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草莓是营养和经济价值都较高的水果，其色、香、味俱佳，被喻为“水果皇后”，草莓的种植生产吸纳了劳动力，增加了农民收入等。随着设施农业的兴起，草莓的周年生产得以实现，但设施作物栽培的土壤常处在无雨水淋溶、高蒸发、高湿及高温环境[1]，加上复种指数高、施肥投入高等特点[2]，连作必然导致土壤的理化性状和生物学性状改变，影响草莓的生产和发展[3]。
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草莓连作对土壤微生态环境的变化当前已有部分研究。甄文超等[4]研究发现，土壤细菌和放线菌种类及数量随草莓连作年限的增长逐渐降低，土壤真菌的种类和数量随草莓连作年限的增长明显增加。高亚娟等[5]研究发现草莓连作后土壤明显酸化，设施连作土壤真菌数量显著高于露天土壤真菌数量，土壤盐分含量增加，土壤部分养分含量呈增加趋势。陈爱萍等[6]研究表明随着连作年限的增加草莓根际土壤 pH 及有机质含量增加，土壤中速效钾、有效磷和碱解氮的含量减少；土壤细菌及放线菌的数量呈先下降然后上升趋势，真菌数量呈上升趋势；土壤脲酶和蔗糖酶的活性连作 5 年时最低，过氧化氢酶的活性随着连作年限的增加而上升。赵帆等[7]研究发现，草莓根际土壤主要优势细菌有变形菌门等 5 个细菌门，优势细菌属有 16 种；草莓根际土壤主要优势真菌有子囊菌门等 3 个真菌门，优势真菌属有 8 种；全氮和 pH 对土壤中微生物群落结构影响最大。肖蓉等[8]通过高通量测序技术，发现土壤细菌的物种多样性及丰富度连作 3 年后下降，真菌的物种多样性及丰富度上升，重茬 3 年后枝顶孢属、被孢霉属、镰孢菌属等病原微生物大量积累。
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尽管草莓连作土壤微生态变化已有部分研究，但很少有研究报道不同连作年限设施草莓土壤微生物群落变化与土壤理化性质及酶活性变化的相关性。本研究以设施草莓不同连作年限土壤为研究对象，测定土壤理化性质和酶活性，通过高通量测序技术研究土壤微生物群落结构变化，以期找出连作障碍产生的原因。
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1 材料与方法
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1.1 试验地概况
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本试验土样取自河南省中牟县黄店镇武家村，选择新茬草莓、连作 5 年和连作 8 年的设施田块土壤，所选土壤田间管理措施、成土母质以及土壤类型一致，土壤为砂壤质潮土。草莓大棚基肥为复合肥（N-P2O5-K2O=15-15-15）375 kg/hm2、熟鸡粪 35 m3 /hm2，追施大量元素水溶肥（N-P2O5-K2O=15-5-35）150 kg/hm2，每周 1 次。灌溉水源为井水，采用滴灌方式进行水分补充。
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1.2 土样采集
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土样采集于 2021 年 5 月，用土钻通过“S”形布点法取 0～20 cm 土壤，共设 3 个重复，每个重复取 5 个土壤样品混合。试验设 3 个处理：设施新茬草莓土壤（S1）、连作 5 年土壤（S5）、连作 8 年土壤（S8），用低温冰盒快速将所取土样带回实验室，分成 2 份：室内风干土样 1 份，测定土壤的理化性质及酶活性；置于-80℃的冰箱保存 1 份，用于分析土壤中的微生物。
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1.3 土壤理化性质及酶活性测定
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土壤理化性质的测定使用鲍士旦[9]的方法：电极电位法测定土壤酸碱度，土水比 1∶5 浸提-电极法测定电导率，重铬酸钾容量法测定土壤有机质的含量，紫外分光光度法测定硝态氮，碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法测定有效磷，醋酸铵浸提-火焰光度法测定速效钾。土壤酶活性的测定参照关松荫[10]的方法：高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶活性，磷酸苯二钠比色法测定碱性磷酸酶活性，靛酚比色法测定脲酶活性。
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1.4 土壤微生物测定
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本研究委托北京百迈客生物科技有限公司提取样品总 DNA、PCR 扩增并进行纯化、定量和均一化形成测序文库，对细菌 16S rRNA 的 V3～V4 区域和真菌 ITS1 区域使用 Illumina Novaseq 6000 进行双末端测序（Paired-End）。
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分别使用 Trimmomatic 0.33、Cutadapt 1.9.1、 Usearch 10 和 UCHIME 4.2，对原始序列进行过滤、引物去除、拼接以及去除嵌合体序列。在 97.0% 的相似度水平下使用 Usearch 对 Reads 进行聚类、获得 OTU，使用朴素贝叶斯分类器以 SILVA 为参考数据库分类学注释特征序列，在不同水平统计不同样品的群落组成，不同分类水平上物种的丰度表使用 QIIME 生成，样品不同分类学水平的群落结构图通过 R 2.3 工具绘制，Alpha 多样性指数使用 QIIME2 进行评估。
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1.5 数据处理
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本试验数据处理与绘图使用 Excel 2019，单因素方差分析及多重比较使用 DPS 7.05。
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2 结果与分析
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2.1 土壤理化性质及酶活性的变化分析
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由表1 可以看到，随着设施草莓连作年限的增加，土壤电导率和 pH 极显著增加，土壤有机质含量皆处于缺乏水平，随着连作年限的增加无显著变化。随着连作年限的增加，设施草莓硝态氮含量极显著降低。3 个处理有效磷和速效钾含量皆达到高等以上水平，其含量随着连作年限的增加呈显著降低后显著升高的趋势。设施草莓土壤碱性磷酸酶和脲酶活性随着连作年限的增加呈先显著增加后降低的趋势，过氧化氢酶活性随着连作年限的增加呈先降低后升高趋势，但差异不显著。
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注：不同大写和小写字母分别表示处理间差异在 P<0.01 和 P<0.05 水平显著，下同。
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2.2 土壤微生物群落结构分析
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2.2.1 土壤微生物 Alpha 多样性分析
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通过表2 可以看出，随着设施草莓连作年限的增加，土壤细菌 ACE 指数、Chao1 指数、Simpson 指数及 Shannon 指数皆显著增加，说明细菌的群落丰富度以及多样性显著升高。土壤真菌 Alpha 多样性相关指数随设施草莓连作年限的增加变化不明显。
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2.2.2 细菌群落结构变化
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2.2.2.1 细菌门水平群落结构变化
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通过物种分布柱状图在细菌门水平上对设施草莓连作土壤样品进行分析（图1），发现优势群落属于 11 个门（比例大于总测序量 1%）。其中所有样品共有优势菌有变形菌门、酸杆菌门、厚壁菌门、放线菌门、芽单胞菌门、拟杆菌门、绿弯菌门、疣微菌门和硝化螺旋菌门。随着设施草莓连作年限增加，土壤中优势细菌增加，连作 5 年土壤优势细菌较新茬草莓（S1） 增加了 Latescibacteria，设施草莓连作 8 年土壤优势细菌较连作 5 年草莓增加了己科河菌门。
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图1 门水平不同连作年限土壤细菌丰度变化
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通过群落差异显著性分析（图2）发现，随着连作年限的增加，设施草莓土壤变形菌门、酸酐菌门、硝化螺旋菌门和 Latescibacteria 相对丰度显著增加，厚壁菌门、放线菌门和拟杆菌门的相对丰度显著降低，芽单胞菌门在设施草莓连作 5 年时相对丰度显著增加，连作 8 年时丰度呈降低趋势，绿弯菌门相对丰度在设施草莓连作 5 年时显著降低，在设施草莓连作 8 年时极显著增高；疣微菌门在设施草莓连作 8 年时相对丰度极显著降低，而己科河菌门在设施草莓连作 8 年时相对丰度显著升高。由此可见，设施草莓连作土壤细菌群落组成在门水平发生显著改变。
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图2 门水平不同连作年限土壤细菌群落优势菌组成差异显著性分析
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2.2.2.2 细菌属水平群落结构变化
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对设施草莓连作土壤样品进行细菌属水平做物种分布柱状图，结果如图3 所示，相对丰度比例大于总测序量 1% 的共计 17 个属，其中已鉴定识别的属有 4 个。所有样品已鉴定识别共有优势菌有 RB41、芽孢杆菌属、鞘氨醇单胞菌属、硝化螺菌属。新种植设施草莓土壤 uncultured_bacterium_c_AKAU4049、 uncultur-ed_bacterium_o_11-24、uncultured_bacterium_p_Latescibacteria 不是优势菌，而在连作 5 和 8 年设施草莓土壤中均为优势菌；uncultured_bacterium_f_Micrococcaceae 是新茬草莓土壤优势菌，但在连作 5 年和 8 年设施草莓土壤中均不是优势菌。
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图3 属水平不同连作年限土壤细菌的丰度变化
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通过群落差异显著性分析（图4）发现，随着连作年限的增加设施草莓土壤硝化螺菌属相对丰度显著增加，RB41 和芽孢杆菌属相对丰度显著降低，鞘氨醇单胞菌属相对丰度呈先显著增高后显著降低趋势。从细菌属水平看，设施草莓连作土壤细菌群落组成改变显著。
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图4 属水平不同连作年限土壤细菌群落优势菌组成差异显著性分析
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2.2.3 真菌群落结构变化
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2.2.3.1 真菌门水平群落结构变化
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图5 表明，在真菌门水平 3 个处理土壤样品检测出 7 个共有菌门，分别是子囊菌门、担子菌门、被孢霉门、罗兹菌门、油壶菌门、壶菌门以及球囊菌门，仅连作 5 年和 8 年设施草莓土壤中检出蛙粪霉门。在这些菌门中，比例大于总测序量的 1% 的优势菌主要隶属于 3 门，占主要优势的是子囊菌门，在 3 处理土壤样品中所占比例分别为 85.35%、 84.72% 和 84.92%，其次是担子菌门（5.79%、 6.88% 和 7.10%），最后是被孢霉门（4.89%、 5.34% 和 5.24%）。通过差异显著性分析发现，连作会使设施草莓土壤罗兹菌门相对丰度显著降低。
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图5 门水平不同连作年限土壤真菌丰度变化
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2.2.3.2 真菌属水平群落结构变化
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在真菌属水平，对设施草莓连作土壤样品进行物种分布柱状图分析，结果如图6 所示，检出共有土壤真菌优势群落 11 属 （比例大于总测序量的 1%），分别是镰孢菌属、曲霉属、毛葡孢属、枝孢属、青霉属、被孢霉属、帚枝霉属、黑孢子菌属、乌氏霉属、链格孢属和附球菌属。与新种植草莓土壤相比设施草莓连作土壤真菌占比最大的类群发生变化，新种植草莓大棚土壤占比最大的类群是毛葡孢属（18.06%），设施草莓连作 5 和 8 年土壤占比最大的是镰孢菌属，所占比例分别为 18.61% 和 19.41%。
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群落差异显著性分析（图7）表明，设施连作会使草莓土壤镰孢菌属、曲霉属和枝孢属相对丰度显著增加，乌氏霉属和链格孢属相对丰度上升，毛葡孢属的相对丰度显著降低。在属水平，设施草莓连作土壤真菌群落组成变化显著。
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图6 属水平不同连作年限土壤真菌丰度变化
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2.3 土壤优势菌群与土壤理化性质及酶活性相关性分析
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由表3 可知，绿弯菌门和疣微菌门与土壤理化性质及酶活性相关性不显著，其他所测优势菌群与土壤环境因子相关性显著。呈极显著正相关的是变形菌门与 pH，酸杆菌门与电导率，芽单胞菌门与碱性磷酸酶活性，拟杆菌门与硝态氮和速效钾含量，硝化螺旋菌门与电导率和有机质含量，Latescibacteria 与 pH，担子菌门与 pH，被孢霉门与碱性磷酸酶活性；呈极显著负相关的是厚壁菌门与有机质含量，芽单胞菌门与速效钾含量，放线菌门与 pH，子囊菌门与碱性磷酸酶活性，担子菌门与硝态氮含量，被孢霉门与速效钾含量。
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图7 属水平不同连作年限土壤真菌群落优势菌组成差异显著性分析
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注：** 表示 P<0.01，* 表示 P<0.05。
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3 讨论与结论
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3.1 设施草莓连作土壤理化性质及酶活性变化
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土壤酸化是设施作物种植常见现象，是设施作物连作的的障碍因子，而本研究发现，随设施草莓连作年限的增加，土壤 pH 呈现升高趋势，这可能与当地农民长期使用石灰粉消毒、设施土壤次生盐渍化等有关。草莓适宜生长于 pH 为 5.5～6.5 的微酸性环境，在设施草莓连作 8 年时土壤 pH 增长至碱性，不适宜草莓生长。
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徐彬等[11]研究发现设施蔬菜长期连作土壤电导率显著高于短期连作土壤。张福建等[12]研究表明设施辣椒土壤电导率与连作年限呈正相关。韩海蓉等[13]研究表明设施辣椒土壤电导率随着连作年限的增加呈上升趋势。本研究发现，土壤电导率随着设施草莓连作年限的增加上升极显著，说明土壤盐分明显累积。
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所测样品有效磷和速效钾含量分别达到偏高和极高的水平，但与初次种植草莓相比，连作后有效磷和速效钾含量皆显著减少，说明有效磷和速效钾是草莓生长中大量消耗的营养元素。杨红等[14]研究发现，随着蔬菜大棚连作年限的增加，土壤硝态氮含量逐渐降低，而本研究中设施新茬草莓土壤硝态氮含量极显著高于连作设施草莓土壤，这可能与新茬草莓种植前当地长期种植豆角有关，当地种植豆角盛果期，每 5～7 d 冲施硝态氮肥 75 kg/hm2。
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土壤脲酶活性与碱解氮生成速率有关，其活性较高时，可以提高速效氮的含量[15]，本研究中随着连作年限延长，设施草莓土壤脲酶的活性呈先上升而后降低的趋势，其中在设施草莓连作 5 年时变化不显著，连作 8 年时脲酶活性显著降低，脲酶活性的降低也与草莓生长中硝态氮的降低有关。
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3.2 设施草莓连作对细菌、真菌丰富度与多样性的影响
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本研究发现，土壤微生物的多样性随连作年限的增加而改变。与 Zhu 等[16] 和岳思君等[17] 的结果一致，土壤细菌物种丰富度与多样性随着设施草莓连作年限的增加而显著增加，说明土壤某些细菌物种可能会因连作更加多样，而王春燕等[18]和吴凤芝等[19]的研究结果则相反，这些结果的差异可能与地域、土质、作物、管理等不同有关。与肖蓉等[8]的结果一致，随着连作年限的增加，本研究设施草莓真菌群落丰富度及多样性整体呈上升趋势。本研究发现连作土壤微生物多样性指数改变，土壤的益生菌和致病菌群间平衡可能会打破，因此设施草莓连作土壤发病可能性更高。
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3.3 设施草莓连作对土壤细菌群落结构的影响
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设施草莓连作土壤细菌群落结构显著改变。变形菌门在盐渍化土壤中占主要优势[20-21]，而本研究变形菌门丰度显著增加，进一步说明设施草莓连作土壤盐分累积明显，而变形菌门中又含有很多的致病菌[22]，这可能是设施连作草莓病害严重的原因之一。酸杆菌门和绿弯菌门为寡营养菌[23-24]，在本研究中，随着设施草莓连作年限增加，酸杆菌门的相对丰度显著增加，绿弯菌门相对丰度在连作 8 年时极显著增加，说明设施草莓连作土壤的营养状况发生恶化。芽单胞菌门能够降解土壤污染物，而本研究发现连作会显著增加土壤芽单胞菌门相对丰度，说明设施连作土壤污染物增加。研究发现土壤硝化螺旋菌门相对丰度随设施草莓连作年限的增长极显著增加，氮肥的长期施用会提高硝化螺旋菌的相对丰度[25]，而高投入是设施农业的特点之一，势必会造成硝化螺旋菌门相对丰度显著增加。厚壁菌门和放线菌门与病害抑制相关[26]，与李晶晶等[27]和张勇勇等[28]的研究一致，本研究中厚壁菌门及放线菌门的相对丰度随着连作年限的增加而极显著下降，说明设施草莓连作会增加土壤病害发生的概率。拟杆菌门是农业土壤利用的敏感生物指标[29]，与土壤 pH 呈正相关[30]，而在本研究中发现设施草莓连作土壤拟杆菌门的相对丰度发生极显著降低，与土壤 pH 呈显著负相关，其原因有待进一步探究。
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研究发现，疣微菌门的基因簇具有合成抗生素的潜能[31]，本研究发现土壤疣微菌门在设施草莓连作 8 年时相对丰度极显著降低，说明设施草莓连作 8 年可能会减少土壤微生物抗生素的合成，对草莓抗病不利。
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3.4 设施草莓连作对土壤真菌群落结构的影响
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草莓连作土壤真菌群落结构显著改变。随着连作年限的增加设施草莓土壤真菌优势菌群在门水平未发生显著变化，在属水平上，设施草莓土壤优势真菌菌群相对丰度多数呈上升趋势，其中镰孢菌属、曲霉属、枝孢属丰度显著增加，土壤乌氏霉属和链格孢菌属整体增加，而镰孢菌属可引起草莓枯萎病，是最难防治的土传病害之一[32]，曲霉属是导致根腐病的土传病原菌之一[33-34]，枝孢属会引起草莓黄萎病[35]，乌氏霉属可引起植物煤污病[36]，链格孢菌属会引起草莓黑腐病[37]，说明设施连作会增加土壤中致病菌的数量。
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3.5 设施草莓连作土壤优势菌群与土壤理化性质及酶活性的相关性分析
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植物根系的微生态环境与土壤的理化性质、酶活性以及微生物群落密切相关[38]。本研究表明，所测土壤理化性质及碱性磷酸酶活性与大多数土壤优势菌门相关性显著甚至达极显著水平，说明土壤中的微生物群落组成变化可能与土壤环境因子对优势菌门的影响有关。
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与前人研究结果一致[39-41]，土壤优势菌门的丰富度与土壤的 pH 及电导率有较强的响应，说明土壤酸碱性和土壤盐分积累明显影响土壤微生物群落组成；土壤微生物主要优势菌门与所测土壤养分响应较强，说明设施作物长期施肥不合理，土壤微生物群落结构组成被严重影响，从而产生连作障碍。土壤中硝态氮、有效磷和速效钾的含量及比例可能是土壤微生物群落维持稳定的关键，因此要合理配施氮、磷、钾，注意增施有机肥。
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综上，随着连作年限的增加，设施草莓土壤 pH，电导率，硝态氮、有效磷和速效钾含量皆有显著变化，碱性磷酸酶和脲酶活性呈先显著上升后显著下降趋势；土壤细菌 Alpha 多样性指数显著升高，设施草莓连作土壤微生物群落结构发生改变，土壤病原微生物数量增加；设施连作草莓土壤微生物群落的变化，与土壤理化性质及酶活性密切相关，草莓连作障碍的产生是多种因素综合作用的结果。
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摘要
为探索不同连作年限设施草莓土壤细菌和真菌群落结构变化及其与土壤环境因子的关系，通过高通量测序对新茬（S1）、连作 5 年（S5）和连作 8 年（S8）的设施草莓土壤样品进行测序分析，并测定土壤的理化性质以及土壤酶活性。结果显示，随着设施草莓连作年限的增加，土壤的 pH 和电导率极显著升高，硝态氮含量极显著降低，有效磷及速效钾的含量先显著减少后显著增加，碱性磷酸酶和脲酶活性呈显著上升后显著降低趋势。随着设施草莓连作年限的增加，土壤细菌 ACE 指数、Chao1 指数、Simpson 指数及 Shannon 指数皆显著增加，而土壤真菌的 Alpha 多样性指数的变化不显著。土壤中细菌和真菌优势菌群组成发生改变，随着设施草莓连作年限增加，土壤细菌变形菌门、酸酐菌门、硝化螺旋菌门和 Latescibacteria 相对丰度显著增加，厚壁菌门、放线菌门和拟杆菌门的相对丰度显著降低；在属水平上，设施草莓土壤硝化螺菌属相对丰度显著增加，RB41 和芽孢杆菌属相对丰度显著降低，鞘氨醇单胞菌属相对丰度呈先显著升高后显著降低趋势。设施草莓连作土壤优势真菌在门水平无显著变化，在属水平上，土壤真菌占比最高优势菌由毛葡孢属转变为镰孢菌属，草莓土壤病原菌镰孢菌属、曲霉属、枝孢属相对丰度显著增加，乌氏霉属、链格孢属整体增加。相关性分析显示，影响土壤微生物群落的主要因素有土壤 pH、电导率、有机质、硝态氮、有效磷和速效钾，微生物群落结构的变化对碱性磷酸酶活性影响较大。
Abstract
In order to explore the changes of bacterial and fungal community structure in greenhouse strawberry soil with different continuous cropping years and their relations with soil environmental factors，the soil samples of greenhouse strawberry planted in the first year（S1），continuous cropping for 5 years（S5）and continuous cropping for 8 years（S8） were sequenced and analyzed by high-throughput sequencing，and the physical and chemical properties of soil and soil enzyme activities were determined. The results showed that with the increase of continuous cropping years of strawberry in greenhouse，soil pH and electrical conductivity increased significantly，nitrate nitrogen content decreased significantly， available phosphorus and available potassium content decreased significantly first and then increased significantly，and alkaline phosphatase and urease activity increased significantly and then decreased significantly. With the increasing of continuous cropping years of strawberry in greenhouse，the ACE index，Chao1 index，Simpson index and Shannon index of soil bacteria increased significantly，while the Alpha diversity index of soil fungi did not change significantly. The composition of soil microbial dominant species changed. With the increase of continuous cropping years，the relative abundance of bacterial Proteobacteria，Acidobacteria，Nitrospirae and Latescibacteria in greenhouse strawberry soil increased significantly，while the relative abundance of Firmicutes，Actinobacteria and Bacteroidetes decreased significantly. At the genus level，the relative abundance of Nitrospira in strawberry soil increased significantly，the relative abundance of RB41 and Bacillus decreased significantly，and the relative abundance of Sphingomonas increased significantly first and then decreased significantly. At the phylum level，there was no significant change in the dominant fungi of strawberry continuous cropping soil in the greenhouse. At the genus level，the dominant fungi with the highest proportion of soil fungi changed from Botryotrichum to Fusarium. The relative abundance of Fusarium，Aspergillus and Cladosporium in strawberry soil increased significantly，and the relative abundance of Uwebraunia and Alternaria increased as a whole. Correlation analysis showed that soil pH，electrical conductivity，organic matter，nitrate nitrogen，available phosphorus and available potassium were the main factors affecting the microbial community in soil，and the change of microbial community structure had a great influence on the activity of alkaline phosphatase.