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目前，化学防治依然是防治植物病害的主要措施，但其大量使用会导致病原菌抗药性、生态环境污染及食品安全问题。利用有益微生物和微生物代谢产物预防和控制作物病害作为更环保、安全的植物保护方法，具有广阔的发展前景[1-2]，发掘及利用功能微生物菌株是实现植物病害生物防治的重要基础。目前，常用于防治植物病害的功能微生物有木霉菌属（Trichoderma）、芽孢杆菌属（Bacillus）、链霉菌属（Streptomyces）、假单胞菌属（Pseudomonas）等[3]。尽管防病微生物类群众多，但现有的商业化微生物制剂产品和功能仍相对单一。
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泛菌（Pantoea）是一类种群和功能高度多样化的细菌[4]。研究表明，许多泛菌能够与植物形成互利共生关系或具有促进植物生长的能力，并在氮限制条件下可以促进植物根部的固氮[5-6]。其中，分散泛菌（Pantoea dispersa）能够在植物根部定殖，为植物提供有益的代谢物[7-8]，在环境保护、土壤生物修复和促进植物生长等方面均表现出强大的应用潜力。Shahzad 等[9]从水稻种子中分离的 P. dispersa RWL-6 可以分泌吲哚乙酸（IAA）来促进水稻植株的生长。除此之外，分散泛菌在农业生产中还可以作为一种有效的抗菌剂对抗各种病原体，通过分泌抗菌物质抑制病原菌在植物中的增殖[10]。Jiang 等[11]从甘薯中分离的分散泛菌在体内和体外均表现出显著的抗真菌活性，可以抑制甘薯黑斑病病原物甘薯长喙壳菌菌丝的生长和孢子的萌发。段红雁[12]从小麦根际土壤中分离的泛菌具有溶磷、解钾和固氮的作用，对小麦的幼苗具有良好的促生作用。Cui 等[13]从盐碱地种植青贮玉米根际土壤中分离的分散泛菌可以改善盐碱土中的养分代谢和酶活性，促进青贮玉米的生长。
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本研究通过对贵州省遵义市烟草种植区采集的土壤样品进行分离和筛选，获得一株高效的防病促生菌，对其分类地位进行系统鉴定，并利用 antiS MASH 预测其潜在的次生代谢活性物质。进一步通过盆栽试验测定了该菌株对烟草的促生效果和对烟草青枯病的防效，为深入研究功能机制以及将其应用于微生物菌剂的开发奠定了基础。
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1 材料与方法
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1.1 试验材料
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1.1.1 供试土壤
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从贵州省遵义市正安县（28°34′19″N、107°16′ 48″E）、余庆县（27°37′14″N、107°38′13″E）、绥阳县（27°55′49″N、107°5′30″E）和汇川区 （27°52′6″N、107°3′15″E）采集烟草种植区根围土壤样品 144 份，将采集到的土壤样品用密封袋保存，并存于 4℃备用。
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1.1.2 供试植株
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烟草（Nicotiana tabacum），由本实验室提供。
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1.1.3 供试病原菌
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供试病原菌及其来源见表1。
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1.2 试验方法
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1.2.1 菌株的分离与纯化
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称取 2 g 根围土壤样品，加入装有 18 mL 无菌蒸馏水的三角瓶中，于 28℃、200 r·min-1 条件下振荡 1 h。室温下静置 5 min，取 1 mL 上层清液，通过 10 倍梯度稀释至 10-5。从每个梯度溶液中取 100 μL 涂布于 LB 培养基平板上，每个浓度梯度重复 3 次，置于 28℃培养箱培养 48 h 后，挑取 LB 板上形态、颜色等特征存在差异的单菌落进行多次划线纯化，将纯化后的菌株悬浮液置于终浓度为 20% 的甘油，于-80℃冰箱中保存。
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1.2.2 烟草疫霉菌和茄科雷尔氏菌拮抗菌株筛选及抑菌谱检测
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以烟草疫霉菌和茄科雷尔氏菌为靶标筛选具有良好拮抗活性的菌株，并对筛选到的菌株进一步测定其抑菌谱，拮抗病原细菌检测方法具体操作如下：将活化后的菌株与病原细菌分别接种至 LB 液体培养基，在 28℃、200 r·min-1 条件下过夜振荡培养。待融化后的培养基冷却至 45℃，按照 1∶1000 的比例加入病原细菌培养液，摇匀倒平板，制备带菌平板。在平板中间位置接种 10 μL S8797 菌液，晾干后于 28℃培养箱倒置培养，每个处理设置 3 次重复。培养 48 h 后观察并测量抑菌圈直径。拮抗病原真菌和卵菌检测方法参考 Gu 等[20]的方法，具体如下：将活化后的菌株 S8797 接种至 LB 液体培养基，振荡培养至稳定期，将供试病原真菌接种在 PDA 培养基上培养。用打孔器取新鲜培养的病原真菌菌饼，菌丝朝下接种于新鲜 PDA 平板中心处，在距离菌饼约 3 cm 处接种 5 μL S8797 菌液，晾干后于 25℃培养箱倒置培养，每个处理设置 3 个重复。培养 3～5 d 后观察并测量抑菌带宽度。
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1.2.3 菌株 S8797 的促生特性测定
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挑取新鲜的菌株 S8797 单菌落接种于 LB 液体培养基，在 28℃、200 r·min-1 条件下过夜培养。再将 10 μL 菌悬液分别接种到无机磷固体培养基[21]、解钾培养基[22]、产纤维素酶固体培养基[23]、蛋白胨氨化培养基[24]上，检测菌株解无机磷、解钾、产纤维素酶和产 NH3 的能力。
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1.2.4 菌株 S8797 的系统鉴定
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将菌株 S8797 进行活化，以菌悬液作为模板进行 PCR 扩增，所用的引物为 27F（AGAGTTT GATCCTGGCTCAG） 和 1492R（TACGGCTACCTTGT TACGACTT），由擎科生物科技股份有限公司合成。 PCR 产物经电泳检测后，送往擎科生物科技股份有限公司进行测序。将扩增获得的基因序列提交至 EzBioCloud 数据库（https://www.ezbiocloud.net/）进行比对。利用 MEGA-X 软件 11，采用邻接法（neighbour-joining）建系统发育树，bootstrap 值采用 1000 次运算，确定菌株的分类地位。进一步明确菌株 S8797 的分类地位，利用在线分析网站 https://www. ezbiocloud.net/tools/ani 和 http://ggdc.dsmz.de/ggdc.php# 计算菌株 S8797 与邻近分支菌株的平均核苷酸一致性（ANI）和 DNA-DNA 杂交值（DDH）。
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1.2.5 基因组测序及次级代谢物预测
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挑取新鲜的菌株 S8797 单菌落接种至 LB 液体培养基中，28℃、200 r·min-1 过夜培养。取 2 mL 菌液于 10000 r·min-1 离心 2 min 收集菌体。使用细菌基因组 DNA 提取试剂盒（Solarbio Cat#D1600） 提取菌株 S8797 基因组 DNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。获得菌株 S8797 基因组后，委托苏州金唯智生物科技有限公司对其进行全基因组测序，获得菌株全基因组草图。基于测序数据，通过 Trimmomatic 软件包进行质量过滤，使用 Spades 软件对过滤后 reads 进行组装，得到初步结果。通过软件 Prodigal（v2.6.3）进行基因预测。分别利用 Rfam 和 tRNAscan-SE（v2.0）软件预测 tRNA 和 rRNA 区域。使用 NR 数据库、KEGG 数据库、GO 数据库、Pfam 数据库、Swiss-Prot 数据库、CAZy 数据库、CARD 数据库等对编码基因进行功能注释。利用 antiSMASH 预测菌株 S8797 基因组上的次级代谢物生物合成基因簇进行预测[25]。
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1.2.6 菌株 S8797 对烟草幼苗的促生效果
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将烟草种子播种于育苗盆中，置于温室中培养 （光 / 暗时长 16/8 h，温度 28℃），待培养 4 周后选长势一致的烟草苗进行移栽。将筛选的 S8797 单菌落接种于 LB 液体培养基，28℃、200 r·min-1 培养 24 h 后，按照 1% 接种量转接于 50 mL LB 液体培养基中，在 28℃、200 r·min-1 条件下继续培养 24 h。收集菌体，利用 10 mmol·L-1 MgCl2 将 S8797 配制成浓度为 1×108 CFU·mL-1 的菌悬液，于烟草根部灌根 50 mL，以灌根 50 mL MgCl2 为对照。每个处理进行 3 次重复，每个重复 6 株烟草。每天观察记录生长情况，待灌根后第 30 d 测量株高。
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1.2.7 菌株 S8797 对烟草青枯病的盆栽防治效果
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选择生长四周长势一致的烟株，设置生防菌处理组、发病对照组和健康对照组，每组 6 株，3 次重复。生防菌处理组处理方式：每株幼苗经 50 mL 1×108 CFU·mL-1 的 S8797 菌悬液灌根处理 3 d 后，采用锐器伤根并灌根 50 mL 1×108 CFU·mL-1 的茄科雷尔氏菌菌悬液。发病对照组：首先经 50 mL 10 mmol·L-1 MgCl2 灌根处理 3 d，然后采用锐器伤根并灌根 50 mL 1×108 CFU·mL-1 的茄科雷尔氏菌的菌悬液。健康对照组：首先经 50 mL 10 mmol·L-1 MgCl2 灌根处理 3 d，然后采用锐器伤根并灌根 50 mL LB 液体培养基。将各处理组置于温室环境下，光 / 暗时长 16/8 h，温度 28℃，每天观察记录发病情况。烟草生长至 17 d 参照国家标准 （GB/T23222—2008）[26]烟草病害分级及调查方法进行发病情况调查，计算病情指数及防治效果。病情指数和防治效果按照如下公式计算：
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病情指数 =Σ（病级数 × 该病级植株数）/（最大病级数 × 植株总数）×100
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防治效果 =（对照组病情指数-处理组病情指数）/ 对照组病情指数 ×100%
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1.2.8 数据统计与分析
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采用 SPSS 27.0 和 GraphPad 10.0 进行所有数据的分析处理，采用单因素方差分析统计各处理间的差异显著性。
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2 结果与分析
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2.1 菌株 S8797 的分离及抑菌谱检测
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从遵义市烟草种植区共分离到 1385 株细菌，平板对峙试验结果显示，S8797 具有稳定、高效的拮抗植物病原细菌、病原卵菌和真菌的能力。该菌株对烟草茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）、水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）、番茄细菌性溃疡病菌（Clavibacter michiganensis subsp. michiganse）、十字花科黑腐病菌（Xanthomonas campestris pv. carnpestris）、细菌性果斑病菌（Acidovorax avenae subsp.citrulli）、西瓜细菌性果斑病菌 （Acidovorax citrulli）以及烟草疫霉菌（Phytophthora nicotianae）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. niveum）、烟草黑腐病菌（Thielaviopsis basico-la）、水稻恶苗病菌（Gibberella fujikuroi）、水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）、小麦茎基腐病菌（Fusarium pseudograminearum）等病原细菌、病原卵菌和真菌均具有良好的抑制作用（图1）。
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图1 平板拮抗实验测定菌株 S8797 对病原细菌、真菌和卵菌的抑制作用
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注：A 为烟草茄科雷尔氏菌；B 为水稻白叶枯病菌；C 为番茄细菌性溃疡病菌；D 为十字花科黑腐病菌；E 为细菌性果斑病菌；F 为西瓜细菌性果斑病菌；G 为烟草疫霉菌；H 为西瓜枯萎病菌；I 为烟草黑腐病菌；J 为水稻恶苗病菌；K 为水稻纹枯病菌；L 为小麦茎基腐病菌。
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2.2 菌株 S8797 的促生指标检测
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为进一步明确菌株 S8797 的促生潜力，对 S8797 水解无机磷和有机磷能力、解钾能力、产蛋白酶能力、产纤维素酶能力、产淀粉酶能力、分泌 IAA 能力、产 NH3 能力共 8 个指标进行了检测。结果显示，菌株 S8797 能够水解无机磷、解钾、产纤维素酶和产 NH3（图2），不具有解有机磷、产蛋白酶、产淀粉酶、产 IAA 的能力（数据未展示）。以上结果表明，菌株 S8797 具有潜在促生能力。
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图2 菌株 S8797 的促生指标测定
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注：A 为解无机磷测定；B 为水解钾；C 为产纤维素酶测定；D 为产 NH3 测定。
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2.3 菌株 S8797 的系统鉴定
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菌株 S8797 在 LB 培养基上的菌落呈黄色，圆形，表面光滑、湿润，边缘整齐，最适生长温度为 28℃。为进一步确定菌株 S8797 的分类地位，本研究利用 16S rDNA 序列进行系统进化分析。将 S8797 的 16S rDNA 的序列提交至 GenBank，获得序列号 PP577625。16S rDNA 序列进化分析显示菌株 S8797 与 P. dispersa DSM 30073T 亲缘关系较近[27]，相似性为 100%。系统发育分析与 P. dispersa DSM 30073T 聚为一支（图3A）。
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图3 菌株 S8797 系统进化树
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注：A 为基于 16S rDNA 序列构建系统发育树；B 为基于看家基因（16S rDNA、ropB、ropD、gyrB）构建系统发育树。
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对菌株 S8797 进行基因组草图测序，并提交 GenBank，获得序列号 PRJNA1095643。从基因组中分析获得 rpoB、rpoD 和 gyrB 看家基因序列，并结合 16S rDNA 序列进行多基因串联分析，基于 EzBioCloud 中的比对分析结果构建系统进化树（图3B）。结果同样表明，菌株 S8797 与 P. dispersa DSM 30073T 亲缘关系最近。菌株 S8797 与 P. dispersa DSM 30073T 的平均遗传相似度（ANI）为 98.1%， DDH（DNA-DNA 杂交）相似性为 81.8%，均大于细菌种水平的分类阈值。综合以上结果，将菌株 S8797 鉴定为分散泛菌（表2）。
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注：ANI 为平均遗传相似度；DDH 为 DNA-DNA 杂交。
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2.4 菌株 S8797 的基因组特征与次级代谢物合成基因簇分析
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菌株 S8797 基因组大小约为 4861934 bp，GC含量为 57.44%，包含编码基因 4399 个以及非编码基因 81 个（表3）。为进一步探索菌株 S8797 的生防促生潜力，利用在线预测软件 antiSMASH 对 S8797 菌株基因组中的次级代谢产物合成基因簇进行预测。在“relaxed”标准下，预测得到 6 个潜在次级代谢产物生物合成基因簇，结果见表4，注释到的基因簇包括氧还辅因子（Redox-cofactor）、芳基多烯（Arylpolyene）、硫肽（Thionpeptide）、萜烯（Terpene）、酰基氨基酸（Acyl_amino_acids） 和金属铁载体（NRP-metallophore）。相似度查询发现，有 3 个和已知生物合成基因簇相似度超过 50%，其中萜烯生物合成基因簇与来自肠杆菌科细菌菌株 DC416 中的类胡萝卜素（Carotenoid）生物合成基因簇的相似性为 100%。金属铁载体生物合成基因簇与来自 Yersinia frederiksenii ATCC 33641 中的 Frederiksenibactin 生物合成基因簇的相似性为 84%。芳基多烯生物合成基因簇与来自 Escherichia coli CFT073 的 APE EC 生物合成基因簇的相似性为 89%。已有研究证明，萜烯、金属铁载体和芳基多烯具有能够抗菌和促进植物生长的作用。
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2.5 菌株 S8797 对烟草的促生作用
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待烟草生长 30 d 后进行生物指标测定。结果如图4 所示，菌株 S8797 菌悬液灌根处理后的烟草株高长势旺盛（图4A），平均株高达到 24.25 cm，显著高于对照组株高（16.9 cm）（图4B）。由此可见， S8797 对烟草具有较好的促生效果。
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图4 菌株 S8797 的烟草促生能力的测定
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注：** 表示存在极显著性差异（P<0.01）。
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2.6 菌株 S8797 对烟草青枯病的盆栽防效
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在接种病原菌后开始观察植株发病情况，茄科雷尔氏菌灌根的植株从第 3 d 开始出现萎蔫，预先灌根 S8797 的植株在第 7 d 开始出现萎蔫；接种 17 d 后，病原菌处理组中植株全部萎蔫，统计发病植株数和病情严重度。发病对照组与健康对照组相比，植株明显发病萎蔫，而健康对照组长势良好，无病害症状出现（图5）。进一步计算各处理发病率和病情指数，发现菌株 S8797 悬液灌根预处理可以显著延迟烟草青枯病发病时间，降低病害发生程度，温室防效达到 55.0%（表5），具有很好的生防效果。
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图5 菌株 S8797 对烟草青枯病防病的盆栽测定
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注：数据以平均值 ± 标准误表示；不同小写字母表示在 P<0.05 水平上差异显著。
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3 结论与讨论
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本研究从烟草种植区分离得到一株分散泛菌，通过平板活性检测发现具有广谱、高效的拮抗能力，尤其对烟草茄科雷尔氏菌抑制效果最佳，温室防效可达 55.0%。该菌株还具有溶磷、解钾、产纤维素酶和产 NH3 的能力，并且能够促进烟草的生长。泛菌在自然界中广泛分布，具有功能多样和适应性强的特点。尽管部分泛菌被鉴定为机会致病菌，但分散泛菌种内多数菌株具有植物益生功能。有研究表明，从猪笼草植物中分离的分散泛菌对瓜果腐霉菌具有拮抗活性，还可以防治石蒜上的瓜腐病[28]。Kouzai 等[10] 从水稻种子中分离的 P. dispersa BB1 能够产生抗菌化合物抑制水稻中病原菌 Burkholderia glumae 的生长。本研究分离出的分散泛菌 S8797 具有拮抗烟草茄科雷尔氏菌、水稻白叶枯病菌、番茄细菌性溃疡病菌、十字花科黑腐病菌、细菌性果斑病菌、西瓜细菌性果斑病菌以及烟草疫霉菌、西瓜枯萎病菌、烟草黑腐病菌、水稻恶苗病菌和小麦茎基腐病菌的能力，并能够很好地防治烟草青枯病。
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分散泛菌作为多种植物中的内生菌，具有固氮和促生功能，与多种植物相容性好，根际适应性强[8-9]。已有报道发现，分散泛菌可以通过产生 IAA、铁载体以及其他多种植物激素促进小麦[29]、玉米[30]的生长。本研究中分散泛菌 S8797 不仅具有水解无机磷、产纤维素酶、解钾、产 NH3、产 IAA 的能力，通过温室盆栽证实该菌株还能够显著促进烟草的生长。这些结果表明，该菌株可能通过提高土壤中难吸收营养元素的转化，提高植物根部吸收效率进而促进植物生长。对菌株 S8797 的基因组挖掘分析，发现该菌株潜在的 6 个次级代谢合成基因簇（表4）。其中含有一个非核糖体肽 NRP-metallophore，并与 Frederiksenibactin 的相似性较高。Frederiksenibactin 是一种新型的铁载体[31]，细菌等分泌的铁载体具有通过铁竞争等作用防治植物病害和促进植物营养吸收的双重功效[32]。芳基多烯生物合成基因簇与 APE EC 的生物合成基因簇的相似性较高。APE 通常存在于宿主相关的细菌中，它通过清除由紫外线、抗生素和宿主免疫反应产生的活性氧，从而减少宿主对细菌的有害影响，增强细菌的适应性[33]。以上表明，菌株 S8797 能够拮抗病原菌以及促进植物生长，可能与非核糖体肽和芳基多烯有关。
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分散泛菌次级代谢产物的研究鲜有报道，目前已报道的分散泛菌次级代谢产物合成基因簇有芳基多烯和非核糖体肽合成酶 NRPS 两种[33]，而在本研究中还预测到分散泛菌 S8797 产生 Redox-cofactor、 Hserlactone、Terpene、Acyl_amino_acids 这 4 个家族，但目前尚未有研究报道。这些次级代谢产物是否具有抑制病原菌和促进植物生长的作用还有待进一步研究。综上所述，菌株 S8797 的拮抗和促生功能研究表明，该菌株是一株极具潜力的多功能有益菌株，具有生防制剂和微生物肥料开发价值。
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摘要
从遵义市烟草青枯病和黑胫病常发地块分离到一株具有防病促生功能的菌株 S8797。该菌株能够有效拮抗茄科雷尔氏菌、烟草疫霉菌等 12 种植物病原菌，并具有溶解无机磷、解钾、产纤维素酶和产 NH3 的能力。通过 16S rDNA 和多基因序列系统发育分析和平均核苷酸一致性分析，将菌株 S8797 鉴定为分散泛菌（Pantoea dispersa）。菌株 S8797 基因组为 4.86 Mb，不含质粒，GC 含量为 57.4%，包含编码基因 4399 个以及非编码基因 81 个，利用 antiSMASH 可预测得到 6 个潜在的次生代谢产物合成基因簇。生物测定结果表明，菌株 S8797 可以有效防治烟草青枯病，室内盆栽防效达到 55.0%。S8797 菌悬液处理的烟草长势旺盛，株高显著高于 MgCl2 溶液对照处理。结果表明，分散泛菌 S8797 具有广谱拮抗植物病原菌的能力，对烟草具有防病促生的潜力，同时为泛菌生防菌剂和微生物肥料开发奠定了基础。
Abstract
A bacterial strain S8797 was isolated from frequent occurrence sites of tobacco bacterial wilt and black shank diseases in Zunyi. This strain exhibited significant disease control and growth-promoting capabilities. It effectively antagonized 12 plant pathogens including Ralstonia solanacearum and Phytophthora nicotianae. Moreover，it demonstrated abilities in dissolving inorganic phosphorus，potassium solubilization，cellulase enzyme production，and NH3 production. Through analysis utilizing 16S rDNA，multigene sequence phylogenetics，and average nucleotide identity，strain S8797 was identified as Pantoea dispersa. The genome size of S8797 was determined to be 4.86 Mb without any plasmids，with a GC content of 57.4%. It comprises 4399 coding genes and 81 non-coding genes. Furthermore，the prediction using antiSMASH revealed the presence of 6 potential secondary metabolite biosynthetic gene clusters. Biological assays demonstrated that strain S8797 effectively controlled tobacco bacterial wilt，achieving a control efficacy of 55.0% in pot experiments. Tobacco plants treated with S8797 suspension exhibited vigorous growth，with significantly greater height compared to the control. These results highlighted the broad-spectrum antagonistic capabilities of Pantoea dispersa S8797 against plant pathogens，indicating its potential in disease control and growth promotion in tobacco，meanwhile laid the groundwork for the development of Pantoea-based biocontrol agents and microbial fertilizers.