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多年生栽培草地是指将两种或两种以上抗性较强、形态学互补的多年生牧草混合栽培，形成的具有群落结构稳定和可持续利用等优越性的人工草地[1]。面对青藏高原高寒地区天然草地退化和草畜矛盾等亟待解决的问题，多年生混播草地发挥着关键性作用[2]。一方面，建植人工草地有效地恢复了退化草地，使原本裸露的土壤快速被植被覆盖，从而缓解了水土流失[3]。另一方面，建植人工草地改善了土壤理化性质和碳汇能力，使原本贫瘠的土壤环境得以恢复[4-5]。再者，人工草地的饲草产量明显高于天然草地，有效解决了牧区冬季饲草供应不足等问题[6]。然而，在实践过程中发现，多年生人工草地在建植后 3～5 年期间开始退化[7]。针对这一现象，学者们开展了大量的施肥试验，以维持多年生人工草地的生产力暂稳态[8]。由于青藏高原高寒草地土壤氮限制比较严重，氮素是限制植物生长的关键因子[9]。因此，氮素添加是维持多年生高寒栽培草地暂稳态的必要措施之一。然而，过量的氮添加导致氮素利用率低和土壤氮素过剩，不仅造成经济损失，而且给生态环境构成了严重的威胁[10-11]。因此，精准的氮添加技术是实现草地农业可持续发展和生态环境保护双重效益的关键前提，氮添加方案的确定是一项草地乃至农业生产实践中亟需解决的科学问题[12]。
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土壤微生物是土壤生态系统中十分活跃的生物组分，具有分解有机质和矿物质等功能[13]，调控着土壤肥力形成和群落演替等过程，对土壤碳、氮、磷及生态系统的物质循环具有重要影响[14-15]。土壤微生物通过对碳、氮和磷元素的固定间接影响土壤碳、氮、磷含量，从而影响植物的生长[16]。土壤微生物生物量碳（MBC）、微生物生物量氮（MBN）和微生物生物量磷（MBP） 是土壤活性营养库的主要构建者[17]，是衡量土壤碳、氮、磷养分转化的重要指标，它可以判断出草地土壤养分的限制状况[18]。吕晶花等[19]的一项氮添加研究表明，土壤理化性质的效应值高于植物群落多样性和生物量。因此，高寒草地的土壤 MBC、MBN、MBP 化学计量特征受土壤理化特性的影响较大[20]，而外源氮素添加直接改变了土壤理化性质。以往文献报道中，关于氮添加对土壤微生物生物量的影响结论尚不统一。王丽娜等[21]研究发现，氮添加改变了高寒草地土壤的 MBC 和 MBN，且随着施氮量的增加显著降低；而王丽君等[22]研究发现，氮添加显著提高了 MBC、MBN 和 MBP；这种结论的反差很大程度上是由于试验地的环境而造成的。研究表明，土壤含水量与微生物生物量碳氮比（MBC/MBN）和微生物生物量碳磷比（MBC/MBP）存在显著负相关关系，土壤全氮和 MBC/MBP 存在显著负相关关系[23]。那么氮添加方式下这种关系是否会发生改变有待进一步研究。此外，氮素形态对土壤环境也有着显著的影响[24]，目前，尚未有氮素形态对高寒人工草地土壤 MBC、MBN、MBP 及其化学计量特征的影响研究。
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鉴于上述研究背景，本研究以建植 4 年的多年生人工草地为研究对象，设置了 3 个氮素形态和 4 个施氮水平，对不同处理下的土壤理化性质、 MBC、MBN、MBP 及化学计量比进行了比较，并深入分析了两者之间的关系，旨在明确氮添加对青藏高原高寒人工草地 MBC、MBN、MBP 及其化学计量特征的影响，并揭示影响 MBC、MBN 和 MBP 及其化学计量特征的主要因素，以期为多年生高寒人工草地的暂稳态维持提供理论借鉴。
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1 材料和方法
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1.1 试验地概况
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试验区位于青海省海南藏族自治州共和县巴卡台农牧场（100 °55′E，36 °17′N），平均海拔 3300 m，年平均降水量 300 mm，年蒸发量 2000～2400 mm，年平均气温 4.1 ºC。试验区冬季寒冷漫长，夏季温和短暂，年内干旱少雨且温度偏低，气温垂直分布明显，太阳辐射强，属高原大陆性气候特征。降水季节性分布不均，主要集中在 7—10 月。试验地土壤为高山草甸土和黄绵土[25]。
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1.2 试验设计
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2022 年 6 月，以 4 年龄的青海草地早熟禾 （Poa pratensis Qinghai）+ 青海冷地早熟禾（Poa crymophila Qinghai）+ 青海中华羊茅（Festuca sinensis Qinghai）型 3 组分混播草地为研究对象，以不施肥（CK）作为对照，设置 U1：酰胺态氮（尿素） 22.5 kg·hm-2·年 -1、U2：酰胺态氮（尿素）45 kg· hm-2·年-1、U3：酰胺态氮（尿素）67.5 kg·hm-2·年 -1、 A：铵态氮（硫酸铵）67.5 kg·hm-2·年-1 和 N：硝态氮（ 硝酸钙）67.5 kg·hm-2· 年 -1，共 6 个处理。采用随机区组方案，每个处理设有 3 个重复，共 18 个小区，小区面积为 4 m×4 m，小区间隔 5 m。将称好的肥料分为等量的 2 份，分别于 6 月上旬和下旬加到 2 L 水中溶解摇匀后装入喷壶，均匀喷洒在相应的小区内，CK 处理喷洒相应的水。
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1.3 样品采集与分析
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1.3.1 样品采集
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采用 5 点取样法，用直径 3.5 cm 的土钻采集 0～20 cm 土层土壤，混合均匀后分为 2 份，其中 1 份用于测定土壤理化性质，另 1 份储存于 4℃环境中，用于测定土壤 MBC、MBN、MBP 含量[25]。
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1.3.2 测定方法
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参照鲍士旦[26]的《土壤农化分析》进行土壤理化性质（pH、电导率、含水量、有机碳、全磷、速效氮、有效磷、全碳、全氮、硝态氮和铵态氮） 的测定。土壤微生物生物量（MBC、MBN、MBP） 测定采用氯仿熏蒸法[27]。
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1.4 数据处理
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利用 Excel2016 对原始数据进行整理，运用 SPSS 27.0 进行单因素方差分析（P<0.05），以检验不同处理下土壤理化性质和微生物生物量的差异。冗余分析（RDA） 在线上平台（https: //www .omicstudio .cn/tool/65）完成，其他图利用 Origin 2022 绘制。
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2 结果与分析
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2.1 氮添加对土壤理化性质的影响
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由表1 可知，氮添加在一定程度上提高了土壤含水量，但增幅不明显。氮添加显著降低了土壤容重和 pH（P<0.05），且随着施氮水平的提高土壤容重和 pH 逐渐降低，相同氮水平时条件下，酰胺态氮对土壤容重和 pH 的作用效果最强。氮添加显著提高了土壤电导率（P<0.05），U1 和 U2 处理下的土壤电导率相近，相同氮水平下不同氮素形态相比，对土壤电导率的促进作用表现为酰胺态氮 >硝态氮 >铵态氮。此外，随着施氮水平的提高，土壤有机碳、铵态氮、硝态氮、速效氮、有效磷、全碳、全氮和全磷含量均逐渐增加。相同氮水平下不同氮素形态相比较，硝态氮肥对土壤有机碳、有效磷和全氮的促进作用最强，铵态氮肥对土壤铵态氮和全磷的促进作用最强，酰胺态氮肥对土壤速效氮和全碳的促进作用最强。
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注：表中数据为平均值 ± 标准差（n=3）。不同小写字母表示不同处理之间差异显著（P<0.05）。
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2.2 氮添加对土壤微生物生物量及生态化学计量特征的影响
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不同氮素处理对土壤微生物生物量及化学计量比具有不同程度的影响（图 1）。由图 1（a）可以看出，施氮水平和氮素形态均未显著改变土壤 MBP含量（P>0.05）。氮添加显著提高了土壤 MBN 含量A>N>U3。氮添加提高了土壤 MBC 含量，高氮水平下较为显著，3 种氮形态对 MBC 的促进效果表现为 N>U3>A。
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图1 不同氮素处理下土壤微生物生物量及生态化学计量特征变化
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注：同一扇形中不同小写字母表示不同处理间差异显著（P<0.05）。MBC、MBN、MBP 分别为微生物生物量碳、微生物生物量氮、微生物生物量磷；MBC/MBN、MBC/MBP、MBN/MBP 分别为微生物生物量碳氮比、微生物生物量碳磷比、微生物生物量氮磷比。下同。
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由图1（b）可以看出，氮添加一定程度上降低了土壤 MBC/MBN，但变化不显著（P>0.05）。氮添加提高了土壤 MBC/MBP 和微生物生物量氮磷比（MBN/MBP），高氮水平对 MBN/MBP 具有显著的促进作用。3 种氮形态对 MBC/MBP 的作用效果表现为 N>U3>A，对 MBN/MBP 的促进效果表现为 N>A>U3，对 MBC/MBN 的削弱效果表现为 A>U3>N。
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2.3 土壤微生物生物量及其生态化学计量特征的影响因素分析
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采用 Pearson 相关性分析和 RDA 分析对氮添加方式下土壤理化性质与土壤微生物生物量及其生态化学计量比间的相互关系做了进一步分析。相关性分析表明（表2），土壤 MBC 与 pH 呈极显著负相关（P<0.01），与有机碳、有效磷和全氮呈极显著正相关关系（P<0.01）。土壤 MBN 与 pH 和容重呈极显著负相关（P<0.01），与有机碳、铵态氮、硝态氮、有效磷、全氮和全磷呈极显著正相关关系 （P<0.01）。MBP 与速效氮和全碳呈显著负相关关系 （P<0.05）。土壤理化性质对 MBC/MBN 的影响较小。 MBC/MBP 与土壤含水量、速效氮、全碳和全氮呈极显著正相关（P<0.01），与土壤容重和 pH 呈显著负相关（P<0.05）。MBN/MBP 与土壤容重和 pH 呈极显著负相关（P<0.01），与土壤含水量、有机碳、速效氮、有效磷、全碳和全氮呈极显著正相关关系（P<0.01）。RDA 分析表明，第一、二排序轴解释率分别为 48.56% 和 22.02%，累计解释率达到 70.58%，说明第一、二排序轴能较好地反映两者之间的相互关系，且具有生物统计学意义（图2）。土壤全氮（r2 =0.6424，P=0.001）、pH（r2 =0.6051， P=0.002）和有机碳（r 2 =0.6093，P=0.002）是影响土壤微生物生物量及化学计量特征的主要土壤理化因子。
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注：*、** 分别表示相关性达到 P<0.05 显著水平、P<0.01 极显著水平。MBC、MBN、MBP 分别为微生物生物量碳、微生物生物量氮、微生物生物量磷；MBC/MBN、MBC/MBP、MBN/MBP 分别为微生物生物量碳氮比、微生物生物量碳磷比、微生物生物量氮磷比。
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图2 土壤理化性质与微生物生物量及其化学计量比的 RDA 分析
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注：BD、EC、WC 和 TC、TN、TP、OC、AN、AP、NH4 +-N、NO3--N 分别为容重、电导率、含水量和全碳、全氮、全磷、有机碳、速效氮、有效磷、铵态氮、硝态氮含量。
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3 讨论
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3.1 氮添加对土壤理化性质的影响
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氮添加给土壤带来的影响与氮素形态和施氮水平密切相关[28]。本研究中，氮添加在一定程度上提高了人工草地的土壤含水量，这与高浩诚等[29]研究结论相似，但本研究中增幅不明显，可能与氮添加和取样时间等因素有关。土壤容重和 pH 随着施氮水平的提高而逐渐降低，这与以往大多研究结论一致[30-31]，一方面氮添加会导致土壤酸化[32]，从而降低土壤 pH；另一方面氮添加有利于土壤团聚体的形成，改善了土壤结构，进而降低了土壤容重。此外，酰胺态氮肥对土壤容重和 pH 的作用效果优于铵态氮和硝态氮，可能是因为相比铵态氮肥（硫酸铵） 和硝态氮肥（硝酸钙），酰胺态氮肥（尿素）的含氮量较高，对土壤氮限制的解除更为有利。土壤电导率是精细化植物栽培的必要参数之一，可直接反映土壤质量和物理性质等信息，过高会造成烧苗，过低则养分亏缺，影响植物生长[33-34]。本研究中，对照的土壤电导率为 82.8 μS·cm-1，远低于其他区域，说明试验区土壤养分较为贫瘠，亟需要制定合理的养分管理策略，以改善当前的土壤质量。本研究发现，氮添加显著提高了土壤电导率，对土壤电导率的促进作用表现为酰胺态氮 >硝态氮 >铵态氮，这再次说明酰胺态氮在改善土壤性质方面具有明显的优越性。此外，随着施氮水平的提高，土壤有机碳、铵态氮、硝态氮、速效氮、有效磷、全碳、全氮和全磷含量均逐渐增加。对于氮限制非常严重的区域，该结论是必然的。在青藏高原地区，低温和氮限制共同抑制了植物的生长，一旦氮限制被解除，与氮有关的土壤微生物以及氮循环微生物功能基因被迅速激活，进而改变了整体的土壤环境[35-36]。此外，本研究还发现，硝态氮肥对土壤有机碳、有效磷和全氮的促进作用最强，铵态氮肥对土壤铵态氮和全磷的促进作用最强，酰胺态氮肥对土壤速效氮和全碳的促进作用最强。该结论揭示了不同氮素形态对土壤理化性质的影响，在后期土壤质量管护过程中，应针对土壤中的限制性因子选择合适的氮素形态。当然，氮素形态对人工草地土壤理化性质的影响还与栽培植物的种类和环境因子等密切相关。
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3.2 氮添加对土壤微生物生物量及生态化学计量特征的影响
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土壤微生物生物量是土壤中最活跃和最易发生变化的部分，对土壤养分的循环和利用起到不可替代的作用[37]。以往研究表明，有诸多因素均对土壤微生物生物量及生态化学计量特征具有显著影响，例如土壤温湿度环境、土壤酸碱度、土壤质地和养分管理等[38]。本研究中，不同氮素处理均显著提高了土壤 MBC、MBN 含量，这与洪丕征等[39] 进行的一项 16 个月的氮添加试验结果相反，其主要原因是在氮添加初期，土壤中的氮含量迅速增加，满足了微生物对氮的需求，有利于微生物对土壤有机质的分解与转化，到后期阶段，氮素被植物吸收利用，导致土壤中的 MBN 含量逐渐降低[40]，而 MBC 和 MBN 含量在氮添加方式下具有协同效应。MBP 是土壤有机磷的核心组成部分，其转化速度快，是植物磷元素的重要来源[41]。本研究中，氮添加对 MBP 含量没有显著影响，这可能与 MBP 对环境及土壤因素的敏感性有关[42]。
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土壤微生物生物量化学计量比决定了微生物活动的方向及有机质养分的释放[43]。本研究中的土壤 MBC/MBN 大于 30，说明土壤微生物的生长受到氮源的限制。本研究通过氮添加试验发现，氮添加一定程度上降低了土壤 MBC/MBN，但变化不显著，这是因为氮添加后土壤碳和氮的协同效应所致。氮添加提高了土壤 MBC/MBP 和 MBN/MBP，高氮水平对 MBN/MBP 具有显著的促进作用。这是由于氮添加增加了 MBC 和 MBN 含量，但并未显著改变 MBP 含量，所以氮添加后土壤 MBC/MBP 和 MBN/MBP 有所增加。此外，本研究中 3 种氮形态对 MBC/MBP 的促进效果表现为 N>U3>A，对 MBC/MBN 的降低效果表现为 A>U3>N，这与不同氮素形态在土壤中的转化速率以及植物的选择性吸收有很大关系。
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3.3 土壤微生物生物量及其生态化学计量特征的影响因素分析
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土壤理化性质驱动土壤养分利用和矿化作用，因此土壤微生物生物量与土壤养分之间存在很强的相关性[44]。Pearson 相关性分析发现，MBC、MBN 含量与土壤 pH 和容重呈显著负相关（P<0.05），与有机碳、硝态氮、有效磷、全氮和全磷呈显著正相关关系（P<0.05），表明土壤微生物生物量可作为土壤肥力的重要评价指标，这与前人研究结果一致[45-46]。本研究试验区土壤 pH 为 9.25，说明土壤盐碱化程度较高，氮添加在提高土壤有机碳、硝态氮、有效磷、全氮、全磷和微生物生物量的同时降低了土壤 pH 和容重。土壤理化性质与 MBC/ MBN 的相关性较小，说明氮添加对土壤碳氮的影响具有协同效应。胡宗达等[47]研究表明，土壤有机碳和全氮与土壤微生物生物量化学计量比的关系不显著；李亚园[48]研究认为，土壤有机碳和全氮与 MBC/MBP 和 MBN/MBP 之间存在显著的负相关关系。而在本研究中，MBC/MBP 和 MBN/MBP 与土壤含水量、有机碳、速效氮、有效磷、全碳和全氮呈显著正相关关系（P<0.05），与土壤容重和 pH 呈显著负相关（P<0.05）（表2），这与陈婕妮等[49] 研究结果一致，说明微生物生物量及其化学计量特征对土壤养分状况具有较强的依赖性。当然，造成上述结论发生分歧的主要原因是试验地点和取样时间差异。此外，RDA 分析表明，除土壤电导率以外，其他土壤理化性质均是影响土壤微生物生物量及其化学计量特性的关键因子，说明土壤微生物生物量及其化学计量特征对土壤养分状况具有较强的依赖性。其中，土壤全氮、pH 和有机碳是影响土壤微生物生物量及化学计量特征的主要土壤理化因子，该结论与李春越等[50]和胡洋等[51]研究结果一致。一方面是因为高寒地区氮限制比较严重，而氮添加直接增加了土壤全氮含量，进一步影响了土壤养分循环和微生物活性；另一方面，土壤 pH 和有机碳已经被证明是影响土壤微生物群落的关键土壤因子[51]。因此，土壤 pH 和有机碳也是影响土壤微生物生物量及化学计量特征的关键土壤理化因子。当然，也有研究报道，土壤全碳是影响土壤微生物生物量及化学计量特征的主要理化因子[49]。造成这种矛盾的原因是多方面的，与海拔、气候、土壤质地和草地类型等密切相关。
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4 结论
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针对 4 龄青海草地早熟禾 + 青海冷地早熟禾 + 青海中华羊茅混播草地的研究得出以下结论：（1） 随着施氮水平的提高，土壤容重和 pH 逐渐降低，土壤全量养分和速效养分均呈增加趋势。相同氮水平时条件下，硝态氮肥对土壤有机碳、有效磷和全氮的促进作用最强，铵态氮肥对土壤铵态氮和全磷的促进作用最强，酰胺态氮肥对土壤容重和 pH 的降低效果最好，对土壤电导率、速效氮和全碳的促进作用最强。（2）不同氮素处理不同程度提高了土壤 MBC、MBN 含量、MBC/MBP 和 MBN/ MBP，降低了 MBC/MBN。对 MBN 的促进效果表现为 A>N>U3，对 MBC 和 MBC/MBP 的促进效果表现为 N>U3>A，对 MBC/MBN 的降低效果表现为 A>U3>N。（3）土壤全氮、pH 和有机碳是影响土壤微生物生物量及化学计量特征的主要土壤理化因子。
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摘要
研究氮添加方式下多年生高寒栽培草地的土壤理化性质和微生物生物量碳（MBC）、微生物生物量氮 （MBN）、微生物生物量磷（MBP）含量及其生态化学计量特征之间的关系，对维持多年生高寒栽培草地的暂稳态具有重要意义。以 2019 年建植的青海草地早熟禾（Poa pratensis Qinghai）+ 青海冷地早熟禾（Poa crymophila Qinghai）+ 青海中华羊茅（Festuca sinensis Qinghai）混播草地为研究对象，设置对照 CK（不施氮）、U1（酰胺态氮 22.5 kg·hm-2）、U2（酰胺态氮 45 kg·hm-2）、U3（酰胺态氮 67.5 kg·hm-2）、A（铵态氮 67.5 kg·hm-2）和 N （硝态氮 67.5 kg·hm-2）6 个处理，对不同处理下的土壤理化性质和微生物生物量及化学计量特征进行分析。结果显示，不同氮素形态和施氮水平对土壤理化性质和微生物生物量具有显著影响。随着施氮水平的提高，土壤容重、 pH 和微生物生物量碳氮比（MBC/MBN）逐渐降低，土壤速效养分、土壤全量养分、MBC、MBN、微生物生物量碳磷比（MBC/MBP）和微生物生物量氮磷比（MBN/MBP）逐渐增加。相同氮素水平下不同氮素形态相比较，铵态氮肥对 MBC/MBN 的降低效果最为明显，相比 CK 降低了 15.61%；硝态氮肥对全氮、MBC、MBC/MBP 和 MBN/ MNP 的促进作用最为明显。冗余分析表明，土壤全氮、pH 和有机碳是影响土壤微生物生物量及化学计量特征的敏感指标。尽管氮沉降促进了多年生高寒栽培草地的土壤养分周转和循环，但给生态环境带来的问题也不容忽视。
Abstract
It is important to study the relationship between soil physicochemical properties and microbial biomass carbon （MBC），microbial biomass nitrogen（MBN），microbial biomass phosphorus（MBP）contents and their ecological stoichiometric characteristics of perennial alpine cultivated grassland under nitrogen addition，in order to maintain the temporary steady state of perennial alpine cultivated grassland. The mixed planting grassland of Poa pratensis Qinghai， Poa crymophila Qinghai and Festuca sinensis Qinghai，which was established in 2019，was used as the research object. CK（no nitrogen application），U1（amide nitrogen 22.5 kg·hm-2），U2（amide nitrogen 45 kg·hm-2），U3（amide nitrogen 67.5 kg·hm-2），A（ammonium nitrogen 67.5 kg·hm-2）and N（nitrate nitrogen 67.5 kg·hm-2）treatments were used to analyze the soil physicochemical properties，microbial biomass，and stoichiometric characteristics under different treatments. The results showed that different nitrogen forms and application levels had a significant impact on soil physicochemical properties and microbial biomass. With the increase of nitrogen application level，soil bulk density，pH， and microbial biomass carbon nitrogen ratio（MBC/MBN）gradually decreased，while soil available nutrients，soil total nutrients，MBC，MBN，microbial biomass carbon phosphorus ratio（MBC/MBP），and microbial biomass nitrogen phosphorus ratio（MBN/MBP）gradually increased. Compared with different nitrogen forms at the same nitrogen level， ammonium nitrogen fertilizer had the most significant effect on reducing MBC/MBN，with a decrease of 15.61% compared to the CK；Nitrate nitrogen fertilizer had the most significant promoting effect on total nitrogen，MBC，MBC/MBP，and MBN/ MNP. Redundancy analysis indicated that soil total nitrogen，pH and organic carbon were the sensitive indicator that affected soil microbial biomass and stoichiometric characteristics. Although nitrogen deposition promoted soil nutrient turnover and cycling in perennial alpine cultivated grasslands，the problems it brought to the ecological environment couldn’t be ignored.