红芸豆（Phaseolus vulgaris L.）为豆科菜豆属草本植物，具有抗旱能力强、生育期短、经济价值高的特点，是山西省旱区农业产业结构中一类重要的杂粮^[1]。红芸豆在山西省忻州市神池县、五寨县和岢岚县的种植规模较大，其中岢岚县种植和出口规模居全国第一，被称为“中华红芸豆第一县”^[2]。然而随着红芸豆种植面积的不断增加，连作障碍逐年加重，导致根腐病害的发生^[3]，造成红芸豆结瘤率低、产量和品质下降，如何促进红芸豆生长、提高红芸豆产量和效益是目前山西省红芸豆产业发展亟待解决的问题。

接种根瘤菌是国际上公认的实现豆科作物高效种植的有效方式^[4]。根瘤菌是一类革兰氏阴性细菌，可以与豆科植物形成共生关系，在植株根部形成根瘤，而根瘤菌可以把空气中的氮气转化为氨，进而为宿主提供氮源^[5]。相较于氮肥，豆科植物与根瘤菌的有效组合完成的生物固氮具有成本低、氮素利用率高、对环境无污染的优点，符合绿色农业发展的要求^[6]。共生体在共生固氮方面的有效性各不相同，而红芸豆长期以来被认为具有低潜力的结瘤性，共生固氮能力弱^[7]。因此，筛选并应用高效的根瘤菌株来实现红芸豆的高效结瘤与生长是实现红芸豆产业高质量发展的关键。但目前相关研究中有关根瘤菌的研究大多集中在大豆和苜蓿上，对于杂豆作物红芸豆的研究相对较少，红芸豆根瘤菌的研究还主要集中在菌种多样性等方面^[8-9]。虽然国内外对红芸豆高效根瘤菌进行了少量研究，但仅集中于东北、陕西等少数地区^[10-11]，对于山西省红芸豆高效根瘤菌的筛选和与红芸豆的共生匹配性还未见报道。

根瘤菌侵染豆科植物形成根瘤是一个十分复杂的过程，这一共生固氮系统的有效建立，首先需要根瘤菌与豆科植物的识别匹配^[12]，不同种类的根瘤菌与豆科植物之间相互存在着一个识别选择范围^[13]。一般而言，从特定种类的豆科植物中分离出的根瘤菌都能与该种植物识别共生^[14]。因此，高效根瘤菌多从目标作物根际中分离筛选，从而在极大程度上保证根瘤菌与供试植株的匹配性。此外，近年来关于根瘤菌新功能的扩展研究报道指出，根瘤菌的生物活性在根瘤菌成功侵染豆科植物根部形成根瘤等过程中发挥着重要作用。根瘤在生长过程中成为有效根瘤，并且能够固氮，主要是由于根瘤中所形成的根瘤固氮酶所建成固氮系统作用的结果，而固氮酶是由根瘤菌产生的^[15]；研究表明，根瘤菌分泌的胞外多糖不仅可以富集环境中的营养元素，还参与根瘤菌与宿主植物相互作用时的信号交流，在促进根瘤菌侵染宿主、改变宿主植物的根毛细胞骨架结构、决定宿主专一性、参与自身抵御宿主防御系统反应等过程中发挥着不可替代的作用^[16]，在与豆科植物早期侵染互作过程中，根瘤菌所分泌的结瘤因子和胞外多糖是双方对话的重要信号物质^[17]；吲哚乙酸（IAA）可以通过抑制植物防卫系统酶活性，使根瘤菌更易于侵染植物形成根瘤^[18]，而解磷根瘤菌能有效缓解植物在仅提供难溶性无机磷的环境中受到的缺磷胁迫，并使之恢复正常生长^[19]。根瘤菌的生物活性对揭示根瘤菌促进目标作物根系结瘤的作用机理有重要意义。

因此，本研究从山西省忻州市 3 个红芸豆主栽区的红芸豆根际根瘤样品中分离、纯化根瘤菌株，通过形态学鉴定挑选了代表菌株进行分子生物学鉴定，最终选择了来自不同地域、不同种类的红芸豆根瘤菌。对供试菌株的生物活性如固氮酶活性、分泌胞外多糖能力、分泌 IAA、溶磷能力等进行初步探索，结合盆栽回接方法，探究根瘤菌的生物活性对红芸豆植株生长和结瘤的影响，筛选结瘤固氮能力强、植物促生效果好的优良根瘤菌株，为该地区高效红芸豆根瘤菌剂的研制和应用提供科学依据，进而更好地推动根瘤菌剂的研制和应用。

1 材料和方法

1.1 供试材料

1.1.1 根瘤样品

根瘤样品采集自山西省红芸豆 4 个主栽区域，分别为岢岚县大涧乡官庄村、岢岚县三井镇、神池县大严备乡、五寨县黄崖湾乡。共采集红芸豆根瘤样品 200 份。

1.1.2 红芸豆

红芸豆品种为‘英国红’，由山西农业大学农业基因资源研究中心提供。

1.2 根瘤菌菌株的分离纯化

选取红芸豆根上大、饱满的根瘤，于当天进行分离培养。分离、纯化方法参照文献^[20]进行。将纯化菌株接种至酵母甘露醇琼脂（YMA）液体培养基中，28℃振荡培养 3～5 d 后，制备成 30% 的甘油菌，于-80℃超低温冰箱中冻存。

1.3 根瘤菌的鉴定

参照一般细菌常用鉴定方法^[21]，对纯化后革兰氏染色镜检为阴性的菌株，进一步观察菌体形态特征。最终按不同地域、不同形态选取代表菌株共 10 株根瘤菌进行快 / 慢生根瘤菌的 B.T.B 检测^[22]和分子学鉴定。利用细菌基因组 DNA 提取试剂盒（上海派森诺生物科技有限公司）提取菌株的总 DNA 作为模板，得到的 16S rDNA 序列用 NCBI Blast 程序将拼接后的序列文件与 NCBI 16S 数据库中的数据进行比对，然后选取参比菌株与目标根瘤菌构建根瘤菌系统发育树。首先使用 Mafft 7.505 对样本序列进行比对，然后使用 Fasttree2.1.11 SSE3 构建最大似然树。

1.4 根瘤菌生物活性测定

1.4.1 根瘤菌固氮酶活性测定

固氮酶活性测定参考文献^[23-24]的方法，采用固氮酶酶联免疫分析试剂盒（江苏酶免实业有限公司）测定固氮酶活性。将所有待测根瘤菌分别接种于 YMA 液体培养基中，于 28℃、150 r·min^-1 培养 3 d 后，由江苏科特生物科技有限公司检测。其回归方程为 y=0.3484+124.7116x，R² =0.9964。

1.4.2 根瘤菌分泌胞外多糖能力的测定

胞外多糖能力的测定参照文献^[25]进行。标准曲线采用葡萄糖进行配置，将供试根瘤菌样品带入标准曲线中，测定样品溶液吸光值，并根据标准曲线计算胞外多糖含量。

1.4.3 根瘤菌分泌吲哚乙酸能力的测定

根瘤菌分泌 IAA 能力的测定参照文献^[26]进行。标准曲线采用 3-IAA 进行配置，将供试根瘤菌样品带入标准曲线中，测定样品溶液吸光值，根据标准曲线计算 IAA 的含量。

1.4.4 根瘤菌溶磷能力的测定

根瘤菌溶磷能力的测定参照文献^[27]进行。采用钼锑抗比色法，分别测定根瘤菌溶解有机磷和无机磷的量，最终根据公式计算根瘤菌的溶磷能力。公式为：

$\text{溶磷量}\left(\mathrm{m}\mathrm{g}\cdot {\mathrm{L}}^{-1}\right)=\frac{\left(P\times V_1\times K\right)}{V_2}$

式中，P：标准曲线上磷的浓度（mg·L^-1）；K：稀释倍数；V₁：显色液体（mL）；V₂：吸取上清液体积（mL）。

1.5 根瘤菌盆栽回接试验

将待测根瘤菌分别挑取接种到 50 mL YMA 液体培养基中，于 28℃、150 r·min^-1 条件下的恒温摇床培养 3 d，用无菌水调节菌液浓度为 1×10⁸ cfu·mL^-1 待用。红芸豆种子用 95% 乙醇溶液处理 2 min，再用 3% 次氯酸钠进行表面消毒 5 min 后，用无菌水冲洗 10 次。然后将处理后的种子放于灭菌后的培养皿中，在 25℃条件下的人工培养箱内进行催芽。发芽后播种于装有灭菌蛭石的 17 cm×15.5 cm 双层营养钵中，置于人工气候室中进行培养（每天光照培养 16 h，温度 25℃；黑暗培养 8 h，温度 20℃）。待红芸豆植株第一片真叶展开时，分别回接待测根瘤菌菌液 50 mL，并以浇灌 50 mL YMA 液体培养基为空白对照（CK），每个处理重复 3 次，定期补充 Fahraeus 无氮植物营养液^[28]。接种根瘤菌 28 d 后进行收获，采集红芸豆植株样品，进行红芸豆植株生长指标的测定，包括株高、茎粗、根长、结瘤数、地上地下部鲜重和干重、根瘤鲜重和干重、植株全氮含量等。

1.6 根瘤菌生物活性对红芸豆结瘤和生长指标的相关性分析

采用 SPSS 26.0 进行根瘤菌对红芸豆结瘤和生长指标的相关性分析。

1.7 数据统计分析

采用 Excel 2010 整理数据，将获得的数据用 LSD 法进行多重比较，同时使用 SPSS 26.0 进行统计学分析，使用 Origin 2019 进行绘图。使用 Fasttree 2.1.11 SSE3 构建根瘤菌系统发育树。

2 结果与分析

2.1 根瘤菌的分离纯化及鉴定

利用刚果红 YMA 培养基进行根瘤菌分离，共得到 139 个纯化菌株。纯化菌株经革兰氏染色鉴定，鉴定结果显示 131 株根瘤菌均为革兰氏阴性菌。这些菌体细胞均呈杆状，长短不一，基本呈圆形、椭圆形，2～5 d 开始长出菌落，乳白色或半透明色，菌落表面凸起，边缘整齐，产生黏液，具光泽，符合根瘤菌的基本形态特征。按不同地域、不同形态进行菌株分类，选取 10 株菌株为代表菌株用于后续筛选（表1）。10 株根瘤菌在含有 0.5% 溴麝香草酚蓝的 YMA 上暗培养后呈黄色，培养基（指示剂）变蓝色表明菌株产碱为慢生根瘤菌，培养基（指示剂）变黄色表明菌株产酸为快生根瘤菌，因此判断这 10 株根瘤菌均为快生根瘤菌。对上述根瘤菌属菌株进行 PCR 扩增，然后进一步与 NCBI 数据库中的参比菌株序列进行比对，构建系统发育树（图1），结果发现，RH64、RH74、RH102、 RH111、RH131 与参比菌株 Rhizobium indicum 发生聚类，而 RH105、RH110、RH118、RH128、RH130与参比菌株 Rhizobium etli 发生聚类。结合菌株形态学观察、B.T.B 鉴定和系统发育树分析，表明这 10 株红芸豆根瘤菌株分属 Rhizobium indicum 和 Rhizobium etl。

2.2 根瘤菌生物活性测定

2.2.1 根瘤菌固氮酶活性

10株供试根瘤菌株固氮酶活性的测定结果显示（图2），供试根瘤菌株均表现出固氮酶活性，但不同菌株之间的固氮酶活性存在差异。其中 RH64、RH105、RH111 根瘤菌株的固氮酶活性相对较高，为 250.11～253.22 U·L^-1；活性大小顺序为 RH64>RH105>RH111，与其余 7 株根瘤菌株间均呈现出显著差异（P<0.05）。而根瘤菌株 RH118 固氮酶活性最低，为 231.48 U·L^-1。

2.2.2 根瘤菌分泌胞外多糖的能力

10 株供试根瘤菌株分泌胞外多糖能力的测定结果显示（图2），供试根瘤菌株均具有分泌胞外多糖的能力；不同菌株之间分泌胞外多糖能力存在差异，其中 RH64 分泌胞外多糖的能力最强，为 415.43 mg·L^-1，与其余 9 株根瘤菌株间均呈现出显著差异（P<0.05）；RH118 分泌胞外多糖能力最弱，为 95.64 mg·L^-1。

注：柱上小写字母不同表示差异显著（P<0.05）。下同。

2.2.3 根瘤菌分泌吲哚乙酸能力的测定结果

10 株供试根瘤菌株分泌 IAA 能力的测定结果显示（图3），供试根瘤菌株均具有分泌 IAA 的能力，但不同菌株之间分泌 IAA 的能力存在差异，其中 RH130 分泌 IAA 的能力最强，为 40.12 mg·L^-1，与其余 9 株根瘤菌株间均呈现出显著差异（P<0.05）；RH118 分泌 IAA 能力最弱，为 16.73 mg·L^-1。

2.2.4 根瘤菌溶磷能力的测定结果

10 株供试根瘤菌株溶磷能力的测定结果显示（图3），供试根瘤菌株均具有溶解有机磷的能力；不同菌株之间溶解有机磷的能力存在差异，其中 RH102 溶解有机磷的能力最强，为 166.84 mg·L^-1，与其余 9 株根瘤菌株间均呈现出显著差异（P<0.05）；RH118 溶解有机磷的能力最弱，为 98.31 mg·L^-1。

10 株供试根瘤菌具有溶解无机磷能力的菌株有 4 株，其中 2 株供试根瘤菌溶解无机磷的能力相对较高，与其余 2 株菌株间均呈现出显著差异（P<0.05），最高为 RH102，有效磷增量为 4.12 mg·L^-1，其次是 RH131，有效磷增量为 4.08 mg·L^-1。该结果也表明根瘤菌株溶解有机磷与无机磷的能力不具有一致性。

2.3 根瘤菌盆栽回接试验结果

选取山西省忻州市红芸豆不同主栽区、不同种类的 10 株根瘤菌进行盆栽回接筛选试验，以探究不同根瘤菌对红芸豆生长发育和结瘤能力的影响。结果显示，10 株供试根瘤菌均能促进红芸豆植株的生长发育，经根瘤菌处理后的红芸豆植株长势较好、株高较高、叶片颜色较深，未经根瘤菌接种处理的对照组（CK）长势较差、植株弱小、叶片较小、颜色较浅，且处理组与对照组相比表观差异明显（图4）。回接处理 28 d 后，各处理组与对照组相比，红芸豆株高、茎粗、植株地上部鲜重和干重分别显著增加了 2.22%～20.23%、10.85%～21.43%、 34.92%～138.00% 和 22.62%～132.14%（表2）（P<0.05），其中 RH64 表现较好。此外，回接根瘤菌的红芸豆植株氮含量显著提高了 7.00%～27.75%（表2） （P<0.05），其中接种 RH105 菌株的红芸豆植株氮含量显著高于其他根瘤菌处理（P<0.05）。

续表

注：表中数据为平均值 ± 标准误，同列数据后的不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。下同。

根瘤平均数、根长、根瘤鲜重和干重、地下部鲜重和干重的测定结果显示（表3），10 株供试根瘤菌均能与红芸豆植株共生形成根瘤，而不接种根瘤菌的红芸豆（CK）则不能形成根瘤。数据统计发现，接种红芸豆根瘤菌后，红芸豆植株平均结瘤数目在 26～173 个之间变化。其中 RH64 结瘤能力最强，为 173 个，显著高于其他处理（P<0.05），而 RH118 结瘤能力最弱，为 26 个。同时，回接根瘤菌处理还显著提升了红芸豆植株的根部性状，显著促进了红芸豆植株的根长和地下部生物量（图5），与不接种根瘤菌相比，回接根瘤菌红芸豆植株根长、地下部鲜重和干重分别增加了 26.79%～115.61%、15.91%～171.59% 和 44.44%～288.89%（P<0.05）（表3），其中 RH64 表现最好，RH110、RH118 表现最差，这表明不同根瘤菌与同种供试植株具有不同的共生匹配性。

综合促生效果和结瘤能力，在 10 株供试根瘤菌中，分离自神池县大严备乡的根瘤菌株 RH64 具有最强的结瘤促生能力，与其余菌株呈现显著差异，与山西省忻州市主栽红芸豆品种有着最适的共生匹配性，属于供试根瘤菌中最优的固氮根瘤菌。

2.4 根瘤菌生物活性与红芸豆结瘤和生长指标的相关性分析

采用相关性分析探究了根瘤菌生物活性与红芸豆结瘤和生长指标的关系（图6），结果显示，根瘤菌胞外多糖含量和固氮酶活性与红芸豆根瘤数呈极显著相关（P<0.01），这表明根瘤菌可能通过胞外多糖和固氮酶来驱动红芸豆植株结瘤。而根瘤菌 IAA、有机磷、无机磷能够显著促进红芸豆植株的生长发育和根部的生长（P<0.05），根瘤菌生物活性与株高和植株氮呈负相关，其余均呈正相关，但对红芸豆结瘤未存在显著相关性。

注：* 表示在 0.05 水平下相关性显著；** 表示在 0.01 水平下相关性显著。

3 讨论

3.1 接种根瘤菌对红芸豆植株结瘤和生长的影响

目前，对于山西省红芸豆根瘤菌资源多样性研究在国内尚无文献报道，本研究在山西省忻州市 3 个主栽县的红芸豆根瘤样品中，分离鉴定了 10 株代表根瘤菌株，分属 Rhizobium indicum 和 Rhizobium etli。

豆科植物与根瘤菌形成的共生固氮体系是效率最高且被研究最为广泛的一种^[29]。宿主植物与不同根瘤菌结合的结瘤固氮效率存在差异，选择与宿主植物匹配且固氮效率高的根瘤菌是提高共生固氮的重要途径^[30]。在高效根瘤菌的筛选和评价体系中植株地上部生物量、氮素积累量和根部性质是评价根瘤菌促进植株生长情况和结瘤能力、固氮效率的重要指标^[31-32]。本研究结果表明，与对照相比，接种红芸豆主栽区分离的根瘤菌能显著增加红芸豆植株的茎粗、鲜重和干重以及氮素积累量，显著促进了红芸豆植株的生长发育；与对照组相比，接种根瘤菌还能显著提高红芸豆植株结瘤，能够显著增加红芸豆植株的根长及根鲜重和干重，显著促进红芸豆根部的发育。Samago 等^[33]研究也发现，接种根瘤菌显著提高了红芸豆植株生长，共生性能和籽粒产量；接种根瘤菌还能显著提高红芸豆结瘤^[34]，增加叶片含氮量^[35]和提高土壤肥力^[36]。这证实接种根瘤菌能够有效提高红芸豆的产量及效益。此外，本研究中的根瘤菌均分离自红芸豆主栽区，与主栽品种具有更高的匹配性，有利于高效根瘤菌在红芸豆根际的快速定殖。

根瘤菌株 RH64 分离自神池县大严备乡，为 Rhizobium indicum，是山西省忻州市红芸豆根瘤菌中的优势菌。本研究结果表明，RH64 与其他根瘤菌株处理相比能够显著促进红芸豆植株的结瘤和生长发育，且室内试验中的生物活性都较为优异，这表明它能够与山西省主栽红芸豆品种形成良好的共生匹配性，是高效的根瘤菌株。

3.2 根瘤菌生物活性与红芸豆结瘤和生长指标的相关性分析

根瘤菌和豆科植物建立共生体系通过结瘤和固氮两个过程完成^[37]。固氮酶复合体是所有已知的重氮营养生物固氮的中心单位，在根瘤菌-豆科植物共生中起着至关重要的作用^[38]；在根瘤内，根瘤菌依靠来自宿主植物的碳源进行生长和提供能力，允许它们通过固氮酶将大气中的 N₂ 转化为 NH₃ ^[39]。研究表明，根瘤菌产生的胞外多糖可以减弱或规避根瘤菌侵染宿主时遇到的防御反应，保护自身免受宿主防御^[40]，促进根瘤菌的侵染，并有助于营养吸收，表明粘附以及根瘤发育的信号和共生感染过程^[41]。本研究结果表明，根瘤菌胞外多糖含量对红芸豆结瘤和生长指标有着极显著的相关性（P<0.01），这表明根瘤菌胞外多糖含量或许是影响红芸豆结瘤和生长的主要因素；而根瘤菌固氮酶活性和胞外多糖含量与红芸豆结瘤数呈极显著相关（P<0.01），这一结果表明，固氮酶和胞外多糖在一定程度上影响着红芸豆的结瘤。本研究中根瘤菌株 RH64 被证实具有最优的固氮酶活性以及胞外多糖含量，这或许是其促进红芸豆结瘤效果好的关键。

根瘤菌可以通过分泌 IAA 促进植物生长发育，可以促进植物根生长、改变根形态，增加根长度、根毛数、侧根数、重量及表面积，对于植物吸收养分和水分具有促进作用^[24]。根瘤菌还可以通过溶磷作用，将不可溶磷转化为植物可利用的磷，以增加植物对营养物质的利用^[42-43]。本研究结果表明，根瘤菌的 IAA、有机磷、无机磷能够对红芸豆生长发育和根部生长有着显著的促进作用（P<0.05），虽然对红芸豆结瘤未存在显著相关性，但可以促进结瘤相关微生物的生长繁殖，故在促进结瘤中也存在一定的正面效应。本研究中根瘤菌株 RH64 的产 IAA 以及溶磷能力虽不是最优，但仍处于相对较高水平，这对其促进红芸豆表现出最优的结瘤与较佳的促生效果有重要意义。

4 结论

本研究通过山西省忻州市红芸豆主栽区的根瘤菌筛选发现，接种 Rhizobium indicum 的 RH64 对红芸豆结瘤能力和促生效果显著高于其他菌株， RH64 与山西省忻州市主栽红芸豆品种的共生匹配性最好，为优势根瘤菌。相关性分析结果表明，根瘤菌固氮酶活性和胞外多糖含量与红芸豆结瘤存在着极显著的相关性（P<0.01），是影响接种根瘤菌后红芸豆结瘤数的主要因素之一；根瘤菌产 IAA 能力和溶磷作用则能够显著促进红芸豆植株生长发育。RH64 能与山西省忻州市主栽红芸豆品种形成良好的共生匹配性，是山西省高效根瘤菌剂研制的菌种资源。

参考文献