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氧化亚氮（N2O）是一种温室气体，对于全球变暖和平流层臭氧消耗具有重要影响。尽管 N2O 在大气中的含量远低于二氧化碳（CO2），但其百年增温潜势约是 CO2 的 298 倍[1-2]。农业土壤是 N2O 的主要来源之一[3]。氮肥使用量的增加是导致农业土壤 N2O 排放量增加的原因之一。当施用含氮肥料时，土壤中的无机氮含量提高，无机氮被土壤微生物进一步转化为 N2O[4]。目前农田土壤 N2O 的减排措施主要有施肥管理（施肥时间与方式、施肥类型、施肥量等）、种植模式、添加生物质炭、使用硝化抑制剂和接种具有 N2O 减排效应的微生物等[4-5]。近年来，微生物肥料因可以同时促进作物生长和减少农田土壤 N2O 排放而备受关注。
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植物根际促生菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）是微生物肥料菌种的主要来源，具有促进植物生长、改善土壤微生物群落、防治病虫害等多种功能[6]。最新研究发现，某些 PGPR 可以减少 N2O 排放。如 Calvo 等[7]在实验室培养条件下将 4 种芽孢杆菌（Bacillus spp.）混合培养后作为接种剂添加到施肥后的土壤中，减少了土壤中 N2O 排放并促进玉米的生长和氮素的吸收。Gao 等[8]通过温室盆栽试验发现，在接种的 3 株固氮螺菌（Azospirillum sp.）和 4 株草螺菌（Herbaspirillum sp.）中，5 株菌可促进牧草生长和对氮、磷养分的吸收，并减少牧草土壤 N2O 排放。在温室盆栽条件下，接种 4 株 PGPR [白色芽孢杆菌（Bacillus albus Lv5A）、枯草芽孢杆菌枯草亚种（Bacillus subtilis sp. subtilis NRCB002）、施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri NRCB010）和贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis NRCB026）]均减少土壤 N2O 排放，其中 NRCB010 和 NRCB026 增加番茄地上部干重且减排效果较好[9]；土壤微宇宙和田间原位微宇宙试验发现，接种 NRCB010 和 NRCB026 具有减少土壤 N2O 排放的效应[9]。然而，NRCB010 和 NRCB026 减少土壤 N2O 排放机制尚不清楚。
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PGPR 功能的发挥受到多种环境因素的影响。目前接种微生物减少 N2O 排放直接机制是通过人为向土壤中接种的具有还原 N2O 功能的微生物在利用氮源进行代谢活动过程中合成有活性的 N2O 还原酶，将 N2O 还原为 N2，从而实现农业土壤 N2O 的减排[4]。Akiyama 等[10]在田间试验条件下，向大豆根际土壤中接种含有 nosZ 基因的慢生型根瘤菌 （Bradyrhizobium diazoefficiens），菌群显著增加了 nosZ基因的表达；同时，略有降低 nirK 基因的表达。间接机制是人为向土壤接种的非 N2O 还原细菌通过改变土壤 N2O 还原细菌群落的组成和丰度以及代谢活性，从而实现减少农业土壤 N2O 的排放。在温室盆栽条件下，与对照相比，在茶园土壤中接种木霉菌（Trichoderma viride EBL13）增加了土壤 α 多样性和 nosZ 基因的丰度，从而减少了土壤 N2O 的排放[11]。 Wu 等[12]接种 Bacillus amyloliquefaciens EBL11 至施肥后的酸性土壤中，通过 qPCR 技术对氮循环基因定量分析发现，接种 B. amyloliquefaciens EBL11 后降低 AOB 丰度，显著增加 nosZ 基因丰度，这表明 B. amyloliquefaciens EBL11 可能通过降低土壤中 AOB 丰度减少硝化作用下 N2O 的产生或增加 nosZ 基因丰度，提高 N2O 还原菌活性，增强 N2O 还原过程，从而减少 N2O 排放。同时，也有研究表明，目前已知的唯一汇是具有 nosZ 基因的反硝化细菌将 N2O 还原为 N2 [13-14]。
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玉米是我国重要的粮食和饲料作物，种植面积广，在中国农业系统近 40 年温室气体排放核算中，农田土壤 N2O 排放系数位居主要谷物首位，为 2.532 kg/hm2[15]。因此，本研究以玉米为供试作物，通过温室盆栽试验，开展 NRCB010 和 NRCB026 对玉米生长和土壤 N2O 排放的影响研究，探究土壤细菌群落在调控 N2O 排放中的作用以及减少玉米土壤 N2O 排放的主控因子。
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1 材料与方法
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1.1 供试材料
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供试菌种为施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）NRCB010 和贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）NRCB026，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为 CGMCCNO.19067 和 CGMCCNO.22841。供试土壤采集于江苏省宜兴市（31°18′N，119°55′E），为小麦-水稻、小麦-玉米轮作土，避光自然风干后过 2 mm 筛备用。供试土壤理化性质：pH 4.3，有机质 5.62 mg/kg，有效磷86.9 mg/kg，铵态氮 165.9 mg/ kg，硝态氮 100.3 mg/kg。供试玉米品种为郑单 958，购买于安徽省合肥市和丰有限公司。供试试剂：霍格兰营养液（霍格兰营养液 1.26 g/L、钙盐 0.945 g/L，pH 5.8，溶剂为去离子水）购买于青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，钙盐购买于国药集团化学试剂有限公司，LB 培养液（胰蛋白胨 10 g/L、酵母提取物 5 g/L、氯化钠 10 g/L，pH 7.0，溶剂为去离子水）、胰蛋白胨和酵母提取物购买于 Thermo 公司，氯化钠购买于国药集团化学试剂有限公司。
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1.2 菌悬液的制备
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将 NRCB010 和 NRCB026 接种至 LB 培养液中，在 30℃的摇床中 200 r/min 振荡培养 12 h。将菌液以 6000 r/min 离心后丢弃上清液，用 1/10 霍格兰营养液重新悬浮，重复 2 次，调整菌体浓度至 OD600nm 约为 1.0，再稀释 10 倍后备用。
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1.3 温室盆栽试验设计
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温室盆栽试验设置 3 个处理，分别为对照 （1/10 霍格兰营养液）、NRCB010（接种 1/10 霍格兰营养液重悬的 NRCB010） 和 NRCB026（ 接种 1/10 霍格兰营养液重悬的 NRCB026）；每个处理 6 个重复。
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向风干土壤中施加 0.4 g/kg 有机肥（史丹利 ®， N+P2O5+K2O=5%，有机质 45%） 和 6 g/kg 复合肥 （福来顺 ®，N-P2O5-K2O=15∶15∶15），充分混合均匀。称取 500 g 风干土-肥料混合物至培养钵（直径 11.5 cm、高 14 cm）中。玉米种子于 2.5% 次氯酸钠消毒 10 min，用自来水清洗种子数次，消毒后种子置于 24℃培养箱中催芽 3 d 后，选取出芽一致的种子进行播种，每盆 2 株幼苗。NRCB010 和 NRCB026 浇入 20 mL 菌悬液，对照浇入等量的 1/10 霍格兰营养液。培养条件为光照期 14 h、黑暗期 10 h；光照强度 5000 lx 的温室条件下生长。常规管理[11]。
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1.4 植物样品与 N2O 气体采集与测定
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接种菌液的第 17 d（三叶期）收获玉米幼苗。测定株高、茎粗、SPAD 值，称量鲜重和干重。
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在接种菌液的第 1、3、6、8、12 和 17 d 采集 N2O 气体样品。将种有玉米植株的培养盆置于采样箱（15.5 cm×15.5 cm×25.7 cm）中，密封 0、15 和 30 min 采集 30 mL 气样至真空瓶中。使用带有电子捕获检测器的气相色谱仪（Agilent 7890B）进行测量。根据 N2O 通量和测量间隔时间计算 N2O 累积排放量[9]。
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1.5 土壤样品采集与分析
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在接种菌液的第 3 d（即 N2O 排放高峰期，以下均简称高峰期）和第 17 d（收获期）采集玉米根际土壤，每个样品各采集 2 份。其中，一份储存于-4℃，用于土壤理化性质分析；另一份储藏于-80℃，用于提取土壤 DNA。土壤的 pH、有机质、有效磷、硝态氮和铵态氮参照鲁如坤[16]的方法进行测定。
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1.6 DNA 提取、PCR 扩增和测序
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称取 0.5 g 土壤样品，按 HiPure Soil DNA Mini Kit （Magen，China）土壤试剂盒操作手册进行土壤 DNA 提取。使用超微量紫外可见分光光度计 NanoDrop NC2000（Thermo，CA，USA）测定 DNA 样品浓度。使用引物 338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′） 和 806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）[17] 进行细菌的 16S rRNA V3～V4 区的 PCR 扩增，在基迪奥生物科技有限公司的 Illumina nova6000 平台 （Illumina Inc.，CA，USA）上进行测序。
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1.7 数据处理与分析
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使用 VSEARCH 2.21.1[18] 合并双端序列，检测和去除质量分数低于 20 的合并序列和嵌合体序列；将过滤后得到 1097113 条高质量序列根据 97% 的相似性聚类到操作分类单位（operational taxonomicunits，OTUs）中，共获得 2625 个 OTUs，即微生物丰度表。通过 VSEARCH 的 userach_global 功能在SILVA（silva v138.1）数据库中查询代表性序列对细菌OTU 进行分类[18]，使用SINTAX 给 OTU 添加物种注释[18]，获得物种分类表。使用 R 4.2.1 的 vegan 包进行主成分分析（PCA）和冗余分析（RDA）、adonis 包进行置换多元方差分析（PERMANOVA）、tidyverse 包进行微生物组间差异分析（STAMP），并用 ggplot 包绘图。在网站平台（https：//huttenhower.sph.harvard.edu/lefse/）进行线性判别分析（LEfSe）。使用 FAPROTAX 1.2.7（http：// www.loucalab.com/archive/FAPROTAX）预测样本功能丰度，并使用 R 4.2.1 中的 Heatmap 包绘制热图。
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使用 SPSS 26.0 对土壤理化性质及生物量等指标进行单因素方差分析和邓肯检验显著差异性，通过 t 检验分析相同处理的土壤理化性质在不同时间上的差异。序列数据上传到 NCBI，SRA 的生物项目编号 PRJNA1004773。
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2 结果与分析
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2.1 PGPR 对玉米生长的影响
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接种NRCB010 和 NRCB026 促进玉米的生长 （图1）。与对照相比，接种 NRCB010 和 NRCB026 显著增加玉米的干重，分别增加 41% 和 35%（图1f）；提高玉米的株高（图1a）；对玉米的茎粗、SPAD 值和叶片数没有显著影响（图1b、c、d）。
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图1 施氏假单胞菌 NRCB010 和贝莱斯芽孢杆菌 NRCB026 对玉米幼苗生长的影响
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注：不同小写字母表示处理间在 0.05 水平上差异显著。
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接种 NRCB010 和 NRCB026 减少土壤 N2O 排放 （图2）。与对照相比，在处理第 3 和 6 d 时，接种 NRCB010 和 NRCB026 的土壤 N2O 排放通量低于对照（图2a）；在收获期时，分别降低土壤 N2O 累积排放量 54.6% 和 21.6%（图2b）。
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图2 施氏假单胞菌 NRCB010 和贝莱斯芽孢杆菌 NRCB026 对玉米土壤 N2O 排放通量和累积排放量的影响
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注：同一时间，小写字母不同表示处理间在 0.05 上差异显著。图7 同。
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2.2 NRCB010 和 NRCB026 对玉米土壤理化性质的影响
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与对照相比，在高峰期和收获期时，NRCB010 和 NRCB026 均显著增加土壤 pH。与对照相比，收获期时，接种 NRCB026 的土壤硝态氮含量显著低于对照。NRCB010 和 NRCB026 对土壤中有效磷含量无显著影响。同一种处理在收获期的 pH 值均显著高于高峰期（表1）。
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注：同一时间，同一列中小写字母不同表示各处理间在 0.05 水平下差异显著，大写字母不同表示同一处理不同时间在 0.05 水平下差异显著。
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2.3 NRCB010 和 NRCB026 对土壤细菌群落 Alpha 多样性的影响
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在高峰期和收获期，所有处理对土壤细菌 OTU 数均无显著影响。在高峰期，接种 NRCB010 和 NRCB026 的土壤 Shannon 指数显著高于对照；在收获期，接种 NRCB010 的土壤 Shannon 指数显著高于对照（表2）。
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在所有处理中，土壤细菌群落组成在门和属水平上相似，但丰度不同。丰度占比排名前 5 的群落组成为：变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、酸杆菌门（Acidobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）；相对丰度分别为45.29%～69.14%、6.61%～19.68%、 5.0%～13.47%、6.38%～8.26%、3.43%～9.26% （图3a）。与对照相比，在高峰期，接种 NRCB010 和 NRCB026 的土壤中假单胞菌属（Pseudomonas）、罗尔斯通菌属（Ralstonia）和矢野鞘氨醇菌属 （Sphingobium）的表达量均较低；而接种 NRCB010 的土壤中芽孢杆菌属（Bacillus）、类诺卡氏属 （Nocardioides）和 Gaiella 表达量较高。与对照相比，在收获期，接种 NRCB010 和 NRCB026 的土壤中鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）相对丰度均增加（图3b）。
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注：同一时间，同一列不同小写字母表示处理间在 0.05 水平上差异显著。
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图3 施氏假单胞菌 NRCB010 和贝莱斯芽孢杆菌 NRCB026 对玉米土壤细菌门水平和属水平群落组成的影响
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注：a 为细菌门水平，b 为细菌属水平。
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STAMP 分析表明，与对照相比，高峰期时，有 7 个属受 NRCB010 处理的影响，分别为拟杆菌属（Bacteroides）、玫瑰弯菌属（Roseiflexus）、溶杆菌属（Lysobacter）、链霉菌属（Streptomyces）、芽孢杆菌属（Bacillus）、类诺卡氏属（Nocardioides） （ 图4a）； 有 4 个属受 NRCB026 影响，分别为链霉菌属、黄杆菌属（Flavisolibacter）、Gaiella、溶杆菌属（ 图4b）。收获期时，均有 4 个属受 NRCB010 和 NRCB026 影响，分别为交替赤杆菌属 （Altererythrobacter）、黄单胞菌属（Xanthomonas）、黄杆菌属、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）（图4c、d）。
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2.4 NRCB010 和 NRCB026 对土壤微生物群落 Beta 多样性的影响
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PCA 和 PERMANOVA 分析表明，在高峰期和收获期，接种 NRCB010 和 NRCB026 土壤 Beta 多样性与对照差异显著（图5，表3）。
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2.5 NRCB010 和 NRCB026 对土壤细菌分支的影响
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LEfSe 分析表明，与对照相比，在高峰期和收获期，NRCB010 和 NRCB026 处理后的土壤在不同分类学水平上均存在显著差异的细菌分支。在高峰期时，不同处理下的土壤样品在门、纲、目、科、属水平上共有 43 个细菌分支表现出显著差异 （P<0.05），其中对照、NRCB010 和 NRCB026 处理下分别有 15、14 和 14 个差异显著的细菌分支 （图6）；各处理之间差异最显著的细菌分支分别属于变形菌门、放线菌门和厚壁菌门。收获期土壤中差异细菌分支的数量明显少于高峰期。在收获期时，土壤样品在门、纲、目、科、属水平上共有 20 个细菌分支表现出显著差异（P<0.05），其中对照、NRCB010 和 NRCB026 处理下分别有 13、4 和 3 个差异显著的细菌分支（图6）；各处理之间差异最显著的细菌分支分别属于厚壁菌门、鞘脂单胞菌目 （Sphingomonadales）和淡水杆菌属（Limnobacter）。
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图4 高峰期和收苗期 NRCB010 和 NRCB026 分别与对照处理土壤属相对丰度的绝对差异
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注：Mean proportion 表示物种构成在组间存在显著差异的分类以及在各组的比例，Difference in mean proportion 表示差异的比例。
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图5 玉米微生物群落 PCA 分析
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2.6 微生物反硝化基因丰度
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与对照相比，在高峰期和收获期，NRCB026处理的土壤中 nirK、nirS、nosZI 和 nosZII 拷贝数范围分别为 4.81～5.37、4.26～5.23、4.81～5.29 和 4.09～4.36 Log 拷贝数 g（图7d、e、f、g）。与对照相比，在收获期，NRCB010 和 NRCB026 处理的土壤中 nosZ 拷贝数均显著增加（图7f、g）， NRCB026 处理的土壤中 nirS 拷贝数显著降低 （ 图7d）； 在收获期，NRCB010 和 NRCB026 处理的土壤中 nirK 拷贝数均无显著差异，而在高峰期，NRCB026 处理的土壤中 nirK 拷贝数显著降低 （ 图7e）。在所有处理中，土壤中 AOA、AOB amoA 和 amoB 拷贝数范围分别为 4.94～5.01、 2.60～2.93 和 2.26～2.65 Log 拷贝数 /g（图7a、b、c）。与对照相比，在高峰期和收获期， NRCB010 和 NRCB026 处理的玉米土壤中 AOA amoA 拷贝数没有显著变化（ 图7a）； 在高峰期，NRCB026 处理的土壤中 AOB amoA 拷贝数显著降低（ 图7b）。接种 NRCB010 和 NRCB026 对 N2O 产生与消耗的关键基因丰度比例有一定影响。与对照相比，在高峰期，接种 NRCB010 和 NRCB026 的（nirS+nirK）/（nosZI+nosZII）均显著降低，在收获期，接种 NRCB026 显著低于对照（ 图7h）。接种 NRCB026 的（amoA+amoB）/ （nosZI+nosZII）在高峰期和收获期均显著低于对照和 NRCB010（图7i）。
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图6 玉米土壤微生物群落 LEfSe 分析
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注：LDA Score 表示评估差异显著的物种的影响力。
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图7 玉米土壤氮循环基因拷贝数
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注：amo/nos 表示（amoA+amoB）/（nosZI+nosZII），nir/nos 表示（nirS+nirK）/（nosZI+nosZII）。
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2.7 土壤微生物群落结构与理化因子的相关性
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选取高峰期和收获期的土壤理化因子和相对丰度占比前 10 的门水平细菌群落成员进行 RDA 分析。在高峰期时，土壤理化因子对 N2O 的解释率为 77.56%（图8a）；在收获期时，对 N2O 累积排放量的解释率为 77.3%，并且 pH 是影响细菌群落的关键因子（图8b）。在高峰期和收获期时，pH 与土壤N2O 排放通量呈负相关（表4）； 同时，pH 与微生物群落结构显著相关（P<0.05） （图8）。
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图8 土壤环境因子与氧化亚氮的冗余分析
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注：图中 SOM 表示有机质，NO3--N 表示硝态氮，NH4 +-N 表示铵态氮，AP 表示有效磷。
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注：同一时间，*** 代表在 0.001 水平上显著相关；** 代表在 0.01 水平上显著相关；* 代表在 0.05 水平上显著相关。
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2.8 FAPROTAX 功能预测
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FAPROTAX 功能预测分析表明，在 13 个与土壤氮循环相关的功能类别中，与对照相比，高峰期时， NRCB010 和 NRCB026 处理的土壤中反硝化作用、硝酸盐还原作用和氮呼吸作用与 N2O 产生和消耗的相关基因丰度增加（图9a），NRCB010 处理分别增加 6%、 4%、8%；NRCB026 处理分别增加 1%、3%、1%。与对照相比，收获期时，NRCB010 处理的土壤中反硝化作用基因丰度降低 0.3%，硝酸盐还原和氮呼吸作用基因丰度分别增加约 5%、0.7%；NRCB026 处理的土壤中反硝化和氮呼吸作用基因丰度分别增加 2%、 2%，硝酸盐还原作用基因丰度降低 0.2%（图9b）。
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图9 玉米细菌群落 FAPROTAX 功能预测
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注：图中圆点表示离散点。aerobic_ammonia_oxidation：有氧氨氧化，aerobic_nitrite_oxidation：有氧亚硝酸盐氧化，nitrification：硝化作用，nitrate_ denitrification：硝酸盐反硝化作用，nitrite_denitrification：亚硝酸盐反硝化作用，nitrous_oxide_denitrification：氧化亚氮反硝化作用，denitrification：反硝化作用，nitrogen_fixation：固氮作用，nitrite_respiration：硝酸盐还原，aromatic hydrocarbon degradation：芳香烃降解，nitrate_respiration：硝酸盐呼吸作用，nitrate_reduction：硝酸盐还原，nitrogen_respiration：氮呼吸。
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3 讨论
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3.1 贝莱斯芽孢杆菌和施氏假单胞菌对作物生长的影响
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贝莱斯芽孢杆菌和施氏假单胞菌在促进作物生长方面有广泛的研究。陈冉等[19]研究发现，贝莱斯芽孢杆菌 XC1 可促进拟南芥侧根发根；显著降低苹果连作土壤酚酸类物质的含量，增加连作土壤再植平邑甜茶幼苗根系抗氧化酶活性、叶片叶绿素含量及光合参数，进而促进了平邑甜茶幼苗生长。杨华等[17]在田间试验条件下将固氮施氏假单胞菌 A1501 接种至种植玉米的土壤中，显著提高玉米的生物量和根际固氮量。前期研究结果表明，NRCB010 和 NRCB026 的产铁载体和溶磷能力较强，能够提高土壤养分活性[20-21]；在无菌琼脂平板和温室盆栽条件下均显著增加番茄幼苗地上部干重[9，21]。本研究进一步发现，NRCB010 和 NRCB026 在温室盆栽条件下显著增加玉米地上部干重（图1f）。这些结果说明，NRCB010 和 NRCB026 具有良好的促进作物生长的特性。
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PGPR 可以通过影响根际细菌群落或者招募有益菌间接促进植物的生长[17]。Sun 等[22] 研究发现，贝莱斯芽孢杆菌 SQR9 通过改变其他有益细菌的丰度来改变根际微生物组成，协助植物生长。黄杆菌属等菌株能促进作物的生长[23]。本研究中，与对照相比，接种 NRCB010 和 NRCB026 处理的土壤中黄杆菌属相对丰度增加，并且通过 STAMP 分析，可看出多个菌属分别受到 NRCB010 和 NRCB026 的影响，并且呈显著正相关关系（图4）。说明 NRCB010 和 NRCB026 可以招募有益菌，间接促进玉米的生长。高根际细菌丰度通过不同微生物之间的协同作用提高了营养生物利用率并促进根系生长[22]。本研究中，与对照相比，NRCB010 和 NRCB026 提高 N2O 排放高峰期的根际细菌的 Shannon 指数，NRCB010 还提高收获期的根际细菌的 Shannon 指数。这暗示 NRCB010 和 NRCB026 可能通过与土壤微生物的互动，吸收营养物质，从而进一步改善玉米的生长状况，促进了作物地上部生长。
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3.2 贝莱斯芽孢杆菌和施氏假单胞菌对土壤 N2O 排放和氮转化微生物群落功能的影响
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贝莱斯芽孢杆菌和施氏假单胞菌对土壤 N2O 排放的影响和机制研究较少。Wu 等[24] 研究表明，解淀粉芽孢杆菌 EBL11 减少酸性土壤 N2O 排放，增加 N2O 还原菌的丰度。申卫收等[9]在温室盆栽、土壤微宇宙和田间原位研究发现，NRCB010 和 NRCB026 均能减少土壤N2O 排放。本研究结果与前人的研究结果相似，在温室盆栽条件下， NRCB010 和 NRCB026 减少玉米土壤 N2O 的排放量 （图2b）。说明 NRCB010 和 NRCB026 具有较好的减少农田土壤 N2O 排放的特性。
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PGPR 可以提高土壤的 pH，改变土壤中氮素供应水平，为土壤微生物提供额外的营养物质[25]。这些改变可以影响土壤中的微生物群落结构和功能，或者招募有益于作物生长及脱氮的微生物来促进作物生长及土壤 N2O 减排[17]。本研究中，在收获期，接种 NRCB010 和 NRCB026 后土壤的铵态氮和硝态氮含量低于对照组土壤的含量，这可能是由于 PGPR 通过增强植物根系对氮素的吸收能力，使植物能够更有效地利用土壤中的硝态氮和铵态氮[12]。此外，玉米生物量增加的同时，根系分泌物可能会增多，从而为反硝化提供更多底物，而菌株诱导玉米根系分泌物可能分泌某种能够抑制反硝化作用的物质[26]。收获期土壤 pH 与原始土壤 pH 相比均显著提高，并且处理组土壤 pH 升高幅度更大（表4）。原因可能是在酸性土壤中，玉米偏好硝态氮，吸收硝态氮升高土壤 pH[27]；也可能是NRCB010 和 NRCB026 提高反硝化微生物的生长和活性，并且这个过程产生一些可中和土壤的酸性的物质，从而升高土壤 pH。Wu 等[12]的研究结果也表明，解淀粉芽孢杆菌 EBL11 处理后的土壤 pH 升高是由于反硝化过程活性的增加。土壤 pH 是酸性土壤中 N2O 产生的关键驱动因素，可能通过改变反硝化微生物群落多样性和丰度影响 N2O 排放量[28]。在酸性土壤中，氮素的转化过程受到抑制，可能导致氮素的积累和 N2O 的产生增加。酸性土壤中的微生物活动受到抑制，降解有机氮和固氮的能力减弱，导致土壤中氮素的积累。此外，酸性土壤中的硝化作用受到抑制，导致铵态氮在土壤中积累，增加了 N2O 的产生潜力[29]。通常情况下，pH 为5～8 时，pH 与 N2O 排放为负相关[9]。本研究中，pH、有效磷与微生物群落变化显著相关（表4），并且 pH 与 N2O 呈负相关关系（图6，表4），推测 NRCB010 和 NRCB026 引起 pH 的升高是其减少 N2O 排放的关键驱动因素。
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土壤微生物群落的组成和活性对 N2O 产生有重要调节作用。微生物群落的种类和相对丰度会影响土壤中反硝化细菌的活性和 N2O 产生的速率[30]。申卫收等[9]研究发现，NRCB026 不具备直接还原 N2O 的能力，推测是间接改变 N2O 还原微生物群落丰度和组成，从而实现 N2O 减排的效果。本研究中，在高峰期和收获期时，变形菌门为土壤细菌的第一优势菌门，在玉米土壤中均具有较高的相对丰度；在收获期时，NRCB010 和 NRCB026 土壤中变形菌门的相对丰度占比明显高于对照（图3）。而大多数脱氮细菌属于变形菌门，并且变形菌门在反硝化中占主导地位[17]，该菌门丰度的增加有利于强化反硝化过程。此外，收获期时，鞘氨醇单胞菌属和黄杆菌属在 NRCB010 和 NRCB026 土壤中的表达量均高于对照土壤中的表达量，这两种属群均为植物有益属[12，31]，并且鞘氨醇单胞菌属含有产生和消耗 N2O 的物种[31]。
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施用 PGPR 后微生物群落结构的差异对N2O 排放潜力产生显著的综合影响，其中各种氮代谢基因的丰度直接调节N2O 的生产和消耗[32]。降低 amoA 或 amoB 型硝化细菌和 nirK 或 nirS 型反硝化细菌丰度，可抑制 N2O 产生，或增加 nosZ 型丰度，从而促进 N2O 消耗[33]。本研究中，收获期时， NRCB010 和 NRCB026 显著增加 nosZ 拷贝数，并且 N2O 排放量与 nirZ 基因拷贝数呈负相关，表明两株 PGPR 将更多的 N2O 转化为 N2 从而减少 N2O 的排放（表4）。类似地，施用贵州木霉（Trichoderma guizhouense）有机肥显著增加了 nosZ 基因丰度并减少 N2O 排放[10]。此外，NRCB026 显著降低了土壤中 AOB 基因拷贝数，这表明 NRCB026 能通过硝化作用抑制 N2O。接种解淀粉芽孢杆菌 EBL11 减少 AOB 基因拷贝数，从而抑制硝化作用，减少 N2O 排放[24]。这些结果表明，NRCB010 和 NRCB026 处理的土壤微生物可能通过抑制硝化作用或者将更多的 N2O 转化为 N2 来支持反硝化进而减少 N2O 排放。
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NRCB010 和 NRCB026 分别属于假单胞菌属和芽孢杆菌属，在高峰期和收获期时，NRCB010 处理下的假单胞菌属表达水平却低于对照和 NRCB026，同样，NRCB026 处理下的芽孢杆菌属表达水平却低于对照和 NRCB010（图3b），推测可能是由于外来微生物与植物根际微生物之间的种内竞争的结果[12，34-35]。接种NRCB010 和 NRCB026 后，N2O 排放高峰期时，土壤中微生物群落潜在的反硝化能力高于对照（图9）。这些结果进一步说明，NRCB010 和 NRCB026 可能通过增加玉米根际土壤反硝化微生物的丰度和活性实现减少 N2O 排放。
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4 结论
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基于温室盆栽试验和 16S rDNA 扩增高通量测序技术，研究了施氏假单胞菌 NRCB010 和贝莱斯芽孢杆菌 NRCB026 对玉米生长和土壤 N2O 排放的影响。结果表明，与对照相比，NRCB010 和 NRCB026 显著促进玉米幼苗的生长，干重分别提高 41% 和 35%；显著减少土壤 N2O 的累积排放量，分别降低 54.6% 和 21.6%；在酸性土壤情况下，显著提高土壤 pH；提高土壤 N2O 排放高峰期的 Shannon 指数；改变根际土壤的微生物群落结构，增加变形菌门及其包含的鞘氨醇单胞菌属和黄杆菌属相对丰度。FAPROTAX 功能预测结果表明， NRCB010 和 NRCB026 处理的土壤中反硝化作用、硝酸盐还原作用和氮呼吸作用等与 N2O 产生和消耗相关基因相对丰度均有增加。推测 NRCB010 和 NRCB026 调控玉米根际土壤反硝化微生物的丰度和活性增加实现菌株减少 N2O 排放。研究结果为减少农田土壤 N2O 排放提供一定的技术参考。还需进一步研究 PGPR 在不同土壤类型、作物种类等情况下减少 N2O 排放的效应的作用机制，并在田间进行验证。
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摘要
为探究植物根际促生菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）对玉米生长和土壤氧化亚氮（N2O）排放的影响，基于温室盆栽试验和 16S rDNA 扩增高通量测序技术，研究施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）NRCB010 和贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）NRCB026 对玉米幼苗生长和土壤 N2O 排放的影响。与对照相比，接种 NRCB010 和 NRCB026 显著促进玉米幼苗的生长，干重分别增加 41% 和 35%；减少土壤 N2O 的累积排放量，分别降低 54.6% 和 21.6%；在收获期，与对照相比，NRCB010 处理土壤的细菌优势属中鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）和黄杆菌属 （Flavisolibacter）相对丰度分别增加 12% 和 0.5%；NRCB026 处理土壤的细菌优势属中鞘氨醇单胞菌属和黄杆菌属相对丰度分别增加 11% 和 0.7%。FAPROTAX 功能预测结果表明，NRCB010 和 NRCB026 处理的土壤中反硝化和硝酸盐还原作用的微生物基因丰度高于对照。Pearson 相关性和冗余分析进一步表明，pH 是影响 PGPR 减少土壤 N2O 排放的主要因素。NRCB010 和 NRCB026 可能是通过增加玉米根际土壤反硝化微生物的丰度和活性实现减少土壤 N2O 排放。研究结果为应用 PGPR 减少农田土壤 N2O 排放提供一定的技术参考。
Abstract
To investigate the effects of plant growth promoting rhizobacteria（PGPR）on maize growth and soil nitrous oxide（N2O）emission，the effects of control，Pseudomonas stutzeri NRCB010 and Bacillus velezensis NRCB026 on maize seedling growth and soil N2O emission were compared based on the greenhouse potting experiment and 16S rDNA amplified high-throughput sequencing．Compared with the control，inoculation with NRCB010 and NRCB026 significantly promoted the growth of maize seedlings，increased dry weight by 41% and 35%，reduced cumulative soil N2O emissions by 54.6% and 21.6%，respectively；at harvest，the relative abundance of Sphingomonas and Flavisolibacter in the dominant genera of soil bacteria in NRCB010 treatment increased by 12% and 0.5%，respectively，compared with the control；and the relative abundance of Sphingomonas and Flavisolibacter in NRCB026 treatment increased by 11% and 0.7%，respectively． FAPROTAX functional prediction results indicated that the abundance of microbial genes for soil denitrification and nitrate reduction was higher in NRCB010 and NRCB026 treatments than in the control group．Pearson correlation and redundancy analyses further indicated that pH was the main factor influencing PGPR to reduce soil N2O emissions．NRCB010 and NRCB026 reduced soil N2O emissions by increasing the abundance and activity of denitrifying microorganisms in maize rhizosphere soil．The results of this study provided a technical reference for the application of PGPR to reduce soil N2O emissions in agricultural fields.