酚酸指其结构中含有芳香酚环、酚羟基和羧基的一类有机酸，是植物中仅次于黄酮类化合物的第二大类次生代谢物^[1]，与植物生长密切相关，也已证实酚酸是根系分泌物中主要的化感自毒物质^[2-3]。当作物连续在同一块地种植时，根系残体和根系分泌的酚酸会逐渐积累在土壤中，达到一定浓度后会引起后续植物产量降低、品质下降、病虫害增加，导致连作障碍的发生。谢越等^[4]采用营养液水培方式研究外加羟基苯甲酸、肉桂酸、阿魏酸、香草醛和水杨酸 5 种酚酸对滁菊生理生化指标的影响，研究表明，100 μmol/L 酚酸可以抑制滁菊幼苗的根长度，减少滁菊可溶性蛋白、可溶性糖、叶绿素 a 和叶绿素 b 含量，降低滁菊植株体内过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和苯丙氨酸降解酶活性，增加了丙二醛含量，从而对滁菊生长产生毒害作用。Meng 等^[5]采用气相色谱-质谱联用法测定了两年半夏根际土壤中酚酸含量，结果表明，种植前、种植中和种植后根际土壤中原儿茶酸、香草酸、香兰素、丁香酸和丁香醛 5 种酚酸含量差异明显，且 5 种酚酸对半夏幼苗生长具有抑制作用，具有较强的化感作用。土壤中酚酸类物质导致的连作障碍问题已成为研究热点^[6-7]。

目前关于酚酸类化合物的检测已有很多报道，吕海涛等^[8]采用高效液相色谱法检测苹果汁中 6 种酚类物质；吴娆等^[9]采用磁性羧基化多壁碳钠米管净化，结合高效液相色谱-串联质谱法，建立了紫苏籽油中 11 种酚类化合物的定量测定方法。马帅等^[10]建立了花椰菜和西兰花样品中 23 种酚酸类化合物的超高效液相色谱-串联质谱同时测定分析方法。液相色谱-串联质谱法因灵敏度高，分析时间短，定量准确等优点，近年来已成为酚酸类化合物的主要分析方法^[11-13]。但目前涉及的检测对象主要为植物源性产品，而关于土壤中酚酸类物质的检测研究较少。这是由于土壤基体复杂，土壤中有机质、腐植酸、金属氧化物等各种成分对酚酸有吸附和络合作用，导致其在土壤中提取难度较大。杜家方等^[14]采用搅拌振荡提取，以蒸馏水为提取溶剂，测定了不同间隔年限地黄土壤中 5 种酚酸类物质，结果表明，间隔 2、4、6、8 年的再植地黄土壤中，阿魏酸、对羟基苯甲酸、香草酸、香豆酸和丁香酸的总含量分别为 1.503、1.323、0.700 和 0.340 μg/g。伍丽华等^[15]以甲醇为提取溶剂，结合涡旋振荡提取杉木林土壤酚酸，检测结果表明，在液相色谱质谱联用仪正负离子模式下，共检测出 15 种酚酸类物质，且随着土层深度加深，酚酸类物质含量总体呈下降趋势。但目前科学研究已表明，酚酸在土壤中仅少量以游离状态存在，绝大部分与土壤中有机质等结合，以结合态形式存在于腐殖质中，仅以蒸馏水或简单有机溶剂提取，可能无法将土壤中结合态酚酸提取彻底，导致检测结果偏低。因此，本研究采用氢氧化钠溶液作为提取剂，超声辅助提取，盐酸酸化沉淀胡敏酸，以 HSS T3 色谱柱为分离柱，建立了土壤中 4-羟基苯甲酸、水杨酸、肉桂酸等 14 种酚酸同时测定的 UPLC-MS/MS 快速分析方法。该方法操作简单，准确度和灵敏度较高，成功应用于土壤样品中酚酸类化合物的检测分析，为开展土壤中由酚酸导致的作物连作障碍研究提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

I Class-Xevo TQ-S micro 超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪（美国 Waters 公司）；5804R 型低温离心机（德国 Eppendorf 公司）；SK25200H 超声波清洗器（宁波新芝生物科技有限公司）；Auto EVA80 全自动平行浓缩仪（福建 RayKol 公司）AR5120 百分位天平（美国 Ohaus 公司）；Acquity UPLC HSS T3 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美国 Waters 公司）。

乙酸乙酯、乙腈（HPLC 级，德国 Merck 公司）；氢氧化钠（AR 级，国药集团化学试剂有限公司）；盐酸（AR 级，质量分数为 37%，国药集团化学试剂有限公司）；甲酸（MS 级，德国 CNW 公司）；苯甲酸、4-羟基苯甲酸、水杨酸、肉桂酸、香草酸、阿魏酸、绿原酸、没食子酸、香豆酸、丁香酸、原儿茶酸、芥子酸、咖啡酸和对香豆酸（均为分析级标准品，纯度≥ 98%，上海源叶生物科技有限公司）；实验用水为超纯水（18.2 MΩ·cm）。

1.2 标准溶液配制

1.2.1 单标储备液

分别准确称取 0.01000 g 酚酸单标固体至 10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至 10.0 mL 刻度，即配成 1.0 mg/mL 的酚酸单标储备液，-18℃保存。

1.2.2 混合标准储备液

准确移取酚酸单标溶液各 0.10 mL 至 10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至 10.00 mL，4℃保存，此混合标准储备液的浓度为 10 μg/mL。

1.2.3 混合标准工作液

将混合标准储备液用甲醇逐级稀释，配制成 5、10、50、100、200、500、1000、2000 和 5000 μg/L 的 14 种酚酸混合标准工作液，现配现用。

1.3 样品前处理

称取 2 g（精确至 0.01 g）土壤样品于 15 mL 离心管中，加入 5 mL 1 mol/L NaOH 溶液，涡旋混匀，置于超声波清洗器中超声提取 30 min，10000 r/min 离心 5 min，用 5 mL 巴氏吸管小心吸取上层清液于另一 15 mL 离心管，用 3 mol/L 盐酸调节 pH 值至 2.5 左右，加入 3 mL 乙酸乙酯涡旋萃取 2 min，10000 r/min 离心 5 min，乙酸乙酯层转入 10 mL 离心管； 用 3 mL 乙酸乙酯重复萃取 1 次，合并乙酸乙酯溶液，置于氮吹仪中将溶剂吹干，用初始流动相定容至 5.00 mL，过 0.22 μm 有机滤膜，供 UPLC-MS/MS 分析，过程详见图1。每个样品做 3 个重复。

1.4 UPLC-MS/MS 条件

色谱柱：Waters Acquity UPLC HSS T3 色谱柱 （100 mm×2.1 mm，1.7μm）；流动相：A 为 0.01% 甲酸水溶液，B 为乙腈。梯度洗脱程序：0～0.2 min，90%A；0.2～2.5 min，90%A～2.0%A；2.5～3.5 min，2.0%A；3.51～5.00 min，90%A； 柱温： 40℃；流速：0.4 mL/min；进样量：1 μL。

离子化模式：电喷雾电离，负离子模式（ESI-）； 质谱扫描方式：多反应监测（MRM）；毛细管电压：2.5 kV；脱溶剂气流量：1000 L/h；锥孔气流量：50 L/h；离子源温度：120℃；脱溶气温度： 500℃；其他质谱参数，包括定量和定性离子对、锥孔电压及碰撞能量（表1）。

注：* 代表定量离子。

2 结果与分析

2.1 提取剂种类

土壤样品中酚酸的提取效果直接影响其测定结果和后续分析。土壤中酚酸主要以游离态、与金属离子络合成酚酸盐、与糖、多肽等结合形成酚酸酯形式。研究者通常采用甲醇^[15-16]、二氯甲烷^[17]、氢氧化钠溶液^[7，18]作为提取剂。本研究选取一份连作 3 年的土壤样品，分别比较甲醇、甲醇-水 （70∶30，v/v）和 0.5 mol/L NaOH 溶液对其中酚酸的提取效果，结果表明，当采用甲醇或甲醇-水溶液提取时，14 种目标酚酸均未检出，而当采用 0.5 mol/L NaOH 溶液提取时，苯甲酸、水杨酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸等多种酚酸均有检出，说明土壤中酚酸很少以游离分子形式存在，大多与高分子有机物或矿物表面共价连接，以结合态形式存在，这与 Malá等^[19]得出的结论一致，因此，土壤中酚酸通常采用强碱性溶液（氢氧化钠溶液）进行提取。本研究选取一份本底酚酸含量较高的土壤样品，比较 0.1、0.5、1.0 和 3.0 mol/L NaOH 的提取效果，每种提取液浓度样品做 3 个重复。结果表明，当 NaOH 浓度由 0.1 mol/L 增大到 1.0 mol/L 时，目标化合物峰面积逐渐增大，而 NaOH 浓度增大到 3mol/L 时，目标化合物峰面积显著降低（图2）。最终选择 1.0 mol/L NaOH 溶液作为提取溶液。

2.2 提取方式的优化

比较了超声和振荡两种方式提取土壤中酚酸的效果。选择同一份本底酚酸含量较高的土壤样品，分别称取（2.00±0.02）g 样品，加入 5 mL 1.0 mol/L 的 NaOH 溶液，分别采用超声（40 kHz，30 min） 和振荡（10000 r/min，30 min）提取，每种提取方式做 3 个重复。结果显示，采用超声提取时，14 种酚酸的峰面积均优于振荡提取，这与酚酸在土壤中的存在形态密切相关，酚酸与土壤中有机物缩合，萃取难度大，需要借助强有力的超声波产生的空化作用破坏土壤酚酸与土壤有机物的相互作用，从而达到快速释放酚酸的目的。因此，选择超声方式提取土壤中的酚酸物质。

2.3 液相色谱-质谱条件的优化

电离模式直接影响化合物的响应值和稳定性。采用适量浓度的酚酸标准品溶液，在 MS Tune 界面，通过蠕动泵注射将单个标准品注入质谱仪，通过调整质谱各项参数，比较 ESI⁺ 和 ESI^- 离子模式下准分子离子响应情况，最终发现，14 种酚酸化合物即可获得[M-H]^- 准分子离子峰，也能得到 [M+H]⁺ 准分子离子峰，但负离子模式下，准分子离子峰稳定且响应值明显高于正式子模式下准分子离子峰，因此，最终电离模式选用负离子模式，具体条件参数见表1。

进一步对流动相组成及色谱柱种类等色谱条件进行优化。目前液相色谱-质谱联用测定酚酸的流动相普遍采用乙腈-水体系^[12-13]。本研究继续采用乙腈-水体系，实验结果发现，采用水-乙腈作为流动相时，阿魏酸、芥子酸和肉桂酸色谱峰形严重拖尾。由于酚酸结构中的羟基和羧基易发生电离，在水溶液中极性较大，而加入一定量的酸性调节剂，抑制酚酸的电离，降低极性，让其以分子形态存在，增强其在色谱柱上的保留，改善峰形。本研究以易挥发甲酸为酸调节剂，分别选取不同浓度 [0.01%、0.05% 和 0.1%（v/v）]甲酸水溶液作为流动相时的分离效果。实验结果表明，添加甲酸溶液后，阿魏酸、芥子酸和肉桂酸化合物峰形对称，但随着甲酸浓度增大至 0.1%，所有目标化合物响应逐渐降低，因为负离子模式下，添加甲酸溶液会进一步抑制化合物的电离，因此，最终选择 0.01% 甲酸水溶液-乙腈作为流动相。优化后 14 种目标化合物的 MRM 色谱图见图3。

2.4 方法性能评价

2.4.1 线性范围、标准曲线和检出限

根据土壤中 14 种目标酚酸的浓度水平及最优的 UPLC-MS/MS 条件下各目标化合物的响应情况，配制 5、50、100、200、500、1000、2000 和 5000 μg/L 的混合系列标准溶液，用于标准曲线的制作，在设定的色谱-质谱条件下，14 种化合物线性关系良好，相关系数均大于 0.995。将基质加标样品逐级稀释，以 3 倍信噪比（S/N=3） 计，检出限为 0.3～12.5 μg/kg，以 10 倍信噪比 （S/N=10）计，定量限为 1.0～39.2 μg/kg，结果见表2。

2.4.2 回收率和精密度

在 2 g 土壤（空白）基体中分别进行高、低浓度（500、50 μg/kg）加标回收实验，每个添加浓度重复测定 6 次，考察方法的回收率和精密度 （表3）。结果表明，在高、低加标浓度下，14 种酚酸类化合物的回收率分别为 78.6%～97.3% 和 65.8%～89.7%，相对标准偏差分别为 1.2%～4.3% 和 3.1%～9.6%。

2.5 实际样品测定

采用优化后的方法对 12 份不同种植年限茶园土壤样品进行测定，结果表明，苯甲酸、水杨酸、对羟基苯甲酸、肉桂酸、香草酸和阿魏酸均有检出，6 种酚酸的平均浓度分别为 1015.9、1342.9、 1308.7、249.5、3340.5 和 634.9 μg/kg。实验表明，本方法的灵敏度、检出限和精密度等参数能够满足土壤中酚酸检测要求。

3 结论

本研究建立了超高效液相色谱-串联质谱法快速测定土壤中苯甲酸等 14 种酚酸分析方法，样品经 NaOH 碱解，超声辅助提取，盐酸酸化沉淀胡敏酸，乙酸乙酯萃取富集目标化合物。14 种酚酸组分的检出限为 0.3～12.5 μg/kg，定量限为 1.0～39.2 μg/kg，高、低浓度加标回收率分别为 78.6%～97.3% 和 65.8%～89.7%，相对标准偏差分别为 1.2%～4.3% 和 3.1%～9.6%。该方法前处理简单、快速，灵敏度高，重现性好，适用于大批量土壤样品中酚酸类组分快速同时检测，为研究药用植物、果蔬、林木等行业生产过程中因土壤中酚酸类化合物引起的连作障碍提供技术支持。

参考文献