研究中 Proteobacteria 是门水平上优势菌群，Proteobacteria 门多数细菌负责固氮，参与土壤中矿质元素的循环，提高土壤肥力，促进作物生长^[33]。Proteobacteria 的相对丰度随氮肥的添加而增加，在 C1N3 处理相对丰度最高。氮肥的施加能够提高土壤肥力，使土壤变得肥沃，促进了富营养细菌（Proteobacteria）的生长^[34]。Gemmatimonadetes 门与土壤湿度呈负相关，可适应干燥土壤^[35]。施加适量的生物炭会改善土壤结构，提升土壤的持水性能，但当生物炭用量过高时会导致土壤质地过于松散，增强土壤的斥水性，导致土壤干燥。本研究发现，C3N3 处理 Gemmatimonadetes 的相对丰度最高，可能是由于过量的生物炭的添加导致土壤斥水性增强，土壤变得相对干燥。Acidobacteria 门是一种嗜酸性营养贫瘠环境的菌群，往往存在于 pH 较低和资源利用率较低的土壤中，在碳的生物地球化学循环中起着重要的作用，因此适应性存在于多种碳源中^[36]。Actinobacteria 门具有降解植物残留物的能力^[29]，可降解纤维素和几丁质等难以降解的聚合物。Chloroflexi 门可存活于极端的土壤环境^[37]，并与其他生物竞争土壤中的不稳定碳。本研究发现，生物炭与氮肥联合配施会提高 Acidobacteria、Actinobacteria 和 Chloroflexi 的相对丰度。虽然生物炭与氮肥配施会提高土壤 pH，这对 Acidobacteria 是不利的，但本研究发现 Acidobacteria 丰度增加，这可能与 Acidobacteria 在土壤中分布受多种环境因子调控有关^[38]。有研究发现，我国东北黑土土壤中 Acidobacteria 丰度与土壤碳含量和 pH 呈显著正相关，且土壤碳含量对其的影响程度高于 pH^[39]。Actinobacteria 的增加可能与添加生物炭导致土壤中碳含量增加以及其降解难降解高分子聚合物的能力有关^[40]。

Proteobacteria 门的 Deltaproteobacteria 和 Betaproteobacteria 是科水平的优势菌群。Deltaproteobacteria 在土壤中氮素增加的情况下可以维持固氮能力，将硝态氮转化成铵态氮供植物吸收利用^[41]。 Deltaproteobacteria 的相对丰度随着生物炭的添加而增加，是由于生物炭为固氮微生物提供能量来源促进了生长和代谢^[42]。Betaproteobacteria 是富营养细菌，在营养物质较高的环境下丰度较高，本文研究发现，Betaproteobacteria 相对丰度随着氮肥的增加而增加。Betaproteobacteria 是硝化、反硝化等氮循环的关键细菌，有研究发现，氮肥的施加会增加氮循环功能微生物的丰度^[43]。此外，还发现优势细菌属均来源于优势细菌门，部分优势属在不同处理下丰度的变化趋势与优势门相似。其中 Acidobacteria_unclassified 与 Acidobacteria 相对丰度均在高浓度生物炭水平下增加。Actinobacteria_unclassified 和 Actinobacteria 均随着生物炭的增加而增加，在 C3N2 处理丰度最高。Gemmatimonadetes_unclassified 和 Gemmatimonadetes 均随着生物炭与氮肥的增加而增加，在 C3N3 处理丰度最高。生物炭改良后土壤中的寡营养细菌（如 Actinobacteria）的丰度增加，同时富营养细菌（如 Proteobacteria）丰度减少，这主要是由于生物炭对有机碳的强烈吸附和生物利用度的降低。通过 LEfSe 分析发现，各个处理的土壤微生物分布具有显著的差异。反硝化细菌 Methylophilaceae、二价铁氧化细菌 Sideroxydans，纤维分解细菌 Polyangiaceae 和 Verrucomicrbia_subdivision_3 是 C1N3 处理的标志物种。其中纤维分解菌可为自身固氮菌提供碳源，Methylophilaceae 与根系的碳氮循环有关，不含有固氮微生物，其丰度与氮源密切相关^[44]。Sideroxydans 是固氮菌，其丰度随着氮源的增加而降低^[45]。C3N1 处理的标志物种是 Caldilineaceae_unclassified，具有水解发酵作用，可降解部分有机物，是脱氮的关键反硝化细菌^[46]，需要碳源提供反硝化作用所需的营养物质。在高浓度生物炭与氮肥的处理中 Devosia 为标志物种，属于好氧细菌，具有分解大分子有机物的能力，参与土壤中养分的循环，促进植物的生长^[47]，有研究发现其相对丰度与氮含量呈正相关^[48]。

微生物的功能在一定程度上会影响土壤的肥力，而施肥量会对其产生一定的影响^[49]。研究发现，不施加生物炭的情况下，“1，2-苯乙酰-辅酶 A 环氧化物酶，催化亚单位”通路在高浓度的氮肥下受到抑制，该通路参与次生代谢产物的生物合成、转运和分解代谢。微生物的次级代谢产物可以改善土壤状况，增加土壤养分，促进植物对养分的吸收与利用，调节作物生长，增加作物抗逆性^[50]。在同一氮肥施用量情况下，添加高浓度生物炭抑制了“ABC 型支链氨基酸转运系统，周质组分”、 “ABC 型硝酸盐 / 磺酸盐 / 碳酸氢盐转运系统，ATP 酶组分”、“ABC 型硝酸盐 / 磺酸盐 / 碳酸氢盐转运系统，周质组分”和“ABC 型支链氨基酸转运系统，ATP 酶组分”等具有无机离子和氨基酸转运与代谢功能的通路，氨基酸是蛋白质的组成成分，其代谢有助于细菌随氨基酸的利用及微生物的繁殖，且氨基酸代谢与作物的氮素循环相关^[51]。表明生物炭和氮肥的施加不仅影响微生物的多样性，还影响某些代谢功能相关群落的相对丰度以及作物的生产力。

生物炭与氮肥的施加会影响土壤的养分指标，进而影响到微生物群落组成。本研究采用 RDA 分析对样本、微生物物种和土壤养分指标之间的关系进行分析。结果表明，生物炭与氮肥配施处理全氮、全磷、pH、铵态氮和硝态氮含量发生了较显著的变化。其中 pH、全磷和硝态氮为影响细菌群落组成的主要驱动因子。土壤酸碱度水平会调整土壤养分的转化^[52]，从而强烈影响细菌群落的物种组成^[53]。本研究发现，生物炭与氮肥的配施导致土壤 pH 增加，在碱性土壤中，细菌的多样性和丰度会明显升高。pH 与高浓度生物炭施用模式下的标志物种 Sphingomonas 和 Devosia 的相对丰度显著正相关。此外，硝态氮是有机氮经过矿质化作用形成铵态，或利用尿素分解形成的。氮营养可用性的变化将影响植物群落α多样性和生物量，进而通过提供细菌基质可用性影响细菌的生长和繁殖。但是在氮饱和的情况下，过度的氮输入会导致氮的供应超过了土壤的需求阈值，进而导致硝态氮通过接触和反硝化作用有所损耗，从而加速土壤酸化过程，对土壤微生物生态位的稳定以及细菌群落结构产生负面效应^[54]。

4 结论

生物炭与氮肥的联合配施模式会导致土壤微生物群落物种丰富度发生变化。不同浓度的生物炭与氮肥会对土壤微生物菌群的通路产生差异。 pH、硝态氮、全氮和全磷是标志物种的主要驱动因子，其中，pH 与 Sphingomonas 和 Devosia 显著正相关，硝态氮与 Methylophilaceae、Candidatus_Saccharibacteria_unclassified 和 Polyangiaceae_unclassified 显著负相关，全磷与 Verrucomicrobia_unclassified 极显著负相关，全氮与 Caulobacteraceae 显著正相关。

参考文献