磷是南方林地和农田土壤生产力的重要限制性因子，这与成土母质和气候等因素密切相关^[1-2]。园林绿地土壤也存在类似问题，根据前期对广州市园林绿地土壤质量的调查结果，发现约 29% 的土壤样本有效磷含量低于 19 mg/kg，处在较低水平（数据未发表）。磷主要参与植物细胞内核酸和磷脂类物质的合成，植物缺磷会导致植株矮小、分蘖或分枝减少、叶片暗绿等症状^[3-4]。植物吸收的无机磷主要以一价正磷酸根离子（${\mathrm{H}}_2{\mathrm{P}\mathrm{O}}_4^{-}$）的形态吸收，同时也吸收少量的二价正磷酸根离子 （${\mathrm{H}}_2{\mathrm{P}\mathrm{O}}_4^{-}$），这 2 种形态的磷具有很高的水溶性，南方部分地区春、夏季雨水偏多，过量施用磷肥后容易引发周围水体环境的富营养化^[5-6]。另外，磷肥的大量使用会进一步加剧土壤板结。因此，在当前大力提倡生态文明建设和环境友好型绿地营建的背景下，如何提升土壤磷元素的利用效率成为国内外学者的研究热点^[7-8]。解磷菌能通过提升土壤有效磷含量来促进植物生长，林地和农田土壤解磷菌的筛选和应用已开展了较多研究，部分已经进入生产和应用，但关于园林绿地土壤解磷菌的筛选和应用鲜见报道^[9-11]。

园林绿地土壤与农田和林地土壤在受人为扰动和管理方式方面存在较大差别，园林绿地土壤多为工程回填土壤，如来自建筑地基、道路和地铁施工挖掘等，部分来自于地下深层，为发育不完全的生土，有机质和养分贫乏，物理结构差^[12]。其次，行人踩踏和车辆碾压会导致土壤紧实，透水透气性变差^[13-14]。最后，园林绿地土壤容易受到建筑垃圾（水泥、石灰等）的污染，呈现碱化趋势^[13]。有研究表明，土壤 pH、有机质以及透气性是影响土壤微生物多样性的关键因素，其影响程度要高于土壤湿度、质地、养分和温度^[15]。另外，人类活动强度和城市绿地土壤微生物多样性存在很强的关联性^[16-17]。因此，可以推测园林绿地土壤解磷菌可能与自然林地、农田等土壤中的解磷菌在多样性上存在差异，有必要针对园林绿地土壤开展解磷菌的相关研究工作。基于此，本研究以广州市园林绿地土壤为研究对象，分析其解磷菌的菌属和解磷能力，并通过栽培试验论证优势解磷菌的促生效果，相关成果可为适用于城市绿地土壤的解磷菌剂开发和利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

园林绿地土壤采集自广州市中心城区道路绿化带，其基本理化性质如表1 所示，土壤整体偏碱性 （pH 值 8.32），容重偏高（1.53 g/cm³），且有机质和速效养分匮乏，具有典型的绿地土壤特征；采用蒙金娜（PVK）固体和液体培养基（以磷酸钙为唯一磷源，下同）进行解磷菌筛选和解磷能力测定^[18]；用细菌 DNA 提取试剂盒提取细菌基因组；矮牵牛“梦幻玫红”穴盘苗（苗高 3 cm 左右）、育苗盆、蛭石 （1～3 mm）、陶粒（8～14 mm）、石英砂（1～2 mm） 以及霍格兰磷缺省培养基，用于开展栽培试验。

注：表中数据为平均值 ± 标准差。

1.2 试验方法

1.2.1 土壤解磷菌筛选和鉴定

称取 0.2 g 园林绿地土壤样本加入 15 mL 离心管中，加入 10 mL 无菌水后充分振荡悬浮，取 1 mL 土壤悬液并用无菌水稀释至 10 mL，按照此法依次稀释至 10^-3、10^-4、10^-5 和 10^-6。取 100 μL 不同稀释浓度的土壤悬液涂布到含 PVK 固体培养基的 12 cm× 12 cm 方形培养皿上，平均每平方厘米菌落数不超过 1 个为有效，挑出能产生解磷圈的菌株，进行 3 次转板纯化后扩繁并提取基因组。利用引物对 27F/1492R 扩增获得细菌 16S rDNA 片段，测序后提交在线数据库（https: //blast .ncbi .nlm .nih .gov/ Blast.）进行分析比对。

1.2.2 解磷能力测定

挑取解磷菌单菌落，接种到 3 mL 的 PVK 液体培养基中，28℃培养至 OD₆₀₀=0.8，取 1 mL 接种到 100 mL 的 PVK 液体培养基中，连续培养 4 d。取 5 mL 解磷菌培养物，高速离心后取上清液，用钼锑抗比色法测定上清液中有效磷含量。

1.2.3 促生效果分析

将供试解磷菌接种到 100 mL 的 PVK 液体培养基中，连续培养 4 d（同上）后用作矮牵牛处理。

将蛭石和陶粒按照 3∶1 的体积比混匀，用磷缺省霍格兰营养液浸润后分装到育苗盆中。挑选长势一致的矮牵牛幼苗移栽到育苗盆中，在表面覆盖约 5 mm 厚的石英砂。定植 1 周后淋施解磷菌剂处理，即将对应的 10 mL 菌剂淋施到矮牵牛幼苗根部，未接种解磷菌的 PVK 培养基设为阴性对照，每隔 1 周处理 1 次，连续处理 3 次。每隔 1 周采集植株的株高、冠幅、SPAD、叶片和花芽数量，连续统计 5周。第 6 周进行破坏性取样，采集地上、地下部分干重、根体积以及组织磷含量。

1.2.4 数据分析

利用 MEGA 5.1 构建解磷菌系统发育树，利用 Excel2016 和 SPSS 16.0 进行数据整理、图表制作和显著性差异分析。本文中无特别说明的情况下，图中不同小写字母表示不同处理间在 P≤0.05 水平差异显著。

2 结果与分析

2.1 解磷菌分类鉴定和解磷特性

部分解磷菌在 PVK 平板上的解磷情况如图1 所示，从平板上共挑出 29 株能产生明显解磷圈的解磷细菌，依次命名为 PSB1～29，分别扩增获得其 16S rDNA 片段并构建系统发育树（图2）。结果表明，分离出来的解磷菌主要归属于 Kluyvera、Pantoea、Enterobacter、Burkholderia、Paraburkholderia和 Ochrobactrum 属。其中 Ochrobactrum 属的解磷菌鲜见报道。分析各菌株解磷能力和对应培养基 pH 的相关关系发现，二者存在良好的幂函数关系（y= 7.426x^-0.08；R²=0.8775），整体趋势表现为菌株解磷能力越强，其对应的培养基 pH 越低（图3）。所有解磷菌株均会导致培养基不同程度的酸化，整体 pH 分布在 6.38～4.42 之间，较培养基初始 pH 的最低和最大降幅分别为 0.62 和 2.58（图3）。29 株解磷菌的解磷能力分布在 8.67～632.62 mg/L 区间，解磷能力超过 500 mg/L 的菌株仅有 3 株，14 株菌的解磷能力分布在 150～500 mg/L 之间，12 株菌的解磷能力分布在 150 mg/L 以下（图3）。另外，当培养基的 pH 从 5.0 左右继续下降时，对应菌株的解磷能力则开始大幅度上升（图3）。

2.2 优势解磷菌对矮牵牛的促生效果

以解磷能力超过 500 mg/L 的 3 株解磷菌（PSB1、 PSB2 和 PSB6）为研究对象，研究其对矮牵牛的促生效果，并筛选出具有开发潜力的解磷优势菌株，试验设置如表2 所示。栽培试验结果表明，在第 4 周时 T2 菌剂处理组的株高要显著高于对照（CK） （P≤0.05），各菌株处理组间的株高无显著差异。在其他监测时间节点上，CK 和各菌株处理组间的株高均无显著差异，即菌剂处理对矮牵牛株高未产生显著影响（图4）。分析菌剂处理对叶片 SPAD 的影响发现，对照和处理组的 SPAD 在初始 1 周无显著差异； 在第 2 至第 4 周，各组别间的 SPAD 陆续出现差异，但无明显规律可循；至第 5 周，各组别间的 SPAD 无显著差异（图5）。

对冠幅、叶量和花芽数量 3 个指标的统计分析发现，解磷菌剂处理均能显著提高矮牵牛的冠幅、叶量和花芽数量，且随栽培时间延长，菌剂处理组和 CK 的各项指标差值开始增大（图6～8）。至第 5 周，T2 菌剂处理组的冠幅平均值为 19.38 cm，较 CK 提升幅度最大（P≤0.05），达到 50.58%，各菌剂处理组间冠幅无显著差异（图6）；T3 菌剂处理组叶量均值为 39 片/株，较 CK 提升幅度最大，达到 96.25%，各菌剂处理组间叶量也无显著差异（图7）；T2 菌剂处理组花芽数量均值较 CK 提升幅度最大，达到 137.98%，且 T2 菌剂处理组花芽数量要显著高于 T3 处理组（P≤0.05）（图8）。

注：同列数据后不同的小写字母表示数据间有显著性差异（Duncan 检验，P≤0.05）。

注：柱状图上不同的小写字母表示数据间有显著性差异（Duncan 检验，P≤0.05）。下同。

破坏性取样后，分析解磷菌处理对矮牵牛干重、根体积以及地上、地下部分磷含量的影响 （图9、10）。结果表明，菌剂处理能显著增加矮牵牛的干重（P≤0.05），T2 菌剂处理组干重均值较 CK 增幅最大，达到 101.73%，增幅较低的 T1 菌剂处理组也较 CK 高出 82.04%（图9）；T3 菌剂处理组对根体积具有显著促进作用，其根体积达到 9.00 mL，较 CK 提升 44.00%（P≤0.05），CK 和 T1、 T2 菌剂处理组之间无显著差异（图9）。

最后对矮牵牛地上和地下部分磷含量进行统计分析发现，T2 和 T3 菌剂处理能显著提升矮牵牛茎叶和根部磷含量，且 T3 菌剂处理组较 CK 增幅最大，分别达到 504.52% 和 157.94%，T1 菌剂处理组较 CK 在茎叶和根部磷含量均值上有所增加，但二者差异不显著（图10）。总体来看，T2 和 T3 菌剂处理在提升矮牵牛组织磷含量方面的表现要优于 T1 菌剂处理组。

3 讨论

3.1 绿地土壤解磷菌的解磷特性和分类特征

多数研究表明，解磷菌通过分泌小分子有机酸的方式来降低培养基 pH，从而进一步溶解无机磷源，不同解磷菌有机酸的分泌量和种类存在差异，导致其解磷能力也产生差异。也有报道解磷菌可以通过呼吸作用产生碳酸以及 ${\mathrm{N}\mathrm{H}}_4^{+}$/H⁺ 交换机制来降低环境 pH^[19]。本研究从土壤中筛选出来 29 株解磷菌，其培养过程中均发生培养基酸化现象，且解磷能力和培养基 pH 存在负相关，进一步表明本次从绿地土壤中筛选的解磷菌可能主要通过酸化培养基来溶解难溶无机磷源。赵小蓉等^[20]在研究微生物溶解磷矿粉能力与 pH 关系的过程中发现，不同真菌的解磷能力与其培养介质 pH 存在显著的负相关，对细菌而言，有一小类群解磷细菌的培养介质并不发生酸化，余下的多数细菌解磷能力和 pH 也显著负相关。菌株分类表明，29 株解磷菌分属 Kluyvera、Pantoea、Enterobacter、Burkholderia、 Paraburkholderia 和 Ochrobactrum 属。其中，Ochrobactrum 属的解磷菌少见报道，其对应的 PSB 15 和 PSB 17 菌解磷能力分别为 338.64 和 250.24 mg/L，该属菌株的发现进一步丰富了解磷菌的种类。其他几个属的解磷菌在林地和农田等类型土壤中均有发现，不同土壤环境中解磷菌的优势菌属存在较大差异，如 Janati 等^[21]马雪松等^[22]、王君等^[23]对杨树人工林土壤解磷微生物类群分析发现 Bacillus 和 Pseudomonas 为优势菌群，本试验在绿地土壤中未获得这 2 个属的解磷菌。

3.2 优势解磷菌对矮牵牛生长的影响

栽培试验表明，3 个菌株均表现出对矮牵牛的促生作用，能显著提升矮牵牛冠幅、叶量、花芽数量这 3 个重要观赏指标，表明解磷菌在园林绿地上有较好的开发和应用潜力，可用来提升园林植物长势和景观效果。同时，利用解磷菌剂替代部分化学肥料也符合当前提倡的生态园林建设要求。研究发现，解磷菌添加对矮牵牛株高影响不大。矮牵牛的茎干直立性差，随栽培时间延长，茎干由直立状态转化为匍匐状态，茎干的延伸进而表现在冠幅的增长上，这可能是解磷菌提升矮牵牛冠幅而不影响株高的原因。另外，解磷菌处理对矮牵牛的叶片 SPAD 无显著促进作用，SPAD 主要反映叶片的叶绿素含量，其与植物氮含量密切相关^[15]，解磷菌主要通过提升环境有效磷水平来发挥促生作用，推测其可能不会直接影响叶片的 SPAD 水平。然而，在对玉米、月季等植物的研究过程中发现 SPAD 随环境磷水平的增加而提升，表明不同植物 SPAD 对磷供给水平的反应可能存在差异^[24-25]。矮牵牛破坏性采样后的相关指标分析发现，3 株解磷菌能显著提升干重，但只有 T2 和 T3 菌能提升矮牵牛组织磷含量，这可能与 T2 和T3 菌株较 T1 菌株具有更强的解磷能力有关，3 个菌株在解磷能力上面的表现为 T3≈T2>T1。薛应钰等^[26]通过诱变技术增强了菌株的解磷能力，使得其具有了更好的促生效果。解磷菌接种后在植物根际的定殖情况是影响其促生效果的另一重要因素，有研究表明，解磷菌 Penicillium brocae 能够在矮牵牛根部定殖，并持续发挥解磷作用^[18]。本试验后续可通过引入分子标记（绿色荧光或β葡萄糖苷酸酶等）来观察 3 株解磷菌在矮牵牛根际的定殖情况，进一步评价菌株的开发和应用潜力。

4 结论

从园林绿地土壤中共筛选出 29 株解磷菌，其解磷能力分布在 8.67～632.62 mg/L 之间，对应培养基的 pH 分布在 6.38～4.42 之间，相关性分析发现这些菌株的解磷能力和培养基的 pH 呈负相关 （R²=0.8775），表明解磷菌酸化培养基的能力在一定程度上能反映其解磷能力。从中挑选出解磷能力较强（>500 mg/L）的 3 株解磷菌开展栽培试验，试验结果表明，3 株供试解磷菌能显著提升矮牵牛的冠幅、叶量、花芽数量和干重，对苗的株高和叶片 SPAD 无显著影响。T3 菌株能显著提升矮牵牛的根体积，T2 和 T3 菌株均能提升矮牵牛的地上和地下部分组织磷含量。总体来看，T3 菌株在对矮牵牛的促生效果方面表现最佳，T2 菌株略次之，T1 菌株表现相对较差。

参考文献