红砂岭是以红层软岩区基岩裸露和密集侵蚀沟为特征的红层荒漠景观^[1]。红砂岭的形成过程被称为“红层荒漠化”，即以人为干扰为诱因，在强烈风化与侵蚀等综合作用下，红层软岩区地表原有生态结构遭到破坏，土层侵蚀，基岩或其风化壳裸露，土地生产力衰竭的极端性土地退化过程^[2]。紫色土是红层软岩经风化形成的初育土，其矿物营养丰富，潜在肥力较高，是重要的旱作土壤之一^[3]。由于红层荒漠化，红层地表的紫色土逐渐呈现出土层浅薄，质地松软，保水抗旱能力弱，有机质含量低等退化特征，且退化程度随荒漠化加深而加重^[4]。这种由荒漠化所引起的土壤退化是影响该地区农业生产健康发展的主要阻碍。因此，如何培肥土壤和减缓水土流失是改良退化紫色土的关键所在。

秸秆覆盖、有机肥和微生物菌剂是常用于土壤改良的有效措施。秸秆覆盖通过抑制土壤蒸发，促进雨水入渗来提高土壤蓄水保水能力，同时可通过减少径流，减缓土壤侵蚀，改善土壤结构，实现土壤肥力状况的改善^[5]。有机肥具有较高的稳定性，较强的吸附性能和较好的保肥供肥性能，且含有丰富的腐植酸、大量生物活性物质和微生物，可加速营养物质的转化，促进作物生长^[6]。根际促生菌 （Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）是一类具有固氮、溶磷、分泌植物激素、增强植物防御机制和改善土壤性质等作用的有益微生物^[7-8]。类芽孢杆菌作为广泛使用的根际促生菌，其制成的菌剂具有较好的改善土壤理化性质，促进植物生长的作用^[9]。此外，多数研究发现，秸秆覆盖、有机肥和微生物菌剂处理的土壤改良效果受地理位置、微气候和土壤性质等因子的影响^[10-12]。冯军等^[13]研究发现，多雨气候中覆盖的改良效果低于少雨时期； 于冰等^[14]、徐万里等^[15]的研究发现，有机肥可显著增加红壤土壤微生物多样性，而未改变灰漠土土壤微生物多样性。也有学者研究建议多种改良措施配施具有更好的土壤改良效果^[16]。

土壤微生物作为土壤生态系统的重要组成部分，在调节养分循环、影响植物生产力和生态系统稳定性方面发挥重要作用^[17]。目前研究发现，土壤微生物群落和多样性的变化可以反映土壤生态系统的内稳性、土壤对生态胁迫的缓冲能力和土壤的营养状况，故其可作为重要且敏感的指标表征土壤质量的变化^[18]。磷脂脂肪酸（Phospholipid fatty acid，PLFA）是土壤微生物细胞膜的关键成分，具有多样性和生物学特异性，故可作为微生物的生物标记，用于鉴定和识别土壤微生物种类和类群，进而确定土壤微生物群落结构组成及多样性^[19-21]。

现有土壤改良研究主要关注的还是耕作措施及施肥种类差异对土壤肥力改良效果的影响，而对不同改良措施下土壤微生物群落生物多样性和群落结构影响的了解不够，并且红砂岭荒漠化背景下退化土壤改良措施及土壤微生物群落的响应还鲜有报道。本研究在典型红砂岭区域-南雄盆地，通过田间试验，采用磷脂脂肪酸微生物分析技术，探究秸秆覆盖、生物菌剂和有机肥等不同组合措施对红砂岭退化土壤微生物群落结构和多样性的影响差异，并结合相关土壤理化性质变化，明确土壤微生物群落变化与土壤理化性质之间的关系，以期从微生物角度评价不同改良措施对退化土壤的改良效果，从而对华南红砂岭地区建立合理的农业管理模式，提高土壤质量，促进土壤生态恢复，提高作物产量和经济效益具有参考价值。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

南雄盆地地处大庾岭南麓，整体地势西北高东南低，中部丘陵沿浈江分布，盆地内的红层区存在着严重的土地退化问题，主要表现为斑块分布的红砂岭。本试验于 2022 年 8 月—2023 年 1 月在广东省韶关市南雄盆地湖口镇试验田进行，该试验区位于南雄盆地中部丘陵红砂岭地区，属于亚热带季风气候，雨热同期，平均气温约 19.9℃，年降水量达 1966 mm ^[22]，试验田土壤类型为紫色土，试验前测得耕层土壤为砂黏土，pH 值为 8.31，有机质含量1 0.86 g·kg^-1，碱解氮含量 34.14 mg·kg^-1，有效磷含量 13.75 mg·kg^-1，速效钾含量 166.61 mg·kg^-1。

1.2 供试材料

供试花生品种为‘粤油 114’。试验采用 3 种土壤改良措施：微生物菌剂克里本类芽孢杆菌菌剂（Paenibacillus kribbensis PS04）航天突变体由华南农业大学植物保护学院提供；蚯蚓粪有机肥由佛冈沃土农业科技有限公司提供，其有机质含量为 33.2%，全氮、磷、钾含量分别为 1.5%、1.5% 和 1.3%。本研究秸秆覆盖使用当地花生秸秆。

1.3 试验设计

土壤改良试验采用完全随机区组设计，设计了以下 8 种处理：（1）微生物菌剂 + 有机肥 + 秸秆覆盖 （BOM），（2）微生物菌剂 + 有机肥（BO），（3）有机肥 + 秸秆覆盖（OM），（4）菌剂 + 秸秆覆盖（BM）， （5）秸秆覆盖（M），（6）微生物菌剂（B），（7）有机肥（O），（8）无处理对照（CK），每个处理 5 次重复，小区面积 1 m×2 m，共 40 个小区。播种后，将当地花生整杆秸秆均匀覆盖于土壤表面，覆盖量为 8000 kg·hm^-2，后续试验不再覆盖任何材料；微生物菌剂处理前先将菌剂原液稀释 75 倍，待花生出苗后每株浇灌 400 mL，后续每隔两周浇灌一次，一次 200 mL； 播种前，含有有机肥的处理小区施用蚯蚓粪有机肥 572 kg·hm^-2 作为底肥，后续未添加任何肥料。

1.4 土壤样品采集与测定

1.4.1 土壤样品采集

在处理120 d（ 花生成熟期） 后进行取样，使用直径 5 cm 的取土钻以五点取样法取深度为 0～20 cm 的土壤，然后混合均匀作为每个重复小区的复合样品。土壤采集后，一部分土壤风干后过 2 mm 筛进行土壤理化性质的测定，另一部分鲜土分装到 50 mL 离心管中，立即放入-80℃冰箱保存，用于提取土壤微生物磷脂脂肪酸。

1.4.2 土壤样品理化性质的测定

土壤含水量（SWC）采用烘干称重法测定，土壤 pH 值采用玻璃电极法（2.5∶1 的水土质量比） 测定，有机质（SOM）含量采用 TOC 仪测定，碱解氮（AN） 含量采用碱解扩散法测定，有效磷 （AP）含量采用盐酸-氟化铵提取法测定，速效钾 （AK）含量通过乙酸铵浸提-火焰光度法测定。

1.4.3 土壤磷脂脂肪酸提取

土壤磷脂脂肪酸的提取和分析采用修正 Bligh-Dyer 方法进行。称取 8 g 冷冻干燥的土壤样品于离心管中，加入甲醇、氯仿和磷酸盐缓冲液（2∶1∶0.8）的混合液进行脂质提取。采用 SPE 固相萃取柱进行 PLFA 纯化、甲酯化。以 25 μg·mL^-1 19:0 脂肪酸甲基酯为内标，使用气相色谱仪（Agilent 7890B，Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA） 搭载火焰离子检测器（GFFID）进行样品脂肪酸含量测定。使用 MIDI 软件的 Sherlock 微生物鉴定系统进行磷脂脂肪酸的识别与定性，单位用 nmol·g^-1 表示。测定结果参照文献 ^[20-21]进行归类（表1）。

注：i、a、cy 和 Me 分别表示异、反异、环丙基和甲基分枝脂肪酸；w、c 分别表示脂肪端、顺式空间构造；OH 表示羟基，N alcohol 表示醇基； Aldehyde 表示酚基；DMA 表示二甲基缩醛。

由于不同菌群的 PLFA 特征图谱不同，在高度专一性基础上具有多样性，故可作为微生物群落中不同群体的标记物。总 PLFA 含量用于表示土样微生物生物量；分别计算真菌与细菌的比值（F/B）、革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌的比值（G+/G-）、异构与反异构脂肪酸的比值（iso/anteiso），含环丙基脂肪酸与含前体单不饱和脂肪酸的比值（cy/pre） 表征微生物群落结构的变化^[23]。

1.5 统计分析

土壤生物多样性分析通过微生物 PLFA 数据计算微生物种群的 Shannon-Wiener 多样性指数 （H’），Pielou 均匀度指数（J），丰富度指数（M） 和 Simpson 优势度指数（D）。使用 Excel 2019 对数据进行预处理，用 SPSS 26.0 单因素方差分析（oneway ANOVA）和多重比较法分析不同模式间各项指标的差异显著性（P<0.05）；利用 R 4.4.1 中的 vegan 包将土壤理化指标和磷脂脂肪酸进行冗余分析和蒙特卡洛置换检验，以揭示土壤理化指标对土壤微生物群落结构变化的影响；图形绘制采用 Excel 2019 和 R 4.4.1 中的 ggplot2 包。

2 结果与分析

2.1 土壤改良处理对土壤理化性质的影响

如表2 所示，BOM 和 OM 处理对土壤理化性质的改良效果显著高于其他处理，与 CK 处理相比，土壤含水量分别高出 1.33、1.29 倍；土壤有机质高出 1.17 和 1.20 倍；碱解氮高出 1.5 和 1.43 倍；有效磷高出 2.54 和 2.23 倍；速效钾高出 1.88 和 1.75 倍；而 BM 处理显著增加土壤含水量和速效钾，BO 处理显著增加碱解氮含量。单一改良措施处理中，与 CK 处理相比，O 处理显著增加土壤有机质碱解氮和有效磷含量；M 处理明显增加土壤含水量；B 处理除显著增加土壤有机质含量外，其余指标均低于 CK 处理。

2.2 土壤改良处理对土壤微生物多样性的影响

如表3 所示，BOM、BO、OM、BM、M 处理土壤微生物的 Shannon-Wiener 多样性指数，Simpson 优势度指数和丰富度指数显著高于 CK 处理，且彼此间差异不显著。土壤微生物均匀度指数在各处理间差异不显著。

注：不同小写字母代表不同处理间差异显著（P<0.05）。下同。

2.3 土壤改良处理对土壤微生物群落结构的影响

通过对所有土壤微生物磷脂脂肪酸进行提取分析，共有 86 种磷脂脂肪酸生物标记（ 表1），可分为真菌、丛枝真菌、普通细菌、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、厌氧菌和放线菌，其中细菌在土壤微生物类群中占据优势地位。与 CK 处理相比，BOM、BO、OM、BM 和 M 处理显著提高了真菌、丛枝真菌、革兰氏阴性菌的相对丰度，降低了革兰氏阳性菌、厌氧菌的相对丰度。而 B 处理则显著提高了厌氧菌和放线菌的相对丰度。

多种改良措施配施处理显著增加土壤微生物磷脂脂肪酸总量和各类群磷脂脂肪酸含量，其 OM 处理具有最大的增幅，与 CK 处理相比，磷脂脂肪酸总量高出 2.23 倍，其中，真菌高出 3.82 倍；丛枝真菌高出 2.98 倍，革兰氏阳性菌高出 1.87 倍，革兰氏阴性菌高出 2.50 倍，厌氧菌高出 1.84 倍。单一改良处理中，M 处理显著增加总量和各类群磷脂脂肪酸含量；O 处理仅显著增加总量；B 处理总量和各类群的含量无显著差异，其中革兰氏阳性、阴性菌和真菌含量低于 CK 处理。

BOM、BO、OM、BM 和 M 处理的真菌与细菌的比值显著高于 CK 处理，其中 BOM 和 OM 处理的比值显著高于其他处理，分别为 CK 处理的 1.56 和 1.59 倍，B 处理略小于 CK 处理。BOM、BO、 OM、BM 和 M 处理的革兰氏阳性菌与阴性菌比值显著低于 CK 处理，其中 OM 处理的比值最低，为 1.29；BOM、BO、OM 和 BM 处理的 iso/anteiso 值显著高于 CK 处理，其中 OM 处理的比值显著高于 CK 处理 1.31 倍；cy/pre 值在各处理间无显著变化。

2.4 土壤理化性质与土壤微生物的相关性

土壤微生物 Shannon-Wiener 多样性、Simpson 优势度和丰富度与土壤含水量、碱解氮、有效磷和速效钾具有显著的正相关，与 pH 值为负相关；Pielou 均匀度与土壤含水量和速效钾呈显著负相关。

土壤微生物磷脂脂肪酸总量和各类型微生物磷脂脂肪酸含量与土壤含水量、土壤有机质、碱解氮、有效磷和速效钾具有显著的正相关，与 pH 值具有显著的负相关。真菌与细菌比值与土壤含水量、碱解氮、有效磷和速效钾呈极显著正相关，与 pH 呈显著负相关，革兰氏阳性与阴性菌比值与土壤含水量、速效钾呈极显著负相关，与碱解氮、有效磷和有机质呈显著负相关；iso/anteiso 值与碱解氮呈极显著正相关，与土壤含水量、有机质、有效磷和速效钾呈显著正相关，与 pH 值呈显著负相关。

注：小写字母不同表示不同处理间差异显著（P<0.05）。下同。

注：*、**、*** 分别表示不同处理间差异达到 P<0.05、P<0.01、P<0.001 显著水平。

采用冗余分析（RDA）进一步分析土壤微生物群落结构和土壤理化因子之间的关系（ 图4），蒙特卡洛置换检验结果表示，所有排序轴对应的环境变量对于响应变量的解释贡献均达到统计学上的显著水平。结果显示，第一主轴解释了变异的 50.39%，第二主轴解释了变异的 17.23%。在第一轴上，OM、BOM、M、BM 和 CK 处理显著分离，速效钾、有效磷、碱解氮和土壤有机质含量是影响微生物群落的主要驱动因子。

注：* 表示 P<0.05，** 表示 P<0.01。

3 讨论

土壤微生物是土壤生态系统最活跃的分解者，在土壤养分循环中扮演重要角色，可以敏感地指示气候和土壤环境条件的变化^[17]。本研究发现，相较于单一改良措施处理，秸秆覆盖、蚯蚓粪和菌剂两两配施和三者配施处理更有利于改良土壤理化性质，丰富土壤微生物生物多样性，改变微生物群落结构，并对土壤微生态的稳定性产生影响，其中秸秆覆盖和蚯蚓粪配施处理的改良效果最为显著。

3.1 秸秆覆盖与有机肥配施对土壤微生物的影响

前人研究表明，秸秆覆盖和蚯蚓粪处理均可有效改善土壤理化性质，丰富土壤微生物含量^[24-30]。但在本研究中，秸秆覆盖处理显著提高土壤微生物多样性和丰富度，增加微生物生物量总量及各类群生物量，但未能改善土壤有机质、有效养分含量。而蚯蚓粪处理显著提高土壤有机质和速效养分含量的同时，未能有效增加土壤微生物的各项指标。这可能与退化紫色土土壤特性及土壤有机质激发效应有关。随着红层荒漠化的程度增加，紫色土的肥力越贫瘠，蓄水能力越差。相关性分析表明，土壤微生物多样性和丰富度与土壤含水量和土壤有机质、土壤养分（碱解氮、有效磷和速效钾）呈显著正相关（图3）。土壤水分可通过改变微生物的细胞渗透状态、土壤基质有效性和温度等直接或间接影响土壤微生物的多样性^[31]。以往研究发现，秸秆覆盖处理可通过抑制蒸发促进入渗，保蓄土壤水分，提高土壤水利用效率^[32]。在本研究中，秸秆覆盖的土壤含水量显著高于其他处理（表2），为土壤微生物生长提供了一个稳定而潮湿的环境，促进其生长和繁殖。土壤有机质激发效应是指外源碳输入导致土壤本底有机质分解速率发生改变的现象^[33]。其机制是由于外源碳的输入使土壤微生物数量增长，加剧微生物对土壤有效态氮、磷的需求，导致土壤养分化学计量比失衡，进而刺激微生物激发土壤本底有机质矿化来获取额外的营养元素以满足微生物本身的生长和繁殖。激发效应的方向和强度受多因素的限制，主要与土壤有效养分化学计量比有关^[34]。本研究中，秸秆覆盖通过维持稳定水分环境和提供额外碳源刺激土壤微生物的生长和繁殖，产生激发效应，最终在有效提升微生物生物多样性和生物量的同时无法显著增加土壤中有机质和速效养分的含量。Wang 等^[35]通过添加外源无机氮增加土壤速效氮含量，最终降低土壤有机质激发强度。蚯蚓粪与花生秸秆相比，其有效养分含量丰富且均衡，可在蚯蚓粪刺激土壤微生物分泌胞外酶，加速降解有机物料，促进微生物生长繁殖的同时，有效缓解土壤本底有机质矿化，提高土壤有机质和速效养分的含量^[36]，而蚯蚓粪处理未能有效改善紫色土水分环境，限制了微生物群落的长期发展。在本研究中，综合秸秆覆盖和蚯蚓粪配施两者的优势，有效改善土壤理化性质，且显著促进土壤微生物生物量和生物多样性的增长。相关研究表明，真菌的碳源利用效率高于细菌，且对环境变化的敏感度低于细菌，因此环境中真菌细菌比越高，环境越稳定^[37]。相较于革兰氏阴性菌，革兰氏阳性菌具有较厚的细胞壁，对逆境胁迫的抵抗力较强^[38]。当处于逆境时，革兰氏阳性菌磷脂脂肪酸多为 anteiso 结构，革兰氏阴性菌磷脂脂肪酸多形成 cy 结构^[39]。在本试验中，相较于单一改良处理，秸秆覆盖和蚯蚓粪配施显著增加真菌细菌比值，降低革兰氏阳性菌与阴性菌比值，增加 iso/anteiso 值，进一步证明秸秆覆盖和蚯蚓粪配施可有效缓解紫色土肥力贫瘠和水分缺失对土壤微生物的环境胁迫，优化土壤养分环境，增加土壤微生态的稳定性。

3.2 微生物菌剂处理对土壤微生物的影响

类芽孢杆菌作为广泛使用的植物根际促生菌，具有促进植物生长、刺激植物抗逆性的作用^[9]。以往研究发现，类芽孢杆菌可通过诱导植物自身的抗性机制和分泌抑菌物质来保护植物，促进植物生长^[40]。刘双等^[41]、石皓文等^[42]研究发现，田间接种固氮类芽孢杆菌可增加小麦和夏玉米产量。在本研究中，类芽孢杆菌菌剂处理未能显著改善土壤理化指标及土壤微生物各项指标，这可能受到红砂岭土壤退化形成的特殊低有机养分和不易保水易干旱的环境条件影响，使得菌株难以定殖发挥原有的改良效果。冗余分析结果表明，微生物群落结构组成与土壤含水量、土壤有机质、土壤速效养分之间具有显著相关性（图3）。Jiang 等^[43]的研究发现，外施单一菌种菌剂在黑土中对土壤理化和土壤微生物群落的影响要高于红壤土，即表示土壤理化性质尤其是土壤肥力的变化会改变菌剂的改良效力。 Mawarda 等^[44]研究表明，外施微生物菌剂的生长和繁殖会在不同程度上改变本地土壤微生物的群落结构组成，其改变程度同样取决于土壤理化性质和土壤微生态的影响。本研究发现，在秸秆覆盖、施用蚯蚓粪及两者配施的基础上，采用微生物菌剂处理在一定程度上改善土壤理化性质，增加土壤微生物生物量并改变了微生物群落的结构组成。进一步说明了在干旱和养分贫瘠胁迫有所缓解的情况下，微生物菌剂的添加也具有改良土壤的潜力，例如微生物菌剂与秸秆覆盖和蚯蚓粪有机肥三者配施处理中，菌剂可以更有效地刺激微生物产生激发效应，在有效提高土壤有机质和速效养分的同时，增加土壤微生物生物多样性。由于本试验采用磷脂脂肪酸分析，很难进一步探究菌剂在土壤中的定殖过程及其对土壤微生物类群的影响。因此，关于类芽孢杆菌菌剂对植物微生物群落的影响亟须进一步研究。

4 结论

从本研究结果来看，秸秆覆盖和蚯蚓粪处理对红砂岭退化土壤具有不同方向的改良效果。覆盖处理可以显著提高土壤含水量和微生物生物量及其多样性，并显著改变土壤微生物群落结构；蚯蚓粪处理可以显著提高土壤有机质、碱解氮、有效磷含量；在本研究中，微生物菌剂对土壤理化性质、土壤微生物群落未产生显著影响。相较于单一改良措施处理，多种改良措施配合可以明显改善土壤生态环境，显著提高土壤微生物的数量与活性，并在不同程度上影响土壤微生物群落结构组成，其中，秸秆覆盖配施蚯蚓粪处理的改良效果最为显著。

参考文献