近年来，我国大豆产量增加缓慢，总量和单产均低于世界平均水平^[1]。我国大豆消费量的 82% 需要进口^[2]，而限制我国大豆高产的重要因素主要是养分供应不足和不平衡^[3]。大豆是生物固氮类植物的典型代表，其根能与根瘤菌共生形成根瘤，具有固氮能力^[4-5]。探究施肥对“土壤-微生物-植物”三者的相互影响对建立合理的施肥技术体系和大豆生产的增产增效以及对自然界中的氮素循环具有重要意义。大豆根与根瘤菌共生固定的氮素占大豆氮总需求的 65%～70%^[6]，且其可增强大豆的光合作用，提高大豆籽粒蛋白质含量、脂肪含量以及产量。研究表明，接种根瘤菌能有效增加根瘤数和单个根瘤重量，对提高大豆产量起重要作用^[7-9]。土壤氮素含量是影响根瘤菌接种效果的重要因素，影响根瘤菌-植物共生固氮的效果^[10]。在土壤氮素水平较高时会降低根瘤菌对根毛的侵染，使豆科植物的共生结瘤作用受到抑制，导致根瘤数量以及根瘤固氮酶活性的降低^[11]。研究表明，大豆能培肥土壤^[12]，并且添加根瘤菌能显著提高大豆产量、土壤有效磷和土壤速效钾含量^[13]。目前，我国大豆根瘤菌剂接种面积不足 3%，与国外相比差距甚大^[14]，并且接种根瘤菌与养分管理相结合的研究较少。因此，利用不同施肥处理及添加根瘤菌的方法，研究平衡施肥和接种根瘤菌对大豆根瘤形成、养分吸收、产量和土壤根瘤菌丰度的影响，为大豆高产高效提高理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验为盆栽试验，试验土壤取自河北省石家庄市 0～20 cm 耕层土壤，供试土壤为砂质潮土，基础理化性状为有机质 10.25 g/kg，全氮 0.99 g/kg，有效磷和速效钾分别为 20.10 和 261.06 mg/kg，铵态氮和硝态氮含量分别为 0.46 和 7.53 mg/kg，pH 为 8.17（水土比为 2.5∶1）。试验用塑料盆规格为上口直径 22 cm，底座直径 18 cm，高 23 cm。供试大豆品种为中黄 13，肥料选用尿素、磷酸二氢钾和氯化钾。供试根瘤菌株为快生型费氏中华根瘤菌 （Sinorhizobium fredii），由中国农业大学生物学院提供。

1.2 试验设计

试验于 2019 年 6 月 12 日到 9 月 24 日在中国农业科学院网室内进行。试验采用双因素设计，以施肥为主处理，添加和不添加根瘤菌为副处理。4 个主处理为氮磷钾（NPK）、氮钾（NP）、磷钾（PK） 和不施肥（CK）；副处理为添加根瘤菌（AR）和不添加根瘤菌（NAR）。每个处理 10 盆，共 80 盆，每盆装 8 kg，氮磷钾施用量为 N-P₂O₅-K₂O = 0.015-0.01-0.015 g/kg（约为 50-35-50 kg/hm²）。肥料一次性全部施入 8 kg 土中，将土与肥料充分混匀后转入盆中。大豆种子消毒，先用 75% 酒精浸泡 10 s，然后用 1% 的次氯酸钠浸泡 20 min，再用无菌水冲洗 3 次，之后进行避光催芽 24 h。按照大田剂量的 2 倍，取 5 mL 根瘤菌液与 10 mL 黏附剂混匀，将催芽后的大豆倒入根瘤菌与黏附剂混合液中，缓慢搅拌，充分混匀。每盆种植种子 5 粒 （土下 2～3 cm），出苗后每盆留 3 株长势一致的进行试验。盆栽试验管理方法参照大田管理方法适时防病防虫，人工除草等。盛花期前每天浇水 1 次，盛花期后早晚各浇水 1 次，浇水量均为 2 L/ 盆。

1.3 样品采集与处理

盛花期取根际土样 5～10 g，用于高通量测序；大豆根系于盛花期和鼓粒期取样，用于测定根瘤数量和重量；植株于收获期取样，用于测定产量和养分吸收。取样均为破坏性取样，每处理取 3 个重复。

大豆根际土壤样品，挑出根系杂物过 2 mm 筛后，放置于-80℃冰箱保存，DNA 提取前常温解冻。严格按照 FASTDNA Spin Kit 试剂盒中说明书的方法和步骤，从 0.5 g 土壤中提取 60 μL 土壤微生物 DNA。采用 Nanodrop 分光光度计对 DNA 进行定量，并采用 1.2% 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 质量。采用 16S rRNA 序列通用引物 V4～V5 区 515F （5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′）和 907R（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）对 16S rRNA 进行扩增。PCR 扩增体系为：25 μL DNA 聚合酶，0.5 μL 正向引物（20 mmol/L），0.5 μL 反向引物（20 mmol/L），23 μL 无菌水（ddH₂O）和 1 μL DNA 模板（20 ng 土壤总 DNA）。扩增流程为 94℃预变性， 5 min，94℃变性 30 s，54℃退火 30 s，30 次循环，然后 72℃延伸 10 min^[15]。PCR 产物纯化后由上海派森诺生物科技有限公司测序。

于盛花期、鼓粒期完整取出盆内大豆根系，用水冲洗干净晾干，测定根瘤数量和鲜重，65℃烘至恒重后测定干重。在大豆成熟期，取出盆内地上部植株，65℃烘干，以含水量 13% 测定大豆产量和秸秆重。籽粒和秸秆样品分别粉碎后，采用 H₂SO₄-H₂O₂ 法消煮样品，全氮浓度采用凯氏定氮法测定，全磷浓度采用钒钼黄比色法测定，全钾浓度采用火焰光度法测定^[16]。

1.4 数据处理

试验数据采用 Excel 2010 处理；统计分析采用 SPSS 25.0 做单因素方差分析。对得到的高通量序列结果使用 QIIME 进行处理，去除标签序列、引物序列以及低质量序列。运用 USEARCH（version 7.0） 采用 RDP classifier 贝叶斯算法在 97% 相似水平下代表序列进行分类学对比。

2 结果与分析

2.1 不同处理大豆产量

由图1 表明，施肥可增加大豆产量。在 NAR 条件下，NPK、NK 和 PK 处理分别较 CK 增产 33.5%、 9.7% 和 7.1%，其中 NPK 处理显著增产。在 AR条件下，NPK、NK 和 PK 处理分别较 CK 显著增产 40.1%、23.8% 和 18.7%，均以 NPK 处理最高。添加根瘤菌后，NPK、NK、PK 和 CK 处理产量分别较不添加根瘤菌增产 5.1%、13.0%、11.0% 和 0.1%，但均未达到显著差异。以上表明，氮、磷、钾的平衡施用能有效提高大豆的产量，添加根瘤菌有利于大豆的增产。

注：不同小写字母表示不同施肥处理间差异显著（P<0.05）。下同。

2.2 不同处理大豆养分吸收量

在成熟期，除添加根瘤菌的氮、磷吸收外，NK 和 PK 处理的养分吸收与 CK 无显著差异，而不同条件下的 NPK 处理氮、磷、钾吸收较 CK 分别显著增加了 28.1%、22.2%、20.7%（NAR）和 57.8%、 37.8%、29.3%（AR）（ 表1）。除 CK 外，氮、磷、钾吸收量在各处理均表现为 AR 高于 NAR，增加量分别为 3.6%～9.8%、2.8%～15.3%、1.9%～6.8%，但均未达到显著性差异。以上结果表明，平衡施肥和添加根瘤菌均有利于大豆养分吸收。

注：数据表示处理 3 次重复的平均值；小写字母不同表示处理之间差异显著（P<0.05）。

2.3 不同处理大豆根瘤重量

在盛花期，添加和不添加根瘤菌条件下，NPK 处理根瘤鲜重较 CK 分别显著增加了 24.5% 和 27.6%，而 NP 和 PK 处理无显著影响；不同施肥处理添加根瘤菌后根瘤鲜重均表现增加趋势，但仅 NPK 处理增加显著（图2A）。不添加根瘤菌条件下，NPK 处理根瘤干重较 CK 显著增加了 29.8%，而 NK 和 PK 处理无显著影响；添加根瘤菌后所有处理根瘤干重无显著差异，NK、PK 处理添加根瘤菌较不添加根瘤菌均显著增加根瘤干重（图2B）。

在鼓粒期，添加和不添加根瘤菌条件下各施肥处理根瘤鲜重与 CK 均无显著差异；但在添加根瘤菌后 NK、PK 和 CK 处理较不添加根瘤菌分别显著提高 47.3%、39.4% 和 46.6%（图2C）。不添加根瘤菌条件下，NPK 处理根瘤干重较 CK 无显著差异，但 NK、PK 处理均显著低于 CK。添加根瘤菌下的所有处理根瘤干重无显著差异，但较不添加根瘤菌的根瘤干重呈增加趋势，且 NK 处理添加根瘤菌后根瘤干重显著高于不添加根瘤菌 （图2D）。

盛花期和鼓粒期，在添加与不添加根瘤菌的根瘤鲜重和干重中，4 个施肥处理均为 NPK 处理最高。同一施肥处理，根瘤鲜重和干重均为添加高于不添加根瘤菌。在两个生长期内，NK 处理下添加较不添加根瘤菌均显著提高了根瘤鲜重和干重。

2.4 不同处理大豆根瘤数量

在盛花期，不添加根瘤菌的 4 个施肥处理大豆根瘤数量均无显著差异。添加根瘤菌后，PK 和 CK 处理根瘤数分别显著增加了 48.2% 和 53.0%，而 NPK 和 NK 处理没有显著变化（图3A）。鼓粒期（图3B），不添加根瘤菌条件下 CK 根瘤数量显著高于施肥处理，添加根瘤菌后 NPK、NK 和 PK 处理根瘤数量较不添加根瘤菌分别显著增加了 43.5%、53.8% 和 30.9%，而 CK 无变化。说明添加根瘤菌能提高大豆根瘤数量，并且缺氮条件下添加根瘤菌，盛花期的根瘤数量显著增加。

2.5 不同处理盛花期土壤细菌群体组成及中华根瘤菌属的相对丰度

本研究选取了细菌相对丰度>1% 的优势菌门（ 图4），在 8 个处理中变形菌门 （Proteobacteria）相对丰度均 >50%，其次为酸杆菌门（Acidobacteria）。在不同处理中两个菌门的相对丰度无显著差异，但添加根瘤菌后，在 NPK 和 NK 处理中，变形菌门相对丰度有降低趋势，酸杆菌门相对丰度有增加趋势；在 PK 处理中变形菌门相对丰度有增加趋势，酸杆菌门相对丰度有降低趋势。说明在施氮处理下添加根瘤菌降低了土壤变形菌门的相对丰度，提高了酸杆菌门的相对丰度。

注：A、B 图为盛花期，C、D 图为鼓粒期；* 表示为该处理的添加与不添加根瘤菌间达到显著差异（P<0.05）。下同。

注：A 图为盛花期，B 图为鼓粒期。

由图5 可知，土壤中华根瘤菌属相对丰度在 NAR 和 AR 条件下 NPK、NK 处理均显著高于 PK 和 CK 处理，并且在 4 个处理中 AR 均高于 NAR。说明添加费氏中华根瘤菌能提高土壤中华根瘤菌属的相对丰度，并且在施氮条件下增加更显著。

不添加根瘤菌条件下，NPK、NK 处理中华根瘤菌属丰度（3.3% 和 3.4%）显著高于 PK（2.5%）和CK（2.2%）处理。添加根瘤菌后，尽管较不添加根瘤菌各处理中华根瘤菌属相对丰度增加未达到显著水平，但 NPK 和 NK 处理中华根瘤菌属丰度（4.5% 和 4.1%）增幅分别为 36.0% 和 29.7%，且显著高于 PK（2.5%）和 CK（2.7%）处理。说明在养分平衡供应下更有利于中华根瘤菌的生长及外加中华根瘤菌的定殖。

3 讨论

3.1 施肥和添加根瘤菌对产量和养分吸收的影响

氮、磷、钾是作物生长的必须营养元素^[17-19]，平衡施肥也是作物高产的必要条件。本研究也表明，NPK 处理大豆产量较其他处理显著提高，氮、磷、钾的平衡施用能较好满足大豆生长和高产的需要。在 4 个施肥处理添加根瘤菌后产量均显著增加，因为添加根瘤菌能促进大豆对土壤养分的吸收，进而提高大豆的产量^[20]。

在盛花期和成熟期，无论添加根瘤菌与否， NPK 处理氮吸收量显著高于其他 3 个处理；在成熟期，4 个施肥处理添加根瘤菌条件下氮、磷、钾吸收量均高于不添加根瘤菌。一方面，是因为氮、磷、钾的平衡施用促进大豆的生长和养分的吸收^[21]；另一方面，添加根瘤菌提高了土壤肥力，也提高了大豆的生物量和产量及养分吸收^[22-23]。

3.2 施肥和添加根瘤菌对根瘤形成的影响

研究表明，氮素和磷素用量会影响根瘤菌-植物共生体系的固氮效率，适宜的氮肥用量会促进大豆根瘤的形成，接种根瘤菌能显著提高大豆根瘤的数量和重量^[7，24-25]。磷素参与根瘤菌与宿主的结瘤共生过程，缺磷会降低固氮酶活性，减少根瘤的数量和重量^[6，26-27]。本研究与前人研究相似，NPK 处理在盛花期和鼓粒期根瘤鲜重和干重均较其他处理高，添加根瘤菌均提高了所有处理的根瘤鲜重和干重。并且两个大豆生长期 NK 处理添加根瘤菌后大豆根瘤鲜重和干重增加最显著，也说明缺磷对根瘤的生长抑制最严重，而添加根瘤菌能促进根瘤的形成。对于根瘤的数量，在盛花期，PK、CK 处理添加根瘤菌较不添加根瘤菌显著提高了根瘤数量，但这个时期的根瘤重量不成线性关系，说明此时的根瘤体积较小，与前人研究不一致^[7]。其原因可能是在根瘤形成前期对氮的需求量较少，添加根瘤菌能提高根瘤的数量，但缺氮仍会限制根瘤生长发育。在大豆鼓粒期，添加根瘤菌的施肥处理大豆根瘤数量仍高于不添加根瘤菌。这可能是因为在根瘤发育过程中，施肥为大豆提供了较多的养分，促进植物根系分泌物的增加，为添加的根瘤菌提供了较高的碳源，促进了根瘤数量的增加^[28]。

3.3 添加根瘤菌对盛花期根际土壤细菌群体组成的影响

本研究表明，大豆根际土壤中的优势菌门为变形菌门和酸杆菌门，说明这两类菌门是大豆根际土壤中的主导菌门，这与前人研究一致^[29-30]。而施氮处理下添加根瘤菌降低了土壤变形菌门的相对丰度，提高了酸杆菌门的相对丰度。这可能是因为氮肥的施入改变了土壤的氮素含量，而添加的根瘤菌又属于变形菌门，导致土壤菌群发生拮抗作用，相对丰度下降，而施氮为酸杆菌门提供养分，提高其相对丰度。除 PKAR 以外的变形菌，其处理的细菌群体组成均无显著变化，可能是因为短期不同施肥措施和添加根瘤菌对土壤细菌群体组成没有显著影响，要改变土壤细菌组成，可能需要连年使用根瘤菌。添加根瘤菌提高了土壤根瘤菌属相对丰度，这与前人研究一致^[31-32]。并且在施氮条件下较不施氮差异显著，这可能因为在盛花期施入氮素能为根瘤菌-植物共生体系提供营养，同时提高了根瘤菌属的相对丰度。

4 结论

平衡施肥能促进大豆根瘤的形成，根瘤数量增加，进而提高了大豆的养分吸收和产量。添加根瘤菌提高了不同施肥处理中大豆根际土壤中华根瘤菌属的相对丰度，但对细菌群体组成没有显著影响。

参考文献