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青藏高原是我国主要的牧区之一，饲养着大量畜禽。在这些畜禽中羊占比最大，其中 2021 年年末存栏数超过 2300 万头[1]。这些羊在集中圈养的情况下每年可产生大量羊粪。这些羊粪已成为病原体和抗生素的重要来源，对牧场周边空气、土壤和地下水造成污染，并对牧场工作人员和动物的健康构成威胁[2]。因此，合理处置和利用这些有机废弃物对青藏高原的生态建设和可持续发展具有现实意义。
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畜禽粪便通常氮含量和水分含量高，如果直接进行堆肥，会造成发酵速度慢，产品成熟度低[3]。添加调理剂是提高畜禽粪便堆肥发酵效率、改善堆肥质量的有效途径，其主要机制是调节原料的碳氮比（C/N）和孔隙度，改善微生物发酵环境[4-7]。然而，调理剂的添加效果与原料的性质和堆肥地点的气候密切相关。青藏高原气候条件恶劣，极寒低氧，这一气候特征与其他地区有很大不同，这意味着其他地区添加调理剂的研究结果可能不适用于青藏高原。
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畜禽粪污含有较多细菌、病毒和寄生虫等致病性病原体，如大肠杆菌、沙门氏菌、李斯特菌、分枝杆菌和弓形虫等[8]。这些病原体很可能造成人畜传染病，导致腹痛、腹泻、呕吐、伤寒、败血症、肠胃炎和肺炎等疾病[9-11]。如果携带大量病原体的畜禽粪便不能合理利用，会对人体健康和生态安全造成威胁。另外，我国抗生素使用量巨大，已被广泛用于畜牧养殖业[12]。由于这些抗生素在动物体内不能被完全吸收代谢，很大比例（30%～90%） 以原药或代谢产物形式随粪污排出，将会经过多种途径威胁自然环境和人体健康[13-15]。堆肥可在一定程度上消杀和去除病原体、抗生素，被认为是实现畜禽废弃物无害化的最佳方式之一[16-17]。目前，还没有调理剂添加比例对青藏高原羊粪堆肥的病原菌和抗生素去除的研究。
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基于此，本研究选取油菜秸秆作为调理剂，羊粪与油菜秸秆分别以 5∶1、4∶1、3∶1 和 2∶1 进行混合，以不添加油菜秸秆作为对照，进行为期 36 d 的堆肥试验。通过测定堆肥过程中温度、含水率、pH、电导率、C/N 和种子发芽指数（GI）等指标，研究油菜秸秆添加比例对青藏高原羊粪堆肥发酵品质的影响。该研究进一步测定了堆肥过程中大肠菌群和沙门氏菌数量以及多种抗生素浓度的变化，用以探究油菜秸秆添加比例对堆肥安全性的影响，以期为青藏高原畜禽粪便高效利用和无害转化提供理论依据和技术支撑。
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1 材料与方法
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1.1 试验原料
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堆肥主要原料为羊粪，取自青海省海南藏族自治州共和县巴卡台农牧场羊舍，海拔 3300 m 左右，用塑料铲取羊舍表层羊粪，经春季自然干燥后混合均匀。油菜秸秆为调理剂，取自于巴卡台农牧场农田，风干后粉碎至 1 cm。供试羊粪和油菜秸秆理化性质见表1。
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1.2 试验设计与样品采集
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将羊粪和油菜秸秆分别以干重为 5∶1、4∶1、 3∶1 和 2∶1 的比例混合，然后调节初始含水率为 60% 进行堆肥试验，分别记为 RS1、RS2、RS3 和 RS4，以不添加油菜秸秆作为对照组，记为 CK。堆肥地点在青海省巴卡台农牧场，堆体采用长、宽、高为 2 m×1 m×0.6 m 的条垛式，堆肥周期为 36 d。在堆肥前 24 d，各处理每 4 d 进行 1 次翻堆补水，每次补水至 60%。分别于 0、6、12、18、24、30 和 36 d 在堆肥堆体的不同深度采集多点样品混匀。样品分为两份，一份鲜样于 4℃保存，另一份风干研磨过 1 mm 筛后备用。
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1.3 指标测定
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温度、含水率、pH 和电导率的测定参考蔡瑞等[18]的方法，具体为每天 9：00、16：00 测量堆体温度，将温度计均匀插入堆体上、中、下层各 5 个位置，计算 15 个位置的平均温度；使用鼓风干燥机（DHG-9123A 型）在 105℃下烘干样品至恒重，根据烘干前后质量差计算堆肥含水率；将新鲜堆肥样品用去离子水以固液比为 1∶10 浸提 3 h 后过滤，分别用 pH 计（瑞士梅特勒-托利多 S20 型）和电导率仪（雷磁 DDB-303A 型）测定 pH 和电导率。总有机碳（TOC）采用重铬酸钾容量法测定[19]；总氮（TN）采用凯氏定氮法测定（KDY-9830 型凯氏定氮仪）。取堆肥浸提液 20 mL 于 9 cm 的培养皿中，并垫上滤纸，向浸提液中添加 20 颗小白菜种子，于 20℃的黑暗条件下培养 48 h 后测定种子发芽率和根长，参考 Arias 等[20]公式计算 GI。
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沙门氏菌计数参考粪便无害化卫生要求的国家标准（GB 7959—2012）[21]中提供的方法，大肠菌群计数参考有关微生物学检验的国家标准（GB 4789.3—2016）[22]中提供的方法，抗生素浓度测定参考 Cai 等[1]的方法。
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1.4 数据统计分析
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利用 SPSS 23.0 进行数据处理，数据以平均值 ± 标准差表示，并对堆肥第 36 d 的试验数据进行单因素方差分析，利用 Origin 2021b 进行作图。 P<0.05 表示差异显著。
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2 结果与分析
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2.1 堆肥过程中温度的变化
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如图1 所示，所有处理的温度在堆肥初期快速上升，其中 RS1、RS2、RS4 和 CK 在堆肥第 2 d 的温度超过 50℃，而同期 RS4 为 47.6℃。随后所有处理进入高温期。RS2 和 RS3 的升温速度和高温 （>50℃）持续时间均优于其他处理，它们的高温期分别为 14 和 15 d，最高温分别为 67.1 和 66.1℃； RS1 在堆肥第 2～11 d 维持高温状态，并于第 3 d 达到最高温度（63.2℃）；RS1、RS2 和 RS3 的高温期分别比 CK 多 2、6 和 7 d，最高温度分别高 4、 7.9 和 6.9℃。RS4 的高温期仅为 4 d，最高温度为 56.7℃，分别比 CK 少 4 d 和低 2.5℃。经过 16 d 发酵，所有处理的温度均低于 50℃，并呈持续快速下降的趋势。RS2 和 RS3 在堆肥后期的温度低于其他处理，优先进入热稳定状态。
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图1 堆肥过程中温度的变化
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2.2 堆肥过程中含水率、pH 及电导率的变化
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如图2a 所示，所有处理的含水率在堆肥前期快速下降，随后呈先上升后逐渐下降的趋势。堆肥结束时，RS1、RS2、RS3、RS4 和 CK 的含水率分别为 48.9%、50.0%、49.4%、52.1% 和 51.5%。如图2b 所示，所有处理的 pH 值在堆肥前期呈上升趋势，其中 RS2、RS3 和 CK 的 pH 值上升速度快于其他处理。在堆肥中后期，各处理的 pH 值呈下降趋势。堆肥结束时，RS1、RS2、RS3、RS4 和 CK 的 pH 值分别为 7.52、7.50、7.44、7.53 和 7.55，且无显著差异（P>0.05）。如图2c 所示，所有处理的电导率在堆肥前期呈现上升趋势，其中 RS2 和 RS3 的上升趋势显著快于其他处理，而 CK 则慢于其他处理。所有处理的电导率均在堆肥中后期呈先下降后逐渐稳定的趋势。堆肥结束时，RS1、 RS2、RS3、RS4 和 CK 的电导率分别为 2.23、2.16、 2.20、2.16 和 2.17 mS/cm。
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图2 堆肥过程中含水率、pH 值及电导率的变化
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注：不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。下同。
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2.3 堆肥过程中总有机碳含量、总氮含量、碳氮比及种子发芽指数的变化
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各处理有机碳含量的变化如图3a 所示，RS1、 RS2、RS3、RS4 和 CK 在堆肥第 0 d 的 TOC 含量分别为 420.1、428.2、437.1、442.9 和 398.1 g/kg，之后各处理的 TOC 含量逐渐下降，其中堆肥初期的 TOC 含量下降速度快于堆肥后期。堆肥结束时，RS1、 RS2、RS3、RS4 和 CK 的 TOC 含量分别为 377.9、 366.8、371.3、406.4 和 366.8 g/kg，分别降低了 10.0%、 14.3%、14.5%、8.24% 和 7.86%。各处理总氮含量的变化如图3b 所示，RS1、RS2、RS3、RS4 和 CK 在堆肥第 0 d 的 TN 含量分别为 21.5、20.1、20.3、18.7 和 24.1 g/kg。随后，各处理的 TN 含量逐渐上升。堆肥结束时，RS1、RS2、RS3、RS4 和 CK 的 TN 含量分别为 24.4、26.4、26.1、23.5 和 26.3 g/kg，且差异显著（P<0.05）。如图3c 所示，各处理的初始 C/ N 存在差异，随着堆肥进行，均呈下降趋势。堆肥结束时，RS1、RS2、RS3、RS4 和 CK 的 C/N 分别为 15.5、13.9、14.2、17.3 和 14.0。图3c 也显示了各处理堆肥产品 C/N 与初始 C/N 的值（T 值），RS2 和 RS3 的 T 值均低于 0.7，而 CK 的 T 值高于 0.8。如图3d 所示，各处理的 GI 值在堆肥初期处于较低水平，均低于 50%。随着堆肥进行，所有处理的 GI 呈上升趋势。堆肥结束时，RS1、RS2、RS3、RS4 和 CK 的 GI 值分别为 93.6%、112.5%、107.1%、86.0% 和 84.5%。统计分析表明，RS2 和 RS3 的 GI 值显著高于 CK（P<0.05），但 RS1 和 RS4 与 CK 之间无显著差异（P>0.05）。
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图3 堆肥过程中总有机碳含量、总氮含量、碳氮比及种子发芽指数的变化
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2.4 堆肥过程中病原菌数量的变化
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如图4a 所示，各处理的大肠菌群数量在堆肥前半段快速下降。随后大肠菌群数量保持稳定状态。堆肥第 36 d，RS1、RS2、RS3、RS4 和 CK 的大肠菌群数量分别为 3.75、3.07、3.45、4.41 和 4.64 log10 cfu/g，去除率分别为 55.2%、62.1%、56.7%、43.1% 和 46.1%。根据统计学分析，RS1、RS2 和 RS3 在堆肥第 36 d 的大肠菌群数量显著低于 CK（P<0.05），RS4 与 CK 无显著差异（P>0.05）。RS2 的大肠菌群去除率显著高于 CK（P<0.05），RS1、RS3 和 RS4 与 CK 间无显著差异 （P>0.05）。如图4b 所示，各处理的沙门氏菌数量的去除率变化趋势与大肠菌群相似。堆肥第 36 d，RS1、 RS2、RS3、RS4 和 CK 的沙门氏菌数量分别为 3.83、 3.58、3.83、4.39 和 4.55 log10 cfu/g，去除率分别为 57.7%、5 9.2%、54.9%、45.8% 和 49.4%。根据统计学分析，RS1、RS2 和 RS3 在堆肥第 36 d 的沙门氏菌数量显著低于 CK（P<0.05），RS4 与 CK 无显著差异（P>0.05）。RS2 的沙门氏菌去除率显著高于 CK （P<0.05），RS1、RS3 和 RS4 与 CK 间无显著差异 （P>0.05）。
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图4 堆肥过程中病原菌数量的变化
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2.5 堆肥过程中抗生素浓度及去除率的变化
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本研究测定了 4 种抗生素在堆肥过程中的变化，分别为四环素、土霉素、青霉素和头孢菌素 C。如图5 所示，5 个处理的初始抗生素浓度存在显著差异，羊粪比例越高，其抗生素浓度就越高。各处理的 4 种抗生素浓度均在堆肥前 18 d 快速下降，这些抗生素在 5 个处理的去除率均超过 69%，其中 RS2 的去除率最高。堆肥中后期，5 个处理的抗生素浓度下降速率减缓。堆肥结束时，RS1、 RS2、RS3、RS4 和 CK 的四环素浓度分别为 35.9、 22.5、25.7、30.7 和 45.2μg/g，去除率分别为 77.1%、 84.4%、81.6%、76.9% 和 73.2%，RS1、RS2、RS3 和 RS4 的去除率均显著高于 CK（P<0.05），RS2 和 RS3 的去除率也显著高于 RS1 和 RS4（P<0.05）； 土霉素浓度分别为 32.0、21.3、27.3、39.3 和 43.1μg/ g，去除率分别为 79.0%、85.1%、80.4%、70.8% 和 71.9%，RS1、RS2 和 RS3 的去除率显著高于 CK （P<0.05），RS4 与 CK 无显著差异（P>0.05），RS2 的去除率显著高于其他处理（P<0.05）；青霉素浓度分别为 38.9、22.7、26.9、35.9 和 42.3μg/g，去除率分别为 78.8%、87.4%、84.4%、78.1% 和 77.9%， RS2 和 RS3 的去除率显著高于 CK（P<0.05），而 RS1 和 RS4 与 CK 则无显著差异（P>0.05）；头孢菌素 C 浓度分别为 37.3、22.6、29.4、34.4 和 51.5μg/ g，去除率分别为 84.8%、90.5%、87.1%、84.1% 和 79.9%，RS1、RS2、RS3 和 RS4 的去除率均显著高于 CK（P<0.05），RS2 的去除率也显著高于 RS1、RS3 和 RS4（P<0.05）。
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图5 堆肥过程中抗生素浓度及去除率的变化
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3 讨论
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3.1 堆肥过程中理化指标及成熟度的变化
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温度是反映堆肥微生物活性和有机质降解情况最重要的指标，高温是实现堆肥无害化的重要保障之一[2]。所有处理的温度在初期迅速上升，这主要是由该阶段堆肥物料中大量易降解有机质降解产热导致的。随着有机质的消耗，堆肥中有机物料的可用性受到限制，各处理的温度均呈下降趋势并趋于稳定，表明堆肥趋于成熟[23]。与不添加油菜秸秆处理相比，当调理剂与羊粪混合比例为 1∶3、1∶4 和 1∶5 时，均能显著促进堆肥升温，延长高温持续时间，当添加比为 1∶2 时，升温效果不佳，说明调理剂添加比例过高不利于青藏高原羊粪堆肥升温，这是因为高比例的调理剂意味着高孔隙率，这将导致堆肥温度的快速损失，该现象在青藏高原等寒冷地区尤为明显。另外，油菜秸秆添加比例过高，将导致堆肥原料的 C/N 较高，不利于微生物的生长和代谢，进而影响堆肥升温[24]。与油菜秸秆和羊粪添加比例为 1∶5 的处理相比，1∶3 和 1∶4 的添加比例升温效果更佳，这说明添加低比例的调理剂也不利于青藏高原羊粪堆肥升温，这是因为低比例的调理剂意味着低孔隙率，这将为堆肥创造一个低氧环境，从而影响好氧微生物的代谢[25]。
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随着堆肥进行，所有堆体水分含量均迅速下降，这主要是因为堆肥的高温促进了堆肥中水分散失[18]。另外，青藏高原干燥的气候特点也加剧堆体水分含量的下降[2]。RS2 和 RS3 处理的水分含量下降速度在堆肥初期快于其他处理，与这两个处理的温度在该阶段高于其他处理密切相关。随后，各处理都进行定期补水，所有水分含量稳定在 48% 以上，保证了堆肥的正常进行。堆肥前期电导率的上升主要是由于微生物降解有机质产生了大量无机盐和小分子有机酸，RS2、RS3 处理在该阶段电导率值上升速度快于其他处理，主要是因为这两个处理在堆肥初期降解有机质产生小分子物质的速度快于其他处理。堆肥中后期，氨气挥发、各种盐离子沉淀以及小分子有机酸的降解导致堆体的电导率值下降。一般认为，农用堆肥的电导率值不超过 3.5 mS/cm 对作物的危害作用较小[26]，所有处理的堆肥产品均符合这项标准，其中添加 20% 或 25% 油菜秸秆处理的效果更好。
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各处理的 TOC 含量在整个堆肥过程中持续下降，这与有机质降解密切相关，而含碳有机物是堆肥有机质的主要组成部分。各处理的 TN 含量逐渐上升，这是因为堆肥中含碳有机物质的持续快速降解，“浓缩效应”造成堆体 TN 含量相对升高[27]。由于不同处理的原料组成存在差异，各处理的原始 TOC 含量、TN 含量和 C/N 均存在差异，羊粪比例越低，其 TOC 含量越高，TN 含量越低，其 C/N 就越高。为避免不同原料 C/N 的差异对判断不同处理成熟度的影响，研究者用堆肥产品的 C/N 与初始 C/ N 的值（T 值）来判断和比较不同处理的成熟度，T 值越低代表堆肥成熟度越高。根据本研究结果，RS2 和 RS3 处理的 T 值低于 0.7，低于其他处理，其中 RS2 处理的 T 值更低。GI 值可用来判断堆肥产品对植物的毒性，是堆肥重要的腐熟指标，其数值随着堆体中有毒物质的分解而增加[28]。堆肥初期，各处理的 GI 值均处于较低水平，这是由于堆肥初期的物料快速降解，产生了大量短链脂肪酸、苯酚以及氨气等对植物种子具有毒害的物质[29]；随着堆肥的进行，毒性物质逐渐被降解、钝化以及挥发等，堆料的植物毒性随之降低，GI 值也随之上升，另外，腐殖类物质在堆肥中后期逐渐上升，这有利于 GI 值上升。堆肥结束时，所有处理的 GI 值均大于 80%，表明所有堆肥产品均达到成熟状态[2，28]。RS2 和 RS3 处理的 GI 值大于 100%，并且显著高于其他处理，表明当羊粪与油菜秸秆添加比例为 4∶1 或 3∶1 时能促进青藏高原羊粪堆肥成熟，改善堆肥产品品质。
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堆肥理化指标的变化表明，当羊粪与油菜秸秆添加比例为 4∶1 或 3∶1 时可显著提升堆肥温度和延长高温期，并显著提高堆肥产品成熟度，而添加过高或过低比例的油菜秸秆不能促进堆肥发酵，甚至其发酵效果差于不添加油菜秸秆。
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3.2 堆肥过程中病原菌数量及抗生素的变化
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5个处理的大肠菌群数和沙门氏菌数在堆肥初期均快速下降，这是因为当堆肥进入嗜热期，堆肥高温杀死大部分病原体和寄生虫[8]，该阶段的氨排放也会增强，氨气透过细胞膜在细胞内发生解离使 pH 升高，进而毒害病原体[30]；另外，堆肥各阶段都存在大量细菌和真菌，这些微生物可能会产生抗性物质抑制病原体的生长[8]。堆肥中后期，各处理的大肠菌群数和沙门氏菌数保持稳定，说明堆肥降温期和成熟期不利于病原体的去除。本研究表明，无论是堆肥产品的大肠菌群和沙门氏菌数量，还是这两种致病菌的去除率，RS2 和 RS3 处理均优于 RS4 和 CK 处理，这表明添加 20%～25% 油菜秸秆有利于青藏高原羊粪堆肥致病菌的去除。先前的研究也表明，添加 20%～25% 油菜秸秆可显著促进羊粪堆肥产热升温，进而有利于病原体的去除[31]。在本研究中，添加 20% 油菜秸秆的通气和保温效果最有利于堆肥产热和保持高温，这将促进病原体去除。堆肥原料的 C/N 也会影响挥发性脂肪酸及氨的产生，对病原体生存具有严重影响[8，32]。另外，一些研究也表明，合适的 C/N 有利于堆肥中微生物代谢产热，进而达到更好的病原体消杀效果[33]，这也可能是 RS2 具有最好的病原菌去除效果的原因。
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在施肥之前，有必要对动物粪便进行处理和处置，以减少兽用抗生素释放到环境中的数量，并最大限度地减少残留抗生素产生的耐药细菌广泛繁殖的风险[17]。本研究 5 个处理的堆肥原料存在差异，导致它们的抗生素浓度也存在差异。堆肥前期，5 个处理的抗生素浓度均迅速下降，这与该阶段堆肥高温密切相关，因为高温有利于破坏抗生素的结构，促进抗生素的降解[34]。随着堆肥温度下降，5 个处理的抗生素浓度下降趋势急剧减缓。5 个处理中， RS2 的抗生素去除效果最佳，其次为 RS3，这表明添加 20%～25% 油菜秸秆有利于青藏高原羊粪堆肥抗生素的去除。这与病原体去除效果一致，可能是 20% 油菜秸秆的通气和保温效果最有利于堆肥产热和保持高温，进而促进抗生素降解。
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根据羊粪堆肥理化指标和病原体及抗生素去除率的表现，建议添加 20%～25% 油菜秸秆作为青藏高原羊粪堆肥调理剂。
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4 结论
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添加 20%～25% 油菜秸秆能促进青藏高原羊粪堆肥发酵，提升堆肥温度和延长高温期，并提升堆肥产品成熟度。添加 20%～25% 油菜秸秆能促进羊粪堆肥病原体和抗生素去除，其中添加 20% 油菜秸秆的效果更佳。
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摘要
通过分析堆肥理化性质、病原菌及抗生素去除效果，探讨了油菜秸秆添加比例对青藏高原羊粪堆肥发酵品质和堆肥产品安全性的影响。将羊粪与油菜秸秆分别以 5∶1（RS1）、4∶1（RS2）、3∶1（RS3）和 2∶1（RS4） 进行混合，以不添加油菜秸秆作为对照（CK），进行为期 36 d 的堆肥试验。通过测定堆肥过程温度、含水率、 pH、电导率、碳氮比和种子发芽指数等指标，综合分析油菜秸秆添加比例对羊粪堆肥发酵品质的影响。进一步测定堆肥过程中大肠菌群和沙门氏菌数量以及多种抗生素浓度的变化，分析堆肥产品安全性。相较于 CK，RS2 和 RS3 处理能提高堆肥最高温度，分别达 6.6 和 6.9℃，并分别延长高温期（>50℃）6 和 7 d，而 RS4 处理的最高温和高温期均低于 CK；RS2 和 RS3 处理能显著提高堆肥产品种子发芽指数（P<0.05），提升幅度分别达 28.0% 和 22.6%，而 RS4 处理的种子发芽指数与 CK 并未显示出显著性差异（P>0.05）；RS2 和 RS3 处理还能显著提高堆肥大肠菌群和沙门氏菌去除效果，以及促进四环素、土霉素、青霉素和头孢菌素 C 去除（P<0.05）。因此，添加 20% ～ 25% 油菜秸秆能提升青藏高原羊粪堆肥发酵效率，提升堆肥产品品质和生物安全性，其中添加 20% 油菜秸秆的堆肥效果更佳。
Abstract
By analyzing the physical and chemical properties of compost，pathogenic bacteria，and antibiotic removal effects， the effects of rape straw addition ratio on the fermentation quality and safety of sheep manure compost on the Qinghai-Tibet Plateau were discussed. Sheep manure and rape straw were mixed with 5∶1（RS1），4∶1（RS2），3∶1（RS3）and 2∶1（RS4）， respectively，and no rape straw was added as control（CK），and the composting experiment was carried out for 36 days. The effects of temperature，moisture content，pH，conductivity，carbon to nitrogen ratio and seed germination index on the fermentation quality of sheep manure were analyzed comprehensively. The quantity of Coliform and Salmonella and the concentration of various antibiotics during the composting process were further determined to analyze the safety of compost products. Compared with CK，RS2 and RS3 increased the maximum temperature of compost by 6.6 and 6.9℃，respectively，and extended the high temperature period（> 50℃）for 6 and 7 days，respectively，while the maximum temperature and high temperature period of RS4 was worse than that of CK；RS2 and RS3 significantly increased the germination index of compost products（P<0.05）by 28.0% and 22.6%，respectively，while RS4 showed no significant difference with CK（P > 0.05）；RS2 and RS3 also significantly improved the removal efficiency of Coliform and Salmonella，and promoted the removal of tetracycline，oxytetracycline，penicillin and cephalosporin C（P<0.05）. Adding 20%-25% rape straw could improve the fermentation efficiency of sheep manure composting， improve the quality and biosafety of compost products，and the compost effect of adding 20% rape straw was better.