设施蔬菜集约化程度高、收益大，是我国农业的重要组成部分。但其种植指数高、农业投入大、环境封闭，引起土壤质量退化、土壤污染以及对人类健康的负面影响^[1-2]。土壤微生物是表征土壤质量最有潜力的敏感性指标^[3]，细菌作为土壤中最多的微生物物种，其多样性是土壤质量和土壤健康的标志^[4]，长期施肥对土壤细菌多样性及群落结构有重要影响^[4-5]。因此，研究设施菜地土壤细菌群落特征，对于优化设施菜地养分管理有重要意义。设施蔬菜土壤与露天土壤细菌群落显著不同，露地土壤细菌群落组成多样性高于保护地栽培条件下的细菌种群多样性^[6]。多年连续种植导致京郊设施菜地盐分含量显著升高、养分失衡、土壤酸化，导致细菌群落及其功能改变^[7-8]。随着设施菜地种植年限的增加，土壤微生物量和群落结构发生了明显变化，种植 6 年以上土壤微生物活性和群落结构稳定性明显降低，土壤生物质量显著退化^[9]。施肥作为设施蔬菜种植的一个关键农业措施，对土壤微生物组成及功能有显著影响。相关研究表明，施用有机肥处理的土壤中，细菌的优势种群明显不同于单施化肥和不施肥，适量化肥和有机肥配合施用可以显著增加土壤中细菌的丰度^[10]。同等养分投入量下，以有机肥、秸秆氮替代部分化肥氮可提高土壤细菌和真菌丰度，降低古菌丰度，改变土壤优势菌群的组成，增加微生物多样性^[11]。为提高设施菜地土壤肥力，人们向菜地投入大量有机肥。以往研究多涉及化肥、有机替代，有机肥施用对设施土壤细菌的影响少有涉及，不同种类蔬菜土壤细菌多样性不同，青椒土壤细菌多样性最高，黄瓜土壤细菌多样性最低^[12]。本研究以长期定位试验为平台，以农户常规施用有机肥量为基础，采用宏基因组学的研究方法，研究长期单施有机肥及有机无机配施对设施菜地土壤细菌群落特征的影响，为设施菜地制定合理高效的施肥方案提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

试验位于北京市大兴区白庙蔬菜生产基地（39°40′36.95″N，116°35′33.88″E），基地所处地区海拔 13.40～52.00 m，属暖温带半湿润大陆季风气候，年平均气温 11.60℃，年平均降水量 556.40 mm。试验地区土壤类型为褐土，质地为轻壤，地势平坦。土壤容重 1.34 g/cm³、pH 7.90、有机质含量 18.80 g/kg、全氮含量 13.20 g/kg、无机氮含量 44.60 mg/kg、有效磷含量 59.60 mg/kg、速效钾含量 72.00 mg/kg。

1.2 试验设计

本试验为开始于 2007 年的长期定位试验，本研究选取其中化学磷肥和化学钾肥施用量一致而化学氮肥和有机肥施用量不同的 4 个处理，分别为：不施氮肥和有机肥对照处理（D0）；单施有机肥处理（D1）；优化施氮处理即有机肥 + 推荐施氮量 （D2）；优化增量施氮处理即有机肥 +1.5 倍推荐施氮量（D3）。每个处理均设有 3 个重复小区，采用随机区组排列。D2 处理施氮量参考《北京市测土配方施肥技术指南》制定。不同施肥处理养分投入如表1 所示，其中猪粪有机肥含水量为 67%、干基折合氮含量为 2.10%，鸡粪有机肥氮含量为 3.39%、有机质含量为 45.10%，均作为基肥一次性施入； 化学氮肥为尿素；所有处理化学磷肥和化学钾肥分别为过磷酸钙和硫酸钾，均作为基肥一次性施入。小区规格为 3 m×7 m，小区间埋设深度为 100 cm 的塑料隔膜，防止小区间水分和养分的横向迁移。田间栽培管理按当地农户习惯模式进行，有机肥撒施后随翻耕进入土层，磷肥与钾肥在翻耕后撒施整个小区，无机氮肥沿垄沟撒施后随灌溉水淋溶至土里；农药施用按正常农事操作处理。

注：“—”表示无肥料投入。

1.3 土壤样品采集及测定

1.3.1 土壤样品采集

2020 年 8 月 23 日生菜收获后的土壤性质相对较为稳定，于定位试验小区内按对角线均匀布设 10 个取样点，采集 0～30 cm 土层土壤样品，剔除石砾、植物残根等杂物，混匀并过 4 mm 筛备用。用四分法取 20 g 左右鲜土装入无菌离心管中冷冻保存（-80℃），送至奥维森基因科技公司，进行土壤微生物群落结构（宏基因组）分析测定；另外取大约 500 g 土壤样品风干后，过 1 和 0.15 mm 筛用于测定土壤基础理化性质。

1.3.2 土壤基础理化性质的测定

土壤 pH 采用 1 ∶ 2.5 土水比酸度计测定；土壤有机质含量采用重铬酸钾容量法-外加热法测定； 土壤全氮含量采用全自动凯氏定氮仪测定；土壤全磷含量采用高氯酸-浓硫酸法测定；土壤全钾含量采用火焰光度法测定；土壤碱解氮含量采用碱解扩散法测定；土壤有效磷含量采用 0.5 mol/L 碳酸氢钠溶液浸提，钼锑抗比色法测定；土壤速效钾含量采用 1 mol/L 醋酸铵浸提，原子吸收分光光度计测定。

1.3.3 土壤 DNA 提取、PCR 扩增与高通量测序

按照 MoBio Power-SoilDNAIsolationKit 试剂盒（美国 MoBio Laboratories 公司）说明书的操作步骤提取土壤总 DNA。将提取的 DNA 样品用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的质量，采用 NanoDrop 分光光度计（德国 Implen 公司）检测 DNA 的纯度和浓度。提取的 DNA 采用引物 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′ 和 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′进行 PCR 扩增。PCR 程序：95℃ 30 s，40 个循环[95℃ 5 s， 60℃ 40 s（收集荧光）]。为建立 PCR 产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按 95℃ 10 s，60℃ 60 s， 95℃ 15 s 程序进行操作； 并从 60℃ 缓慢加热至 99℃（仪器自动进行，升温速率为 0.05℃/s）。扩增产物用 2% 琼脂糖凝胶电泳检测其质量，再经过 Gene JET Gel Extraction Kit 试剂盒（ 美国 Thermo Scientific 公司）纯化，然后将所得的 PCR 产物进行定量、均一化混匀后进行 Miseq 测序文库的构建，最后利用 Illumina MiSeq 平台测定微生物 DNA 片段的序列。微生物测序和生物信息分析均在北京奥维森基因科技有限公司完成。

1.4 数据处理

使用 Excel2010 进行数据整理；应用 R 4.2.1 进行 Shannon 指数、Invsimpson 指数、Simpson 指数、Chao1 指数、ACE 指数计算，同时进行土壤微生物群落多样性分析、相似性分析（Anosim）、主坐标分析（PCoA）和冗余分析（RDA）等相关分析及相应绘图；采用 Lefse 方法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 土壤基础理化性质

如表2 所示，长期施用不同肥料对设施菜地土壤理化性质影响显著。与不施肥 D0 相比，长期施用有机肥的 3 个处理（D1、D2 和 D3）均显著增加了设施蔬菜土壤的全氮、全磷、碱解氮、速效钾和有机质含量（P<0.05），但 D1、D2、D3 处理间差异不显著；D1 和 D3 处理显著增加了土壤全钾含量（P<0.05），分别增加了 8.2% 和 8.4%，D2 处理与其他处理间的全钾含量差异不显著；相较于 D0， D1、D2 和 D3 处理对设施蔬菜土壤有效磷含量有显著的增加作用（P<0.05），分别增加了 198.81%、 174.98% 和 163.71%，其中 D1 处理的有效磷含量又显著高于 D2 和 D3 处理（P<0.05）。长期施用有机肥或有机无机配施对土壤 pH 有一定的降低作用，但其作用效果并不显著。

注：数据后字母不同表示处理间差异显著（P<0.05）。

2.2 土壤细菌相对丰度

在界分类水平上，生物测序共注释了古菌 （Archaea）、细菌（Bacteria）、真核生物（Eukaryota）、吞噬体（Phage）和病毒（Virus）。从图1 可以看出，细菌为土壤微生物的优势种群，不同处理相对丰度均达 98% 以上。不同处理间细菌相对丰度差异显著，D0 处理细菌相对丰度最低，D2 处理的细菌相对丰度显著高于 D0，D1、D2、D3 处理间土壤细菌丰度差异不显著，表明施肥提高了土壤中细菌的相对丰度，以常规施氮量配施有机肥处理发挥显著的提升作用。

2.3 土壤细菌多样性分析

土壤细菌群落多样性用α多样性指数 （Shannon 指数、Invsimpson 指数、Simpson 指数）和群落丰富度指数（Chao1 指数、ACE 指数）表示。 Shannon 指数的值越大表示物种越丰富；Simpson 指数的值越高说明物种分布不均匀；ACE 指数值越高代表群落内物种越复杂。从表3 可以看出，D0 的 α 多样性指数最低，其次是 D2 和 D3，D1 最高，但不同处理间差异不显著。不同处理丰富度指数表现为D1>D3>D2>D0，且 D1 显著高于 D0，D2 和 D3 差异不显著，表明长期施肥可以增加土壤细菌丰富度，且单施有机肥较有机无机配施更有利于土壤细菌丰富度的增加，不同氮肥用量下土壤细菌丰富度差异不显著。从整体来看，施肥对土壤细菌丰富度的影响大于对多样性的影响。

注：图柱上不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。

注：同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。

2.4 土壤细菌的种群差异分析

为了进一步分析不同施肥模式土壤细菌种群的整体差异，采用 Anosim 相似性分析来进行显著性检验。分析结果显示（图2a），D0、D1、D2、D3 处理间差异显著，且 D0 和 D3 的差异最大。从 PCoA 可以看出（图2b），D1、D2、D3 与 D0 均有较大差异，D1 与 D2 距离最近，D3 距离 D1、D2 较远，表明不同施肥模式下种群差异显著，单施有机肥与推荐施氮下细菌种群较为相似，高量施氮会导致种群差异进一步加大。

注：a. 不同施肥模式土壤细菌种群相似性分析；b. 不同施肥模式土壤细菌种群 PCoA 分析。边框代表上下四分位数间距（IQR），横线代表中位值，上下触须分别代表上下四分位以外的 1.5 倍 IQR 范围。Between 反应组间差异，D0、D1、D2、D3 组分别表示组内差异。箱线图的槽口互相不重合，说明各组中位数有差异。R >0，表示组间差异大于组内差异，说明试验组和对照组之间存在差异；P<0.05，说明试验组和对照组显著差异。

2.5 土壤细菌种群结构分析

2.5.1 土壤细菌门组成分析

设施蔬菜土壤共鉴定出 86 个细菌门，鉴定率达 97.4% 以上。相对丰度前 10 的菌门包括变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、酸杆菌门（Acidobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、浮霉菌门 （Plancto-mycetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、厚壁菌门（Firmicutes）、蓝藻细菌门（Cyanobacteria）、犹微菌门（Verrucomicrobia），累计相对丰度达到了 90% 以上。其中变形菌门和放线菌门为细菌的优势菌群，相对丰度分别为 48.13%～49.73% 和 8.77%～9.16%。从图3 可以看出，不同处理变形菌门相对丰度表现为 D1>D2>D3>D0，放线菌门相对丰度表现为 D0>D1>D3>D2，表明有机肥施用提高了变形菌门相对丰度，降低了放线菌门相对丰度。

2.5.2 物种注释丰度聚类分析

将相对丰度前 30 的细菌门进行聚类分析，可以分为三类（图4）。第一类是在不施肥土壤上相对丰度升高的细菌种群，包括放线菌门（Actinobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、厚壁菌门（Firmicutes）、浮霉菌门（Planctomycetes）、互养菌门（Synergistetes）、装甲菌门（Armatimonadetes）等，其中绿弯菌门、装甲菌门和浮霉菌门差异显著。第二类是在单施有机肥土壤上相对丰度增加的细菌种群，包括硝化螺旋菌门（Nitrospirae）、达达菌门（Dadabacteria）、硝棘菌门（Nitrospinae）、变形菌门（Proteobacteria）和护微菌门（Tectomicrobia），其中硝化螺旋菌门差异显著；第三类是有机无机配施土壤上相对丰度升高的菌群，包括酸杆菌门（Acidobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、蓝藻（Cyanobacteria）、疣微菌门 （Verrucomicrobia）、匿杆菌门（Latescibacteria）和绿菌门（Chlorobi），其中疣微菌门和拟杆菌门差异显著。

注：* 为 Kruskal-Wallis 秩和检验 P<0.05 的相对丰度有差异的细菌门。

2.6 土壤微生物差异物种识别与分析

使用线性判别分析（Lefse）方法从门到种水平分析微生物群落数据，找到组间在丰度上有显著差异的物种（LDA>3，P<0.05），在 D0、D2 和 D3 处理中共找到 27 个显著差异物种，其中 D0 处理有9个、D2 处理有 4 个以及 D3 处理有 14 个 （图5），D1 处理未发现有显著差异的物种。从物种进化分析来看，D0 处理有显著差异的进化分支有 3 个，分别是浮霉菌门（Planctomycetes）→浮霉菌纲（Planctomycetia）→浮霉状菌目（Planctomycetales）→浮霉菌科（Planctomycetaceae）；绿弯菌门 （Chloroflexi）→厌氧绳菌纲（Anaerolineae）→厌氧绳菌目（Anaerolineales）和棒状杆菌门（Candidatus_ Rokubacteria）。D2 处理有显著差异的进化分支有 2 支，分别是噬几丁质菌纲（Chitinophagia）→噬几丁质菌目（Chitinophagales）→噬几丁质菌科（Chitinophagaceae）和鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）。D3 处理有显著差异的分支 3 个，第一个分支为拟杆菌门 （Bacteroidetes）→纤维黏网菌纲（Cytophagia）→噬纤维菌目（Cytophagales）；第二个分支为单歧藻科 （Tolypothrichaceae）→哈沙藻属（Hassallia）；第三个分支为华杆菌科（Sinobacteraceae）→类固醇杆菌属（Steroidobacter）。以上结果表明，长期施用有机肥以及与适量的无机氮肥配施能够有效减少设施菜地土壤微生物群落物种差异数，而过量施氮则会增加这一数目。

2.7 土壤理化性质与细菌群落结构组成的关系

通过冗余分析（RDA）显示，土壤环境因子可以解释细菌群落结构 83.66% 的差异，第一排序轴的解释量为 51.45%，第二排序轴的解释量为 32.21%，土壤 pH 及全磷、全钾和碱解氮含量是影响细菌群落结构的重要因子（图6a）。为进一步优选出与土壤环境因子具有响应作用的细菌，利用 Pearson 相关性分析探究土壤细菌群落门水平优势物种与土壤环境因子的关系（图6b）。结果表明，拟杆菌门（Bacteroidetes） 与 pH 呈显著负相关（P<0.05），与养分含量呈正相关；绿弯菌门（Chloroflexi）与土壤 pH 呈正相关，与土壤养分含量呈负相关，尤其是与全磷、全钾、碱解氮含量呈显著负相关（P<0.05）；厚壁菌门 （Firmicutes）与全钾含量呈显著负相关（P<0.05）。

注：a）：基于物种 Lefse 分析，展示了 LDA Score 大于 3.0 有差异的物种，即具有统计学差异的 biomaker。展现不同组中丰度有显著差异的物种，柱状图的长度代表显著差异物种的影响大小。b）：物种 Lefse 进化分支图，由内至外辐射的圆圈代表了由门至属（或种）的分类级别。在不同分类级别上的每个小圆圈代表该水平下的一个分类，小圆圈直径大小与相对丰度大小呈正相关。着色原则：无显著差异的物种统一着色为黄色或未显示，差异物种生物标志物跟随组进行着色。图中英文字母表示的物种名称在右侧图例中进行展示。

注：a. 冗余分析；b. 相关性分析，红色和蓝色分别表示正相关和负相关，显著相关用“*”标注（P<0.05）。 SOM、TN、TP、TK、AN、AP、AK 分别表示有机质、全氮、全磷、全钾、碱解氮、有效磷、速效钾。

3 讨论

3.1 不同施肥模式对土壤细菌丰度及多样性的影响

土壤微生物是农田生态系统的重要组成部分，施肥和肥料类型与土壤微生物的数量、组成及多样性的差异紧密相关^[13-14]。大田作物研究显示，单施化肥模式可降低玉米土壤细菌丰度，增加真菌丰度及多样性^[15]。有机肥与化肥配施相对于单施化肥处理增加了土壤细菌的丰度^[11]，提高了土壤细菌多样性及丰富度^[16-17]，不同化肥减量与有机肥配施处理之间无显著差异^[18]。本研究显示，尽管与不施肥相比，单施有机肥或有机无机配施均提高了细菌丰度及丰富度，但其对土壤细菌 α 多样性影响不显著；有机无机配施与单施有机肥相比，土壤细菌丰度差异不显著，表明有机无机配施对提升土壤细菌丰度的作用主要是由有机肥作用引起的。大田作物潮土上的研究认为，长期施用有机肥显著提高了土壤细菌丰度，土壤细菌多样性指数（Shannon）和丰富度指数（Chao1）均在单施有机肥的处理下最高^[4]；有机肥 / 秸秆替代化肥模式提高土壤细菌和真菌丰度，降低土壤古菌丰度，影响土壤优势菌群组成，增加微生物多样性^[5]。已有研究表明，黑土细菌对有机肥的响应较强，而真菌对化肥更为敏感。长期施用化肥会刺激土壤中嗜酸细菌和真菌的生长，而有机无机肥配施可提高土壤微生物群落多样性，刺激有益菌的生长。

3.2 不同施肥模式对土壤细菌群落结构的影响

在门水平上定义的微生物分类群可以揭示微生物群的生态一致性^[19]。本研究显示，设施蔬菜土壤共鉴定出 86 个细菌门，其中变形菌门和放线菌门为细菌优势种群，相对丰度丰度分别为 48.13%～49.73% 和 8.77%～9.16%，这与以往的研究相一致^[11，20]。有机肥对细菌种群有显著影响，有机肥施用提高了变形菌门相对丰度，降低了放线菌门相对丰度。这是由于变形菌门是富营养菌群，可在营养丰富的土壤环境中迅速繁殖，而放线菌门和绿弯菌门作为土壤中耐胁迫能力较强的微生物，对不利环境适应性强，适宜在养分较低的环境中繁殖^[21-23]。无有机肥无氮肥处理土壤上绿弯菌门、装甲菌门、浮霉菌门相对丰度显著提升，绿弯菌具有对有机碳、有机硫以及环烷烃和芳香族化合物等难降解化合物的代谢潜力^[24]；有机肥处理土壤硝化螺旋菌门相对丰度显著提升。氮与有机肥共同作用下，疣微菌门、拟杆菌门相对丰度显著提升。拟杆菌在多糖类有机物质分解过程中发挥着非常重要的作用^[25]。疣微菌门细菌参与多种物质循环，如参与异化硫循环和无机氮循环等过程，可能全面参与全球甲烷循环，影响着元素循环的动态平衡^[26]。

3.3 不同施肥模式下土壤细菌群落结构与土壤理化性质的关系

土壤理化性质显著影响土壤微生物群落结构及多样性^[27]。本研究的冗余分析及相关性分析结果表明，pH 及全磷、全钾和碱解氮含量是影响设施菜地土壤细菌群落结构的主要因素。土壤 pH 可通过影响碳、氮等元素的利用率而改变土壤微生物群落结构^[13-14]。此外，pH 通过影响土壤微生物的生理代谢，改变细菌群落间的竞争关系或抑制非适应性微生物生长，从而影响土壤细菌群落结构组成。土壤全磷和碱解氮含量为土壤细菌供应重要的能量来源，通过影响土壤细菌的生长繁殖改变土壤细菌的群落结构。本研究表明，在设施菜地中土壤拟杆菌门与 pH 呈显著负相关（P<0.05），与养分含量呈正相关；绿弯菌门与土壤养分含量呈负相关，尤其与全磷、全钾、碱解氮含量呈显著负相关（P<0.05）；厚壁菌门与全钾含量呈显著负相关（P<0.05）。土壤有机质是导致不同类型土壤微生物群落差异的驱动因素^[28]。有机肥的施用增加了土壤全氮、全磷、速效钾和有机质的含量^[18]，为土壤微生物的生长提供丰富的养分及碳源底物^[29-30]。吴宪等^[31]研究表明潮土中的土壤细菌和真菌群落结构变化受 pH 及全磷和全氮含量等因子的驱动，土壤 pH 和有效钾含量分别是调控细菌和真菌群落结构的重要影响因素^[17]。由此认为，在设施农业中，可通过调节土壤 pH 及全磷和全钾含量等理化性质，从而实现对土壤细菌群落结构的调整。

4 结论

长期施肥对设施蔬菜土壤的全氮、全磷、全钾、碱解氮、有效磷、速效钾和有机质含量均有显著的提升作用，其中单施有机肥处理对设施蔬菜土壤有效磷含量的提升效果又显著高于有机无机配施的 2 个处理，但各处理均没有显著改变土壤的 pH。长期施肥对设施菜地土壤细菌丰度的影响大于对多样性的影响，长期施用有机肥能够显著提高设施菜地土壤细菌的相对丰度（P<0.05），有机无机配施会进一步提升土壤细菌的丰度，但过量施用无机肥将降低土壤细菌丰富度。有机肥施用提高了变形菌门相对丰度，降低了放线菌门相对丰度。单施有机肥处理土壤硝化螺旋菌门相对丰度显著提升（P<0.05）；在有机肥和无机肥的共同作用下，疣微菌门和拟杆菌门相对丰度显著提升（P<0.05）。相关性分析表明，土壤 pH 及全磷、全钾和碱解氮含量是影响设施菜地土壤细菌群落组成的主要环境因子。长期施用有机肥能够提高设施菜地土壤细菌丰度、改善设施菜地土壤细菌群落结构。在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的施肥方法，以调节设施菜地土壤微生物的结构，促进农业绿色可持续发展。

参考文献