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秸秆作为世界上数量最多的生物质资源，还田利用是其资源化利用的主要方式。微生物是土壤中养分循环的主要驱动力，直接参与还田秸秆的降解和腐殖化过程[1]。明确秸秆还田的土壤微生物效应对明确秸秆还田对土壤环境的影响、指导秸秆安全还田至关重要，因此，近年来秸秆还田的微生物效应一直是土壤微生态环境领域的研究热点。
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研究表明，秸秆不同腐解阶段所涉及的微生物菌群存在较大差异。在秸秆降解初期细菌菌群起主要作用，降解易分解的糖类和多聚物等物质[2]； 而后期则以真菌菌群为主，降解难分解的木质纤维素类物质[3]。随着秸秆还田时间的延长，土壤真菌数量和多样性指数均显著增加[4]。土壤微生物还受秸秆还田方式、数量、深度等因素的影响[5]。分析2 种耕作方式（免耕与深翻）与 3 种秸秆还田数量 （不还田、秸秆半量还田与秸秆全量还田）对土壤真菌群落的影响发现，免耕结合秸秆半量覆盖还田处理土壤真菌多样性指数表现最优[6-7]；保护性耕作与传统耕作相比，增加了土壤微生物生物量和多样性[8]。添加纸浆、泥炭、鸡粪等秸秆还田激发剂不仅能够提升土壤有机碳含量，土壤微生物群落结构也得到优化[9]。另外，添加外源物料调节碳氮比也是影响土壤微生物生物量水平的重要因素[10]。
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总之，秸秆还田作为一种最为重要的秸秆资源化利用方式，评价秸秆还田的微生物效应受到研究者的广泛关注，在秸秆还田所引起的微生物群落变化方面取得了较为一致的结论，但这些研究多集中于秸秆还田对当季土壤微生物群落的影响[11-12]。针对长期秸秆还田对土壤微生物菌群影响的研究还较少[13-14]，由于田间环境复杂且秸秆降解周期较长，秸秆还田的短期和长期效应差异较大。因此，本研究针对黄淮海小麦-玉米轮作区，以秸秆定位还田 15 年的土壤为研究对象，分析秸秆长期还田对不同深度土层土壤微生物群落的影响，该研究的进行将为黄淮海区域小麦、玉米秸秆还田的实施提供理论支撑，对指导我国小麦-玉米轮作区秸秆还田措施的实施具有重要的意义。
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1 材料与方法
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1.1 试验地概况和试验设计
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试验在河北省石家庄市鹿泉区大河镇河北省农林科学院试验基地（38°12′56″N，114°38′26″E） 进行，海拔 57.18 m，年均气温 14.2℃，年降水量 551.4 mm，年日照时间 2425.2 h。试验地为小麦-玉米一年两作种植模式，土壤质地为壤土。基础理化性质为 pH 8.50、有机质 16.29 g/kg、全氮 0.87 g/kg、全磷 0.86 g/kg、全钾 2.54 g/kg、碱解氮 27.98 mg/kg、有效磷 10.02 g/kg、速效钾 99 mg/kg。
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试验自 2007 年开始，共设 2 个处理，秸秆还田处理（S）为小麦秸秆粉碎覆盖还田、玉米收获后秸秆粉碎旋耕还田；以秸秆不还田为对照 （NS），收获期将小麦、玉米秸秆全部移出。2 个处理均为 3 次重复，试验小区面积为 6 m×10 m。2 个处理施肥、浇水等管理方式均相同。
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1.2 土壤样品采集
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于 2021 年小麦成熟期，采用 5 点采样法分 0～10、10～20 和 20～30 cm 3 个土壤深度采集土壤样品，每个小区同一土层的样品混合均匀后成为 1 个土壤样品，分别为秸秆还田 0～10 cm 土壤样品（S1）、10～20 cm 土壤样品（S2）、20～30 cm 土壤样品（S3），秸秆不还田 3 个土层土壤样品分别记为 NS1、NS2、NS3。将采集的土壤样品均采用四分法在无菌条件下分为 3 份：1 份自然风干，过 0.2 mm 网筛，测定土壤酶活性；1 份 4℃冷藏保存，测定土壤可培养微生物数量；1 份-80℃冷冻保存，用于土壤总 DNA 提取和高通量测序。
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1.3 土壤酶活性的测定
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土壤酶活性参考郑立伟等研究方法[15]，采用南京建成生物工程研究所的酶活性试剂盒测定。过氧化氢酶活性采用分光光度法测定，过氧化氢为底物，以每克干重土壤每小时催化 1μmol 过氧化氢降解为 1 个酶活性单位。脲酶活性采用次氯酸钠苯酚比色法，以每克干重土壤在 37℃孵育 24 h 后产生 1μg NH4 +-N 为 1 个酶活性单位。蔗糖酶活性采用二硝基水杨酸法，以蔗糖为底物，以每克干重土壤在 37℃ 孵育 24 h 后产生 1 mg 葡萄糖为 1 个酶活性单位。碱性磷酸酶活性采用分光光度法，以磷酸对硝基苯酯为底物，以每克干重土壤在 37℃ 孵育24 h 后产生 1 nmol 对硝基苯酚为 1 个酶活性单位。纤维素酶活性采用 3，5-二硝基水杨酸比色法测定，以 72 h、1 g 干土生成葡萄糖毫克数表示。
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1.4 土壤可培养微生物的测定
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土壤可培养微生物采用稀释涂布平板法[16]，细菌、真菌、氨化细菌、亚硝化菌、纤维素降解菌分别采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马丁氏培养基、蛋白胨氨化培养基、改良斯蒂芬逊培养基、赫奇逊培养基，计数平板上菌落数并计算土壤中可培养微生物的数量[11]。
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1.5 土壤微生物多样性的测定
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采用天根生化科技有限公司土壤基因组 DNA 提取试剂盒（TGuide S96 磁珠法，型号 DP812） 进行土壤样品中 DNA 的提取。以提取的 DNA 为模板对细菌 16S rRNA 的 V3～V4 区、真菌 ITS1 区基因序列进行 PCR 扩增，其中细菌引物为 338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′和 806R： 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′，真菌引物采用 ITS1F：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3 ′ 和 ITS2：5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3 ′。PCR 扩增体系：95℃预变性 5 min；95℃ 30 s，50℃ 30 s， 72℃ 40 s，共 25 个循环；最后 72℃延伸 7 min， 4℃结束反应。采用 2% 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 反应产物。将符合要求的 PCR 产物使用 VAHTSTM DNA Clean Beads 磁珠进行纯化，采用 TruSeq DNA Kit（Illumina 公司）进行文库构建。使用 Agilent 2100 Bioanalyzer 对文库的片段范围及浓度进行检测，检测合格的文库送至北京百迈客生物科技有限公司采用 Illumina NovaSeq 6000 测序平台进行高通量测序。
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1.6 数据分析
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高通量测序获得的原始测序序列数据，经拼接、过滤、比对处理得到有效数据。利用 Uparse10.0 Python 语言工具在相似 97% 的水平上对有效序列进行聚类，默认以测序序列数的 0.005% 作为阈值获得操作分类单元（OTUs）。用 Mother 1.31.2 与 SILVA 的 SSUrRNA 数据库对 OTUs 代表序列进行物种注释分析，获得对应物种信息及在各个分类水平物种丰度情况。使用 QIIME 计算α多样性指数。使用 R 绘制 PCoA 图，对不同样品和分组的微生物群落结构差异进行分析。使用 R 进行微生物群落网络分析，最后使用 Gephi 进行网络的可视化。使用 Excel2021 对土壤酶活性、可培养微生物等数据进行整理，使用 Graph Pad Prism 作图，使用 SPSS 26.0 对整理后的试验数据进行单因素方差分析，处理间差异显著性检验使用邓肯法（Duncan） （P<0.05、P<0.01）。
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2 结果与分析
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2.1 长期秸秆还田对不同土层土壤酶活性的影响
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对比分析了长期秸秆还田处理和秸秆不还田对照 0～10、10～20、20～30 cm 土层土壤的酶活性，由图1 可知，秸秆还田处理 0～10 cm 土层的土壤脲酶、过氧化氢酶、蔗糖酶、碱性磷酸酶、纤维素酶活性较对照分别增加 16.21%、5.90%、 33.08%、33.78%、188.83%，差异达显著水平 （P<0.05）。对于 10～20、20～30 cm 土层来说， 5 种酶活性也均为上升趋势，但只有碱性磷酸酶和纤维素酶活性显著增加（P<0.05），其中 10～20 cm 土层的增加幅度分别为 27.75%、115.06%， 20～30 cm 土层的增加幅度分别为 17.25%、 88.39%。表明，秸秆还田具有增加土壤酶活性的作用，秸秆还田的酶活性效应随土壤深度增加而降低。
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图1 不同土层土壤酶活性
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注：* 代表 P<0.05，差异显著。下同。
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2.2 长期秸秆还田对不同土层土壤微生物数量的影响
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图2 为秸秆还田处理和秸秆不还田对照 3 个土层中 5 类可培养微生物数量变化情况，从总体趋势来看秸秆还田能够增加 5 类可培养微生物的数量，其增加幅度随土层加深呈下降趋势。0～10 cm 土层，秸杆还田处理细菌、真菌、氨化细菌、亚硝化细菌及纤维素降解菌较对照分别增加 161.57%、 123.71%、85.50%、308.34%、29.78%，其中前 4 类微生物菌群均呈显著增加（P<0.05）；10～20 cm 土层，秸秆还田处理中真菌、氨化细菌、亚硝化细菌及纤维素降解菌数量较对照分别增加 70.71%、99.47%、208.20%、100.79%（P<0.05）。 20～30 cm 土层中，秸秆还田处理中细菌、真菌、亚硝化细菌和纤维素降解菌仍较对照升高，但二者之间均未呈现显著差异。表明长期秸秆还田对 0～10、10～20 cm 土层中微生物数量的影响较为显著，而对深层土壤中的微生物数量影响较小。
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2.3 长期秸秆还田对不同土层土壤微生物群落结构的影响
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2.3.1 土壤微生物菌群的α多样性分析
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分析了长期秸秆还田对不同土层土壤细菌和真菌群落α多样性的影响（表1）。由表1 结果可知，细菌、真菌文库覆盖率均达 99% 以上，能够反映土壤中的全部微生物信息。对于细菌群落来说，长期秸秆还田对 10～20 cm 土层的细菌α多样性影响最大，ACE 指数、Chao1 指数、Shannon 指数、PD_whole_tree 指数均呈现显著增加的趋势（P<0.05）。对 0～10、20～30 cm 土层细菌多样性指数的影响较小，除 Shannon 指数外，其他各指数之间均未呈现出显著增加的趋势。采用双向方差分析秸秆还田的土壤深度效应，细菌 ACE、Shannon 和 Simpson 指数存在显著的土壤深度效应，秸秆还田处理与土壤深度之间在 ACE 指数存在显著交互作用。对于真菌群落的α多样性指标来说，秸秆还田没有带来显著影响。结果表明，长期秸秆还田主要引起细菌群落丰度和多样性的变化，而对真菌群落的影响则较小。
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图2 不同土层土壤微生物数量
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注：S：秸秆还田，D：深度。同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。Ns 表示无显著交互作用；* 表示 P<0.05，差异显著； ** 表示 P<0.01，差异极显著。
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2.3.2 土壤微生物菌群的 β 多样性分析
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为比较秸秆还田处理后不同土层土壤微生物群落结构差异，在 OTU 水平进行了土壤细菌、真菌群落 PCoA 分析（图3）。由图3 结果可知，对细菌来说，第一主坐标（PC1）和第二主坐标（PC2） 累计解释了土壤细菌群落结构总变异量的 34.82%。 3 个土层中秸秆还田处理（S）和秸秆不还田对照 （NS）中细菌群落各自聚类，不同处理和土层之间差异极显著（P<0.01）。对于真菌群落来说，第一主坐标（PC1）和第二主坐标（PC2）累计解释了土壤真菌群落结构总变异量的 17.63%，在 3 个土层中还田与未还田真菌群落结构也存在极显著差异性（P<0.01），但是真菌的 R2 值小于细菌。长期秸秆还田对细菌群落结构的影响较大，而对真菌群落结构的影响较小。
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图3 土壤微生物的细菌（a）和真菌（b）的 β 多样性
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2.3.3 土壤微生物菌群群落结构分析
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对比分析了秸秆长期还田处理在 0～10、 10～20、20～30 cm 3 个深度土层中细菌门水平的差异，由图4a 可知，2 个处理 3 个土层前 10 位的优势菌门均相同，按丰度大小依次为酸杆菌门 （Acidobacteria，36.88%～39.95%）、变形菌门（Proteobacteria，22.28%～26.12%）、绿弯菌门（Chloroflexi，7.79%～10.37%）、放线菌门（Actinobacteria， 6.32%～8.19%）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes， 6.29%～7.26%）、Rokubacteria（3.75%～5.84%）、拟杆菌门（Bacteroidetes，2.24%～3.78%）、浮霉菌门（Planctomycetes，1.48%～1.95%）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae，1.07%～2.00%）、Latescibacteria（0.62%～1.37%）。秸秆还田处理的 0～10 cm 土层中酸杆菌门、变形菌门、浮霉菌门和 Latescibacteria 均显著增加（P<0.05），其中后 2 个菌门增幅达极显著水平（P<0.01）；而绿弯菌门、放线菌门、芽单胞菌门、Rokubacteria、硝化螺旋菌门的相对丰度显著降低（P<0.01）。在 10～20 cm 土层中细菌菌门变化与 0～10 cm 土层变化趋势相似，但呈显著变化的微生物菌群变少，其中变形菌门、浮霉菌门、Latescibacteria 呈现显著升高 （P<0.01），硝化螺旋菌门丰度显著降低（P<0.01）。 20～30 cm 土层中没有显著差异的菌门，说明细菌群落结构变化也呈现随土壤深度增加而差异变小的趋势。
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图4b 为两处理中丰度前 10 位的优势菌属，丰度由高到低依次为 uncultured_bacterium_c_Subgroup_6 （22.59%～24.98%）、RB41（4.05%～5.10%）、 uncultured_bacterium_f_Gemmatimonadacea（3.90%～4.57%）、uncultured_bacterium_o_Rokubacteriales（3.18%～4.36%）、MND1（2.28%～2.72%）、Sphingo-monas（2.00%～3.38%）、uncultured_bacterium_ c_Subgroup_17（1.89%～2.41%）、uncultured_ bacterium_c_KD4-96（1.21%～2.10%）、Nitrospira （1.07%～2.00%）、uncultured_bacterium_c_Gittgs-136（0.96%～2.16%）。与对照相比，秸秆还田处理在 0～10 cm 土层中，uncultured_bacterium_c_ Subgroup_6（P<0.01）、uncultured_bacterium_c_KD4-9 （P<0.001）的相对丰度显著升高，uncultured_bacterium_f_Gemmatimonadaceae、uncultured_bacterium_ c_Gitt-gs-136、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas） （P<0.05）、硝化螺旋菌属（Nitrospira）（P<0.01）、 uncultured_bacterium_o_Rokubacteriales（P<0.01）的相对丰度显著降低。10～20、20～30 cm 土层中 10 种优势菌无显著差异。
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图4 门（a）、属（b）水平上的细菌群落结构
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另外，分析了门和属水平长期秸秆还田对真菌群落结构的影响（图5a 和 5b），大于 1% 的优势真菌门和属在秸秆还田处理和对照的不同土层中均相同，其中子囊菌门（Ascomycota）丰度最高，平均丰度为 80.57%。其次为被孢菌门（Mortierellomycota），平均丰度为 8.43%，排名第三和第四位的分别为担子菌门（Basidiomycota）和壶菌门（Chytridiomycota），平均丰度分别为 7.66%、 1.18%。图5b 为属水平上真菌菌群结构，大于 1% 的优势属依次为镰孢菌属（Fusarium，20.28%～20.98%）、被孢霉属（Mortierella，8.02%～9.06%）、曲霉属（Aspergillus，7.37%～7.86%）、青霉属（Penicillium，5.64%～6.08%）、芽枝霉属 （Cladosporium，5.01%～5.77%）、毛葡孢属 （Botryotrichum，4.51%～4.77%）、帚枝酶属 （Sarocladium，3.85%～4.08%）、黑孢属 （Nigrospora，3.28%～3.66%）、链格孢属（Alternaria，3.08%～3.29%）和附球菌属（Epicoccum， 1.74%～1.86%）。分析 2 个处理在 3 个土层中门和属水平上的差异菌群，均不存在显著差异，说明长期秸秆还田对真菌群落结构和丰度的影响较小。
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2.3.4 土壤微生物分子生态网络分析
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由表2 结果可知，长期秸秆还田 0～10 cm 土层中细菌分子生态网络具有更加复杂的联系，表现出更高的节点数、模块性、网络直径和平均路径长度。模块化分析长期秸秆还田处理和对照的互作网络（图6），秸秆还田处理具有高度互连节点的模块化结构，网络中起关键链接作用的类群为变形菌门的 Altererythrobacter 和拟杆菌门的 uncultured_bacterium_f_Microscillaceae （ 图7a），而对照的细菌网络则未出现明显的模块化。对比分析 2 个处理 10～20 cm 土层细菌网络结构发现，秸秆还田处理的网络直径、网络密度、平均路径长度增加较为明显 （表2、图6a），说明秸秆还田能够使 10～20 cm 土层的分子生态网络更加复杂，细菌群落内的相互作用连接更加紧密。该土层秸秆还田处理土壤细菌网络的连接器为酸杆菌门的 uncultured_bacterium_c_Subgroup_17，NS2 的连接器为变形菌门的 uncultured_bacterium_f_SC-I-84（ 图7a）。2 个处理 20～30 cm 土层的细菌菌群的分子生态网络属性差异较小，未出现较为明显的模块化结构 （图7a）。表明秸秆还田增加了 0～20 cm 土层细菌菌群的网络复杂性、改变了微生物网络的关键核心菌群。
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图5 门（a）、属（b）水平上的真菌群落结构
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对真菌来说，秸秆还田 0～10 cm 土层分子生态网络的节点数、模块性、平均路径长度增加，说明秸秆还田使真菌之间的关系更加紧密。模块内连通性-模块间连通性（Zi-Pi）图显示，S1 的连接器为子囊菌门的 Cephalotrichum、Clonostachys、 Schizothecium、Echria 和被孢菌门的 Mortierella，NS1 网络中没有“连接器”。但是，对于 10～20 cm 土层来说，秸秆还田处理真菌分子生态网络的模块性则降低，20～30 cm 土层中则有所增加（表2、图6b）。且 2 个土层的网络连接器也都发生了明显的改变，S2 连接器为子囊菌门的镰孢菌属、 Sagenomella、Talaromyces，而 NS2 的连接器属于担子菌门的 Hannaella；S3 连接器属于子囊菌门的 Trichoderma、Leptobacillium、Conichaeta、Nigrospora，NS3 的连接器则属于子囊菌门的 Enterocarpus、 Clathrosphaerina（图7b）。说明秸秆还田改变了各土层真菌群落网络结构，但模块性未呈现明显上升。
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图6 生态网络图（a 细菌、b 真菌）
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图7 Zi-Pi 图（a 细菌、b 真菌）
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注：根据模块内连通性（Zi）和模块间连通性（Pi），将节点在微生物网络中的拓扑作用分为 4 类，包括 Module hubs（模块中心点，在模块内部具有高连通度的节点，Zi>2.5 且 Pi<0.62），Connectors（连接节点，在两个模块之间具有高连通度的节点，Zi<2.5 且 Pi>0.62），Network hubs（网路中心点，在整个网络中具有高连通度的节点，Zi>2.5 且 Pi>0.62）以及 Peripherals（外围节点，在模块内部和模块之间均不具有高连通度的节点， Zi<2.5 且 Pi<0.62）。其中网络集线器、模块集线器和连接器被确定为关键分类群。
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3 讨论
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3.1 秸秆还田对不同土层土壤酶活性、可培养微生物数量的影响
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秸秆还田所引起的土壤效应一直受到研究者的广泛关注。本研究对比分析了秸秆还田 15 年和对照土壤的酶活性，0～30 cm 土层脲酶、碱性磷酸酶、过氧化氢酶、蔗糖酶、纤维素酶活性均有所提高。薄国栋等[5]研究表明，秸秆类有机物料的增加改变了土壤的团聚体和孔隙结构，提高了土壤缓冲作用和持水力，为各种酶提供载体，使土壤酶活性提高[17]。另一方面秸秆的输入为土壤中相关微生物提供了丰富的养分，优化了土壤微生物的生存环境[18]，促进微生物新陈代谢活动，能够刺激微生物分泌参与碳氮磷循环相关的土壤酶，导致土壤中酶活性增加[19]。秸秆还田后土壤微生物数量增加也是导致土壤酶活性增加的原因。秸秆还田对不同深度土层土壤酶活性的影响也有研究，矫丽娜等[20]研究发现秸秆还田显著提高了土壤酶活性，在 0～15 cm 土层酶活性增加幅度最大。朱凯丽等[21]研究发现在秸秆还田条件下，0～20 cm 土层的土壤含有较适宜的土壤酸碱度、较高的土壤酶活性和养分含量，提高了土壤肥力。本研究对比分析了秸秆还田与对照 0～10、10～20、20～30 cm 土层的酶活性发现，对土壤酶活性的影响以 0～10 cm 最大，随土壤深度的加深而降低。这主要是由于我国普遍实行秸秆表层还田，大部分秸秆位于 0～20 cm 的耕层，因此对 20～30 cm 土层的影响较小。耕层变浅已经成为我国耕地退化的关键因子，因此进行秸秆深层还田有利于土壤耕层培育。
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微生物是土壤中物质转化的主要推动力，与有机物降解和养分循环密切相关，秸秆还田由于增加了土壤中有机质和其他养分的输入，为微生物生长提供丰富的碳源和氮源，因此微生物数量表现为增加趋势[22]。不同微生物种群在有机物降解和养分循环中的作用不同，其中细菌主要负责易降解物质的转化，因此在秸秆还田初期细菌数量显著升高； 而真菌则主要降解木质纤维素等难降解有机物，则随着秸秆还田时期的延长而数量增多[4]。本研究分析了秸秆还田 15 年小麦收获期土壤细菌和真菌的数量发现，0～10 cm 土层中细菌增加幅度 161.57% 大于真菌增加幅度 123.71%，10～20 和 20～30 cm 土层细菌和真菌数量的增幅也都呈现细菌高、真菌低的情况，说明对于长期秸秆还田来说土壤微生物菌群受当季秸秆还田的影响较小。氨化细菌和硝化细菌决定了土壤中氮素循环的氨化和硝化步骤[23]。本研究发现长期秸秆还田会引起氨化细菌和亚硝化菌数量的显著增加，表明秸秆还田能够促进土壤中氮素循环，从而提高土壤的氨化和硝化活性，为深入研究秸秆还田对土壤氮素循环的影响提供参考。潘晶等[11]研究表明，秸秆还田增加了土壤氨化细菌、硝化细菌和好气性纤维素分解菌数量，这与本研究结果一致。秸秆还田对不同深度土层中可培养微生物的数量也呈现随着土壤深度的加深变化趋势减少的现象[24]，本研究进一步明确了秸秆还田的表层效应，以及对秸秆深层还田措施的需求。
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3.2 秸秆还田对不同土层土壤微生物群落结构、多样性的影响
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土壤微生物群落多样性越高，对于维持土壤微生态平衡越有利，越有利于保障农业高效绿色生产[25]。因此，分析秸秆还田的土壤微生物多样性的效应有利于明确秸秆还田对农业可持续生产的作用。本研究表明，秸秆还田对细菌多样性的影响较大，长期秸秆还田可提高表层土壤（0～20 cm）中细菌群落的丰富度和多样性，这是由于秸秆还田可以直接为土壤微生物提供充足的有效养分，改善细菌栖息环境，从而增加了细菌群落多样性，为植物生长提供了良好的微生态环境。对于深层土壤（20～30 cm）来说，由于秸秆还田的位置限制以及区域常用的旋耕方式，20～30 cm 土层受秸秆还田的影响较小，因此对该土层的细菌多样性影响也较小。袁红朝等[26]研究表明秸秆还田配施氮肥相比单施氮肥显著提升了土壤细菌多样性，也得到了相似的结果。本研究发现长期秸秆还田处理并未显著提升土壤真菌群落多样性。但是，张翰林等[27]研究表明秸秆还田处理的真菌群落多样性显著提高，可能是由于秸秆输入土壤促进了土壤团聚体的形成，为真菌生长创造了良好的条件[28]。而不同研究之间的差异，可能是由于不同研究对象的气候条件、土壤类型、种植模式所引起的。
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细菌作为数量和种类最多的微生物菌群，其门的构成随环境变化相对较小[29]。本研究表明，无论秸秆还田与否，还是不同的土层深度，土壤优势菌门均相同，均为酸杆菌门、变形菌门、绿弯菌门、放线菌门、芽单胞菌门等。但是，长期秸秆还田引起部分菌门丰度的显著变化，变形菌门、酸杆菌门及其部分属的丰度显著增加，其原因可能是由于这些菌群降解和吸收秸秆中的营养，因此促进了这些菌群的增殖[30-31]。变形菌门为不同环境中的优势菌门，广泛参与土壤矿物碳氮等多种营养元素的生物化学循环过程，包含多种氮循环细菌种类[32]。该菌群在秸秆还田处理中占有较高的比例，秸秆还田带来的有机物料通过矿化和降解释放氮，从而补充了土壤氮库，从而增加了变形菌门中氮循环相关微生物种群的丰度，有利于土壤肥力的保持和植物生长。酸杆菌门能够降解植物残体多聚物，具有单碳化合物代谢功能[33]。此外，酸杆菌门中含有许多编码纤维素酶和半纤维素分解酶的基因[34]。这也是秸秆还田处理中变形菌门和酸杆菌门丰度显著增加的理论基础。这些菌群的增加，有利于秸秆中有机物质以及土壤氮素的转化，为植物生长提供较好的微生态环境。
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与细菌相同，2 个处理不同土层优势真菌门也均相同，其中以子囊菌门、被孢菌门、担子菌门的丰度最高，且子囊菌门、被孢菌门为长期秸秆还田处理的真菌网络的关键菌门。代红翠等[35]研究不同耕作和秸秆还田方式下土壤真菌多样性的结果与本研究相同[36]。子囊菌门是农业土壤中最大的真菌类群，该菌具有良好的纤维素和木质纤维素降解特征[37]，因此受秸秆还田影响较大，丰度随养分添加而增加[38]。被孢霉菌为腐生型真菌，它依靠汲取土壤有机物料养分生长，因此在秸秆还田条件下其相对丰度有一定的增加[39-40]。对比分析长期秸秆还田与对照各真菌门和属的差异均未发现显著差异菌群。这与张翰林等[27]基于麦稻轮作秸秆还田系统的结论不一致，这种差异的原因是否与还田时间、秸秆种类有关还有待进一步研究。
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从分子生态网络来看，秸秆还田处理土壤的细菌网络模块指标有所增加，表明秸秆还田能够增加土壤细菌菌群之间的相互作用，对提高土壤生物肥力产生积极的影响[41]。同时，分子生态网络的复杂度增高，也增加了微生物群落对环境胁迫的应对能力[42-43]。但是，对于真菌群落而言，长期秸秆还田未能对真菌分子生态网络表现出正向的影响。因此，长期秸秆还田可提高土壤细菌生态系统的稳定性，然而，土壤真菌群落的稳定性却有所下降。
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4 结论
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长期秸秆还田增加了 0～10、10～20 cm 土层土壤酶活性和微生物数量，增加了细菌的α多样性，改变了表层土壤细菌的群落结构，增加了细菌生态网络的稳定性，降低了土壤真菌生态网络的稳定性。秸秆还田对土壤酶活性、微生物数量、多样性和群落结构的影响，随土壤深度的增加而减弱。本研究为秸秆安全还田提供理论依据。
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摘要
为了探索秸秆还田对不同深度土层土壤微生物多样性及群落构成。采用可培养方法、试剂盒酶活性测定方法和高通量测序技术，以 15 年秸秆还田定位试验土壤为研究对象，测定秸秆还田对小麦收获期 0 ～ 10、 10 ～ 20 和 20 ～ 30 cm 土层土壤微生物种群数量、酶活性以及细菌、真菌多样性和群落结构的影响。结果表明，长期秸秆还田增加了 3 个土层土壤酶活性和可培养微生物数量，0 ～ 10 cm 土层的土壤脲酶、过氧化氢酶、蔗糖酶、碱性磷酸酶、纤维素酶活性以及细菌、真菌、氨化细菌、亚硝化细菌及纤维素降解菌的数量与对照差异显著（P<0.05）；且秸秆还田的土壤酶活性和微生物数量效应随土壤深度的增加而降低。长期秸秆还田显著增加了 10 ～ 20 cm 土层的细菌 ACE 指数、Chao1 指数、Shannon 指数等α多样性指数（P<0.05），改变了各土层土壤的细菌和真菌 β 多样性。另外，长期秸秆还田还改变了细菌和真菌的群落结构，且对细菌群落结构影响较大， 0 ～ 10 cm 土层中酸杆菌门（Acidobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、浮霉菌门（Planctomycetes）和 Latescibacteria 均显著增加（P<0.05）。随着土壤深度的加深，细菌群落结构差异性越来越小。另外，秸秆还田能够使细菌群落间的相互作用连接更加紧密，但会降低真菌群落的稳定性。综上所述，长期秸秆还田对土壤酶活性、可培养微生物数量及细菌群落结构和多样性具有明显正向效应，且对土壤中细菌的积极影响更大。
Abstract
To explore the effects of straw returning on soil microbial diversity and community composition in different depths of soil layers，the effects of straw return on soil microbial population，enzyme activity，bacterial and fungal diversity， and community structure in 0-10，10-20，and 20-30 cm soil layers during the wheat harvest period were studied using cultivable methods，kit enzyme activity determination methods，and high-throughput sequencing techniques. The results showed that long-term straw returning increased soil enzyme activity and the number of cultivated microorganisms in all three soil layers. The activities of soil urease，catalase，sucrase，alkaline phosphatase，cellulase，as well as the number of bacteria，fungi，ammonifying bacteria，nitrobacteria，and cellulose degrading bacteria in 0-10 cm soil layers showed significant differences compared to the control（P<0.05）. Moreover，the soil enzyme activity and microbial quantity effect of returning straw to the field decreased with the increase of soil depth. Long term straw returning significantly increased theα diversity index（P<0.05）of bacterial，namely ACE index，Chao1 index，Shannon index，etc. in the 10-20 cm soil layer， changed the β diversity of bacteria and fungi in each soil layer. In addition，long-term straw returning also changed the community structure of bacteria and fungi，and had a significant impact on the bacterial community structure. In the 0-10 cm soil layer，Acidobacteria，Proteobacteria，Planctomycotes，and Latescibacteria all significantly increased（P<0.05）. As the soil depth deepened，the differences in bacterial community structure became smaller and smaller. In addition，returning straw to the field could make the interaction and connection between bacterial communities closer，but it reduced the stability of fungal communities. Long term straw returning to the field had a significant positive effect on soil enzyme activity， cultivable microbial quantity，bacterial community structure and diversity，and had a greater positive impact on bacteria in the soil. This study clarified the soil microecological effects of straw returning to the field，providing theoretical support for scientific straw returning to the field.