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三七（Panax notoginseng）是我国传统名贵中药材，主要以其干燥的主根入药，具有活血化瘀、消肿止痛等功效，临床上常用于治疗心脑血管疾病。云南省作为三七道地产区，市售三七药材 95% 以上产自云南[1]。同时，云南省拥有丰富的金属矿区，是中国最大的镉（Cd）产地，年 Cd 产量达 63 t，占全国总产量的 46%[2]。由于三七种植区域土壤 Cd 背景值高、矿冶活动频繁及部分含重金属农业投入品的大量施用等原因，导致三七存在不同程度的 Cd 超标问题。研究发现，云南三七种植土壤重金属存在中度污染，其中以 Cd 污染最为严重，其在三七主根、芦头、须根、茎和叶中的超标率分别为 4.00%、24.00%、 16.00%、54.20% 和 12.50%[3]。因此，探寻三七原料生产环节的 Cd 阻控途径和措施，对于保障三七药用饮片安全和出口贸易安全具有重要意义。
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源头控制是修复 Cd 污染土壤以降低农作物 Cd 积累的常用方法之一[4]。常见的 Cd 污染土壤修复技术包括物理修复、化学修复、生物修复及农业生态修复等[5]。这些技术虽然治理效果显著，但在实际应用中普遍存在技术条件要求高、应用场景有限和成本控制难等问题。在 Cd 污染土壤上，通过氮（N）肥调控实现边生产边修复是一种经济高效、方便简易的修复措施。N 肥施用不仅会影响土壤理化性质，还会导致 Cd 的吸附解吸和形态发生变化，进而影响 Cd 在土壤中的迁移和有效性[6]。已有研究表明，铵态氮（NH4 +-N）和硝态氮 （NO3--N）在调控植物 Cd 吸收积累中发挥着重要作用[7]。在小白菜（Brassica campestris）盆栽试验施加 NH4 +-N 和酰胺态氮[CO（NH2）2-N]导致小白菜积累更多的 Cd，其中施加 NH4 +-N 和 CO（NH2）2-N 的小白菜叶片 Cd 含量分别是施加 NO3--N 的 2.8 和 1.6 倍[8]。然而，也有研究[9]得出相反的结果，在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，与 NO3--N 处理相比，NH4 +-N 处理拟南芥积累的 Cd 较少，并且限制 Cd 从根部向地上部分的转运；在番茄（Solanum lycopersicum）幼苗中，增加 NH4 +-N 供应也能降低植株 Cd 的积累，从而缓解番茄生长受到的 Cd 胁迫[10]。这些结果表明，不同植物种类在响应不同形态 N 素调控 Cd 吸收积累的机制不尽相同。因此，有必要对于不同植物和土壤条件开展针对性研究，寻找合适高效阻控作物 Cd 积累的 N 管理措施。
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硝化抑制剂 3，4-二甲基吡唑磷酸盐（DMPP） 具有高效、无毒、稳定和专一的特点，在我国农业生产中被广泛应用[11]，只需在 NH4 +-N 肥或者尿素中添加 N 用量 1% 的 DMPP 便可获得较好的硝化抑制效果[12-13]。在实际农业生产中，尿素是农田系统中使用最普遍和施用量最大的 N 肥，而尿素配施 DMPP 可有效调控 NH4 +-N 向 NO3--N 的转化。近年来，关于硝化抑制剂的研究主要集中在土壤 N 转化、NO3--N 淋溶、N 肥利用率和 N2O排放等方面[14]，而在三七种植过程中应用 DMPP 介导植株响应 N 素形态变化调控三七 Cd 积累机制尚不清楚。因此，本研究通过土壤外源添加 Cd 进行三七盆栽试验，研究尿素配施 DMPP 对三七 Cd 积累的阻控效应，从三七生长特征、Cd 富集转运及土壤 Cd 形态变化等方面探索其机制。研究结果可为中轻度 Cd 污染土壤开展三七安全生产提供理论依据，以期建立一种环境友好、经济高效、方便可行的三七 Cd 阻控农艺措施。
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1 材料与方法
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1.1 供试材料
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供试土壤取自云南农业大学后山教学农场 （25°08′N、102°45′E），为试验前未种植过任何作物的山原红壤，其基本理化性质：有机质含量 15.56 g·kg-1，pH 6.17，全氮 1.53 g·kg-1，全磷 0.35 g·kg-1，全钾 1.78 g·kg-1，速效钾 49.77 mg·kg-1，有效磷 5.64 mg·kg-1。根据本课题组前期对三七种植地重金属污染特征调查评价[3] 结合文献调研，设置三七土壤 Cd 的添加浓度为 5 mg·kg-1，外源 Cd 用无水 CdCl2 提供。于 2021 年 11 月下旬进行土壤 Cd 添加稳定试验，先将土壤风干、过 5 mm 筛后称取 600 kg 进行外源 Cd 添加，精确称取所需的无水 CdCl2 充分溶解于去离子水，均匀喷洒于事先准备的风干土中充分搅拌混匀，浇去离子水至田间持水量的 70% 左右，覆膜稳定 2 个月，备用[15]。
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DMPP 试剂（分析纯）购自于罗恩试剂公司； 一年生三七籽条购自于云南文山苗乡三七实业有限公司；供试肥料为尿素（N 46.0%）、粉状过磷酸钙（P2O5 16.0%） 和硫酸钾（K2O 50.0%，Cl1.0%），均由云南云天化股份有限公司生产；盆栽试验所用盆钵为外口径 33 cm，内口径 28.5 cm，高 22 cm 的聚丙烯塑料花盆。
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1.2 试验设计
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本试验于 2021 年 1 月下旬种植三七，采用盆栽方式进行，每盆装土 7 kg，移栽 4 棵三七籽条，种植结束后适当浇水，笼盖上一层松针，置于云南省昆明市禄劝县则黑乡（26°14′N、102°69′E） 三七遮荫棚内，棚内光照为自然光照强度的 10% 左右。试验设置 3 个 DMPP 用量水平，分别为尿素配施 N 量 1%、3%、5% 的 DMPP，分别用 D1、 D3、D5 表示，单施尿素用 NS 表示，以不施尿素作为空白，记作 CK，共计 5 个处理，每个处理 15 盆。根据《三七高产高效施肥技术规程》进行 3 次施肥：第 1 次施肥于 4 月下旬，每公顷施用 600 kg 二年七专用肥（N-P2O5-K2O：10-9-18，总养分≥ 37%）；第 2 次施肥于 6 月上旬，每公顷施用 750 kg 二年七专用肥；第 3 次施肥于 8 月中旬，每公顷施用 450 kg 二年七专用肥。根据实际生产中三七种植密度为每公顷 37.5 万棵以及技术规程中二年七专用肥施用量，计算出每盆三七（4 棵）每次施肥的需肥量（第 1 次施肥，每棵三七需 N 0.16 g、P2O5 0.144 g、K2O 0.288 g；第 2 次施肥，每棵三七需 N 0.2 g、P2O5 0.18 g、K2O 0.36 g；第 3 次施肥，每棵三七需 N 0.12 g、P2O5 0.108 g、K2O 0.228 g）。根据每盆三七养分需用量，严格计算后精确称取尿素、过磷酸钙和硫酸钾配制成复混肥料，以满足技术规程中二年生三七的养分需求，所有处理过磷酸钙和硫酸钾用量均相同，尿素及 DMPP 处理用量如表1 所示。每次施肥均选择晴朗天气的下午气温回落后，施肥方式参照《三七高产高效施肥技术规程》和当地三七田间施肥模式，将称取的肥料和 DMPP 均匀混合后，均匀地撒施在每盆三七土表层的松针上，施肥结束后立即浇水至 5 cm 左右土层湿润，每次施肥均为一次处理。在种植期间，根据具体天气以及三七生长情况进行规范化管理。
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1.3 样品采集及指标分析
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于 2021 年 5、7、9 月分别采集盆栽土壤进行 NO3--N、NH4 +-N 含量测定，每个处理随机选择 3 盆三七，使用小型土钻进行取样，每盆均取 4 个样点混为一个土样；11 月采集三七植株样品进行农艺性状、生物量及 Cd 含量测定，同时采用抖土法采集相应根际土壤样品。植株样品经自来水和去离子水洗净后，分成主根、茎和叶 3 个部位，在 110℃ 条件下杀青 30 min 后于 60℃烘干至恒重，干燥后用粉碎机磨细保存待测；土壤样品经风干后，剔除枯枝落叶、碎石和有机残渣，磨碎后分别过 2 和 0.15 mm 筛待测。
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土壤 pH、有机质、全氮、全磷、全钾、有效磷、速效钾参考《土壤农业化学分析方法》[16]测定；土壤 NH4 +-N 含量采用靛酚蓝比色法测定；土壤 NO3--N 含量采用紫外分光光度校正因数法测定；土壤 Cd 形态分级参照高焕方等[17]BCR 提取法稍加改进后测定；三七不同部位 Cd 含量采用国家标准《食品安全国家标准食品中多元素的测定》（GB 5009.268—2016）中第一法：通过电感耦合等离子质谱法（ICP-MS）测定植株组织中 Cd 含量。
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1.4 数据处理与统计分析
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转运系数 = 三七地上部 Cd 含量 / 根部 Cd 含量
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富集系数 = 三七各部位 Cd 含量 / 土壤 Cd 含量
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采用 Excel 2010 和 SPSS 26.0 进行数据处理、统计分析，对数据进行单因素方差（One-way ANOVA） 分析，数值为平均值 ± 标准差，处理间均值比较使用 Duncan 差异显著性检验（P<0.05）； 用 Graphpad Prism 8.0 作图。
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2 结果与分析
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2.1 尿素配施 DMPP 对三七根际土壤 pH 的影响
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如图1 所示，与 CK 相比，NS 处理的三七根际土壤 pH 显著下降 0.70，而尿素配施 DMPP 处理组土壤 pH 显著升高；与 NS 相比，D1、D3 和 D5 处理三七根际土壤 pH 分别升高 1.05、1.24 和 1.19。随着 DMPP 用量的增加，D3 和 D5 处理三七根际土壤 pH 均显著高于 D1，但 D3 与 D5 处理间差异不显著。
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图1 尿素配施 DMPP 对三七根际土壤 pH 的影响
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注：不同小写字母表示不同处理间差异显著（P<0.05）。下同。
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2.2 尿素配施 DMPP 对土壤 NO3--N 和 NH4 +-N 含量的影响
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如图2 所示，3 次施肥处理后土壤中的 NO3--N 和 NH4 +-N 变化趋势相似，均以 NS 处理土壤中的 NO3--N 含量最高，配施 DMPP 处理组含量则较低，并且每次施肥后 D1、D2 和 D3 处理间的 NO3--N 含量相差不大（图2a）；而配施 DMPP 处理维持了土壤中较高浓度的 NH4 +-N，随着配施 DMPP 用量增加，土壤中 NH4 +-N 含量也相应增高，表现出一定的剂量效应（图2b），结果表明 DMPP 作用效果稳定，DMPP 的施用显著抑制硝化作用的进行，维持了土壤中较高水平的 NH4 +-N 含量。
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2.3 尿素配施 DMPP 对土壤中 Cd 赋存形态的影响
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尿素配施 DMPP 处理显著影响土壤中不同形态 Cd 含量。如图3 所示，NS 处理的交换态 Cd 含量最高，而还原态、氧化态和残渣态 Cd 含量均最低。与 NS 相比，配施 DMPP 处理后土壤中的交换态 Cd 含量均显著降低，而还原态 Cd、氧化态 Cd和残渣态 Cd 含量均显著升高。除氧化态 Cd 外， D1、D2 和 D3 处理间对交换态、还原态和残渣态 Cd 含量影响不显著。
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图2 尿素配施 DMPP 对土壤硝态氮和铵态氮含量的影响
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图3 尿素配施 DMPP 对土壤中不同形态 Cd 含量的影响
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注：小写字母不同表示各提取形态 Cd 不同处理间差异显著（P<0.05）。
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对不同形态 Cd 含量的百分比分析（图4）表明，交换态和还原态 Cd 含量占比最大，二者为 80%～90%。NS 处理的交换态 Cd 占比最高，而配施 DMPP 后降低了交换态 Cd 在土壤中占比，降幅为 5.25%～6.17%，其中以 D3 处理后的交换态 Cd含量占比最低；对于还原态、氧化态和残渣态 Cd 含量占比而言，DMPP 处理组均高于 NS 处理，并且随着配施 DMPP 用量的增加，氧化态和残渣态 Cd 含量占比逐渐增加。
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图4 尿素配施 DMPP 土壤中不同形态 Cd 含量的占比
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2.4 尿素配施 DMPP 对 Cd 胁迫下三七生长发育的影响
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Cd 胁迫下配施不同水平的 DMPP 对三七生长有显著影响。由表2 可知，与 CK 相比，施用尿素及其配施不同水平的 DMPP 均能显著增加三七的叶长、叶宽、株高及生物量，其中均以 D1 处理增幅最高，叶长、叶宽、株高分别增加了 17.95%、 27.47%、20.91%。与 NS 相比，配施 DMPP 对三七根、茎、叶干重和总鲜重影响不显著，并且配施不同 DMPP 水平间的三七叶长、叶宽、株高无显著差异。但随着配施 DMPP 用量的增加，三七的叶长、叶宽、株高、叶干重、根干重及总生物量呈现出下降趋势。
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2.5 尿素配施 DMPP 对 Cd 胁迫下三七 Cd 含量的影响
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测定不同处理下三七各部位 Cd 含量（表3） 发现，CK 处理的三七茎、叶 Cd 含量均最高，而 NS 处理的三七根 Cd 含量最高。根据 2020 版《中国药典》规定，三七中 Cd 限量标准必须低于 1 mg·kg-1。CK 处理的三七各部位 Cd 含量和 NS 处理根、茎 Cd 含量均超标，但尿素配施不同水平 DMPP 处理下三七根和叶 Cd 含量未超标，对于茎 Cd 含量仅有 D1 处理未超标。与 NS 相比，配施不同用量水平的 DMPP 均能显著降低三七根、茎和叶 Cd 含量，其中 D1 处理的三七根、茎、叶 Cd 含量降幅最大，分别显著降低了 64.74%、64.22%、7 1.74%；随着配施 DMPP 用量的增加，D3 与 D5 处理间三七各部位 Cd 含量均无显著差异，D3 和 D5 处理根、茎 Cd 含量均显著高于 D1 处理。综合分析表明，D1 处理阻控三七 Cd 的积累效果最好，且三七根、茎、叶 Cd 含量均未超标，符合食品安全标准。
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注：表中数据为平均值 ± 标准差（n=7）；同行不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。
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注：表中数据为平均值 ± 标准差（n=3），同列不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。
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2.6 三七 Cd 富集转运特征
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进一步分析不同处理下三七不同部位的 Cd 富集系数和 Cd 转运系数发现，三七各部位 Cd 富集系数变化趋势与三七 Cd 含量结果相似，D1 处理的三七根、茎、叶富集系数均显著低于其他处理，而 NS 处理的根富集系数最高，茎、叶富集系数则为 CK 最高；D3 和 D5 处理根、茎、叶 Cd 富集系数显著高于 D1 处理（图5a）。对于根部-地上部 Cd 转运系数，CK 处理最高，显著高于 NS 和 D1 处理，所有处理中 D1 处理的转运系数最低，配施不同用量 DMPP 处理间无显著差异（图5b），表明 N 的供应降低了三七 Cd 从根部向地上部的转运。
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图5 尿素配施 DMPP 的三七 Cd 富集转运特征
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3 讨论
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3.1 尿素配施 DMPP 对土壤理化状况的影响
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施用 NH4 +-N 通常会造成土壤酸化，一方面是由于 NH4 +-N 的施用增加了植物根系吸收 NH4 + 时伴随质子（H+）的释放，另一方面是因为 NH4 +-N 促进了土壤硝化作用[18]。在本研究中，通过将尿素与 DMPP 配合施用，3 次施肥处理后盆栽土壤中均保持了较高浓度的 NH4 +-N 和较低浓度的 NO3--N （图2）。这些结果与先前的报道一致，DMPP 通过抑制土壤硝化作用的进行，在一定时间内保持土壤中较高水平的 NH4 +-N[19]。已有研究表明，土壤中 NH4 +-N 进行硝化反应所产生的酸化效应比植物吸收 NH4 +-N 造成土壤酸化更加明显[20]，且硝化作用是导致农田红壤 pH 下降的主要原因之一[21]。当硝化反应受到抑制，硝化过程所产生的 H+ 减少，限制了硝化作用对土壤造成的酸性效应。尿素施用短时间内经脲酶水解为 NH4 +-N，这个过程会使土壤 pH 升高，而后期 NH4 +-N 则会通过硝化作用引起土壤酸化[22]；施用硫酸铵处理，培养前后水稻土和潮土土壤 pH 明显下降 1.30 和 0.16，而配施 DMPP 处理水稻土土壤 pH 比（NH4）2SO4 处理高 0.39～0.44[23]。在本试验中，通过测定三七根际土壤 pH 也证实，与未施 N 肥处理相比，单施尿素处理导致三七根际土壤 pH 显著下降 0.70，而配施 DMPP 处理组 pH 显著升高（图1），可见，土壤硝化作用是造成 pH 变化的一大因素。
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3.2 尿素配施 DMPP 对三七 Cd 积累特征的影响
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土壤 pH 作为控制重金属生物有效性的重要因素之一，pH 降低会增加土壤中的活性 Cd 含量，增加植物对 Cd 的吸收[24-25]。在本研究中，单施尿素处理三七根际土壤 pH 显著降低，土壤中交换态 Cd 含量及占比显著增加；而配施 DMPP 后 pH 增加，降低了土壤中 Cd 的活性。因此，硝化作用产生的酸化效应可能是影响土壤中 Cd 活性的主要因素，而配施 DMPP 导致土壤 pH 升高致使土壤 Cd 活性降低，是植株 Cd 含量降低的原因之一。这与之前的报道一致，向尿素中添加硝化抑制剂通过提高根际土壤 pH，降低土壤中重金属的活性，减少了小白菜对 Cd 的吸收[26]。另外，尿素及配施 DMPP 处理有效增加了植株生物量，这也可能稀释了三七植株中 Cd 的含量[27]。此外，未施 N 肥与单施尿素相比，三七整株 Cd 含量差异不显著，但单施尿素处理三七根部 Cd 含量显著高于未施 N 肥处理，并且施用尿素及配施 DMPP 降低了三七 Cd 从根部向地上部的转运（图5b）。这可能是由于 N 的供应增加了 Cd 在根细胞壁中与果胶、半纤维素的结合，从而增加了根部对 Cd 的滞留，减少了 Cd 从根部向地上部的转运，这也是一种植物抵抗 Cd 毒性的重要策略[28-29]。此外在本研究中，D3、D5 处理下的三七根际土壤 pH 更高（图1），土壤 Cd 生物有效性低于 D1 处理（图3），但 D1 处理下三七 Cd 含量更低，造成这一结果，首先是因为 D1 处理的三七生长发育较好，其生物量最高（表2），对三七体内 Cd 具有一定的“稀释效应”。其次，不同剂量的 DMPP 施用导致土壤中不同形态 N 含量会有差异，测定不同时期的土壤 N 也发现，D1 处理的土壤 NH4 +-N 含量比 D3 和 D5 处理低（图2），不同形态 N 变化也是影响三七吸收 Cd 的一大因素。在三七吸收、转运及同化不同形态 N 时，可能影响了三七 Cd 转运相关基因的表达，从而造成 Cd 积累差异。研究表明，不同形态 N 的施用对植物中 Cd 积累有一定的影响，NH4 +-N 的添加增加了水稻、向日葵、红心莲和龙葵中 Cd 的积累[7]。在水稻中，随着NH4 +-N/ NO3--N 比例的增加，根毛区 Cd2+ 的净流入量降低，并且根系参与 Cd 吸收（OsIRT1、 OsNRAPM5）和转运（OsHMA2）相关基因的表达下调，增加 NH4 +-N 供应抑制了 Cd 的吸收积累以及木质部对 Cd 的转运[30]。可见，不同形态 N 调控植物 Cd 积累存在较大差异。因此，明确不同形态 N 素调控三七 Cd 的吸收、转运及积累机制还需进一步研究。
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3.3 尿素配施 DMPP 对三七生长的影响
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N肥配施硝化抑制剂有利于草莓[31]、小麦[32]、玉米[13]等植物的生长及生物量积累。在本研究中也同样发现，Cd胁迫下施用尿素及配施 DMPP 显著提高了三七的叶长、叶宽、株高以及生物量的积累（表2）。然而，随着 DMPP 用量的增加三七的叶长、叶宽和株高及生物量呈现出下降趋势，造成这一原因，推测是由于 DMPP 用量增加严重抑制了硝化作用的进行，土壤中 NH4 +-N 的含量在长时间内保持较高水平，三七可能受到 NH4 + 毒害。
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4 结论
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单施尿素降低三七根际土壤 pH，增加土壤中 Cd 的生物有效性，导致三七根部积累更多的 Cd，而尿素配施 DMPP 不仅保持了土壤中较高水平的 NH4 +-N，三七根际土壤 pH 还提高了 1.05～1.24，促进土壤 Cd 由高活性的交换态向低活性的残渣态转变，显著降低了三七各部位的 Cd 含量。综合分析表明，尿素配施 1% 的 DMPP 处理阻控三七 Cd 积累效果最优，三七根、茎、叶 Cd 含量为 0.67、 0.78、0.26 mg·kg-1，符合食品安全标准。
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摘要
通过外源添加镉（Cd，浓度为 5 mg·kg-1）进行盆栽试验，研究了尿素配施不同水平硝化抑制剂 3，4- 二甲基吡唑磷酸盐（DMPP）（施氮量的 1%、3%、5%）对土壤 Cd 形态、三七生长及植株 Cd 富集转运的影响，以阐明其阻控三七 Cd 积累的机制。结果表明，单施尿素三七根际土壤 pH 下降 0.70，而尿素配施 DMPP 根际土壤 pH 升高 1.05 ～ 1.24，并且土壤中铵态氮含量随 DMPP 施用量的增加而增加；单施尿素增加了土壤可交换态 Cd 含量及占比，导致土壤中 Cd 活性较高，而配施 DMPP 则促进土壤 Cd 由高活性的可交换态向低活性的残渣态转变； 不施尿素处理下三七茎、叶及整株 Cd 含量均为最高，而单施尿素三七根部 Cd 含量最高，表明施氮降低了 Cd 从三七根部向地上部的转运；尿素配施 DMPP 增加了三七的叶长、叶宽、株高和生物量，并且大幅度降低了三七根、茎、叶 Cd 含量。综合分析发现，尿素配施 1% 的 DMPP 效果最优。因此，尿素配施 DMPP 可通过提高根际土壤 pH 降低土壤 Cd 活性，阻控 Cd 在三七中的积累。
Abstract
In this paper，the effects of urea with different levels of nitrification inhibitor 3，4-dimethylpyrazole phosphate （DMPP）（1%，3%，and 5% of nitrogen applied）on soil cadmium（Cd）morphology，Panax notoginseng growth and plant Cd enrichment and translocation were studied by exogenously adding Cd（5 mg·kg-1）in a pot experiment，in order to clarify the mechanism of its inhibition and control of Cd accumulation in P. notoginseng．Single application of urea resulted in 0.70 decrease in soil pH，while urea combined with DMPP increased soil pH by 1.05 to 1.24，and the soil NH4 + -N content increased with the increase of the DMPP application．Single application of urea increased the content and proportion of soil exchangeable Cd，resulting in higher Cd activity in the soil，while the application of DMPP promoted the transformation of soil Cd from the highly active exchangeable state to the less active residue state．The Cd contents of stems， leaves and plants in P. notoginseng were the highest under CK treatment，while the Cd content in P. notoginseng roots was the highest under single application of urea，indicating that nitrogen application reduced the transport of Cd from roots to shoots．The application of urea combined with DMPP increased the leaf length，leaf width，plant height and biomass of P． notoginseng，and drastically reduced the Cd contents in roots，stems，and leaves．The comprehensive analysis revealed that urea combined with 1% DMPP had the best effect．Therefore，urea combined with DMPP could increase the pH of rhizosphere soil，reduce soil Cd activity，thus inhibiting the accumulation of Cd in P. notoginseng.