摘要
为了探讨土壤酸化、氨氧化细菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA）对生物炭和氮肥配施的响应，以连续 10 余年种植咖啡的土壤为研究对象，设置不同生物炭用量和氮肥配施的土壤培养试验。结果表明：生物炭配施氮肥缓解土壤 pH 下降，土壤交换性 Al3+ 含量降低，总有机碳含量显著增加；AOB 相对丰度高于 57%，是主要氨氧化微生物类群；生物炭配施氮肥后 AOB 和 AOA 的总数、多样性和丰富度均显著提高，以占烘干土重 10% 生物炭和氮肥配施效果最好。生物炭可以降低土壤酸度、丰富土壤氨氧化微生物多样性和群落结构，在实际生产中可优先考虑生物炭和氮肥配施模式。
Abstract
To explore the response of soil acidification，ammonia-oxidizing bacteria（AOB），and ammonia-oxidizing archaea（AOA）to the combined application of biochar and nitrogen fertilizer，soil culture experiment with different amounts of biochar and nitrogen fertilizer was conducted with the soil that had been planted with coffee for more than ten consecutive years. The results showed that the combined application of biochar and nitrogen fertilizer alleviated the decrease in soil pH，reduced the content of exchangeable Al3+ in the soil，and significantly increased the total organic carbon content. The relative abundance of AOB was higher than 57%，which was the main ammonia-oxidizing microorganisms. The total number， diversity，and richness of AOB and AOA were significantly increased by biochar application combined with nitrogen fertilizer，with the best effects observed at a combined application of 10% biochar by dry soil weight and nitrogen fertilizer. Biochar could reduce soil acidity and enrich the diversity and community structure of soil ammonia-oxidizing microorganisms. Thus，the combined application of biochar and nitrogen fertilizer should be given priority in practical production.
Keywords
土壤酸化是土壤退化的重要原因之一。我国农田土壤酸化程度和酸化面积在扩大[1-2]。随着化肥零增长等措施的有效执行，近 10 年来我国农田土壤 pH 下降趋势有所放缓[3]，但南方地区土壤酸化问题依然严峻[4]。云南省咖啡种植面积及产量占全国的 98% 以上[5]，但主产区超过 50% 的土壤 pH 为 4.5～5.5[6]，低于适宜 pH 5.5～6.5[7]，其中保山市潞江镇和德宏州芒市咖啡种植土壤酸缓冲能力较弱[8]。
生物炭是农业废弃生物质在无氧或低氧条件下经高温热裂解炭化后形成的产物，能改善土壤阳离子交换量和交换性盐基离子等土壤酸敏感性指标[9-10]，还能调节作物根际土壤 pH 和氨氧化菌群的结构和丰度，影响土壤的硝化作用[11-12]。长期过量施用氮肥是土壤酸化的主要驱动机制[13]，明晰氨氧化微生物丰度和群落组成与土壤酸化的关系是正确使用生物炭和（或）氮肥以及合理调整土壤氮素养分状况的重要基础。本研究采集了云南省保山市隆阳区潞江镇种植咖啡 10 余年的土壤，设置氮肥配施不同用量生物炭土壤培养试验，以期明确氮肥与生物炭配施对咖啡种植土壤性质和氨氧化微生物的影响，为生物炭合理施用及云南咖啡种植土壤质量提升提供参考。
1 材料与方法
1.1 供试材料
供试土壤采自云南省保山市潞江镇芒棒村 （25°1′58″N，98°49′35″E），潞江镇位于云南省西部，地处高黎贡山山脉南端东麓，怒江大峡谷末端，为典型的亚热带干热河谷气候，光照充足，终年无霜。采样地种植咖啡 10 余年，海拔 1020 m，本区域地带性土壤为山地红壤。以“S”形取样法采集 0～20 cm 表层土壤，风干后过 2 mm 筛备用。供试土壤的有机质含量 25.4 g/kg，水解性氮含量 84.7 mg/kg，有效磷含量 81.6 mg/kg，速效钾含量 457 mg/kg，土壤 pH 为 5.45，交换性 H+ 含量 0.52 cmol/kg，交换性 Al3+ 含量 1.71 cmol/kg，土壤电导率（EC）1.04 mS/cm。供试生物炭原料为酒渣，购置自一地一方农业科技有限公司，生物炭裂解温度 700℃，过 1 mm 筛备用。生物炭 pH 为 7.36，C、 H、N 元素含量分别为 635、12.8、20.0 g/kg，生物炭孔隙结构见图1。
图1生物炭电镜扫描图
1.2 试验处理
试验设置 4 个处理：不施氮肥和生物炭处理为对照（N0）；施氮肥不施生物炭处理（NN）；施氮和配施烘干土重 2.5% 生物炭处理（NB0.025）；施氮和配施烘干土重 5% 生物炭处理（NB0.05）；施氮和配施烘干土重 10% 生物炭处理（NB0.1）。土壤培养试验于 2022 年 4 月中旬至 10 月中旬在云南大学农学院步入式气候箱内（Conviron BDW40，加拿大）进行，氮素用量根据耕层土壤重量（按容重 1.15 g/cm3，耕层深度 20 cm 计算）和当地田间试验推荐量（N 150 kg/hm2）[14]换算，为 N 65 mg/kg（尿素，N 含量 46%），肥料及生物炭分别与土壤混匀后分层放入培养瓶中培养。培养瓶内装土质量 0.50 kg（烘干土重），稍压实，使各处理容重为 1.15 g/cm3，重复 4 次。调节土壤含水量至 45% 土壤最大持水量，用透气保水膜封口，于 25℃ 黑暗条件下预培养 1 周以激活微生物，预配养结束后调节土壤含水量为土壤最大持水量的 85%，每隔 2～3 d 用称重法补充不足的水分，在 25℃ 黑暗条件下培养 30、90 和 180 d 后采集土壤备用。
1.3 土壤性质及氨氧化微生物分析
土壤 pH：水土比 5∶1，pH 仪（inoLab pH7300，德国）测定；EC：水土比 5∶1，电导仪（上海雷磁）测定；交换性 Al3+、H+：氯化钾交换-中和滴定法；总有机碳（TOC）：称取过 0.15 mm 筛土壤样品 0.0100 g 于锡箔片样品舟中，加入稀盐酸 （0.5 mol/L）1～2 滴充分反应，用 TOC 仪（Elementar vario TOC select，德国） 测定； 可溶性有机碳 （DOC）：称取 5 g 鲜土按水土比 5∶1 混合，25℃ 振荡 30 min，5000 r/min 离心 15 min 后过 0.45 μm 滤膜，滤液用 TOC 仪测定，同时测定土壤含水量。土壤最大持水量：过 0.85 mm 筛的混合不同用量生物炭的风干土样 20.00 g 置于用棉球塞住的漏斗中，加去离子水浸泡 2 h，加盖，除去棉塞，让水分自由下渗，放置过夜后，测定的土壤质量含水量作为土壤最大持水量。
土壤微生物总 DNA 提取和 PCR 扩增及测序：土壤微生物基因组 DNA 提取试剂盒（DP336，天根生化科技有限公司，北京）进行土壤微生物基因组 DNA 的提取。利用微量紫外分光光度计（Nanodrop 8000，Thermo，美国）和 1% 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的浓度和纯度。利用 AOB-F/AOB-R （5′-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3′/5′-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3′）[15]，AOA-F/AOA-R（5′-GACTACATMTTCTAYACWGAYTGGGC-3′/5′-GGKGTCATRTATGGWGGYAAYGTTGG-3′）扩增引物[16]进行氨氧化细菌和古菌的 PCR 扩增，使用胶回收试剂盒 （Gene JET，Thermo，美国）进行 PCR 产物回收，并送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行土壤微生物高通量测序，测序平台为 IonS5TMXL。
1.4 统计分析
使用 QIIME 计算 α 多样性指数、样本物种组成和群落丰度、分析 Unweighted 和 Weighted 的 UniFrac 距离矩阵，并通过非度量多维尺度分析进行数据可视化。使用 SPSS 26.0 对土壤理化性质进行单因素方差分析（P=0.05）。
2 结果与分析
2.1 生物炭和氮肥配施对土壤性质的影响
与 N0 处理相比，培养至 180 d 时，NN 处理的土壤 pH 从 6.52 下降至 5.69，说明施用氮肥会引起土壤酸化。培养 30 d 时，NB0.025 处理的土壤 pH 显著高于 N0 处理，但与 NN 处理没有显著差异。此时，NB0.05 和 NB0.1 处理的土壤 pH 显著高于 N0 和 NN 处理，但生物炭缓解土壤酸化具有时效性，至培养 180 d 时，NB0.05 和 NB0.1 处理与 NN处理的土壤 pH 值没有显著差异。
单施氮肥以及配施生物炭处理的土壤 EC 显著高于 N0 处理，与土壤外源添加离子有关。与 N0 处理相比，氮肥配施生物炭显著降低了土壤交换性 H+ 含量，但培养至 180 d 时，5 个处理间的差异降低。单施氮肥以及配施生物炭处理的土壤交换性 Al3+ 含量显著高于 N0 处理，但培养至 180 d 时，NB0.05 和 NB0.1 处理的土壤交换性 Al3+ 含量接近 N0 处理，NN 处理的土壤交换性 Al3+ 含量最高，NB0.025 处理次之。说明随着生物炭用量的增加，其调控土壤潜性酸的能力在增强。
图2氮肥配施生物炭对土壤理化性质的影响
注：不同小写字母表示同一采样时期不同处理间差异显著（P<0.05）。
随着生物炭用量的增加，土壤 TOC 含量显著增加，在培养 30、90 和 180 d 时，施用生物炭的 3 个处理，其土壤 TOC 含量均显著高于 N0 和 NN 处理。施用生物炭的处理 DOC 含量在培养 30 和 90 d 时与 N0 处理没有显著差异，且显著低于 NN 处理，至培养 180 d 时，N0 处理 DOC 含量明显下降，显著低于 NN 处理和施用生物炭处理。单施氮肥对土壤 TOC 含量没有显著影响，但显著提高 DOC 含量，可能与氮素养分刺激微生物活性加快有机碳库矿化有关。施用生物炭处理培养至 90 d 时土壤 DOC 含量与 N0 处理没有显著差异，可能是生物炭抑制微生物活性，或者生物炭吸附了 DOC，随着时间推移，抑制作用或吸附作用减弱，其机理有待进一步研究。以上结果表明，氮肥配施生物炭可改善土壤的 pH 稳定性，降低土壤潜在酸度，增加土壤碳库，本试验条件下氮肥配施 10% 生物炭效果较好。
2.2 生物炭和氮肥配施对土壤氨氧化微生物丰度的影响
对土壤中氨氧化微生物的物种组成分析发现，供试土壤的氨氧化古菌（AOA）包括 Nitrosopumilus 和 Nitrososphaera，氨氧化细菌（AOB）包括 Nitrospira、 Aeromonas、Candidatus Nitrosoglobus、Acinetobacter 和 Staphylococcus（图3）。不同处理的 AOB 相对丰度均高于 57%，AOA 的相对丰度均低于 0.1%，说明 AOB 是供试土壤的主要氨氧化微生物类群（图3A）。
与 N0 处理相比，NN 处理对 AOA 相对丰度无显著影响，但 NB0.1 处理可提高培养 90 d 和培养 180 d 时 Nitrososphaera 的相对丰度，以及培养 90 d 时 Nitrosopumilus 的相对丰度。与 N0 处理相比，NN 处理和氮肥配施生物炭处理提高了 180 d 时 Nitrospira 的相对丰度；NB0.05 和 NB0.1 处理提高了培养 30 d 和培养 90 d 时 Aeromonas 的相对丰度；NN 和 NB0.05 处理可以提高 90 d 时 Candidatus Nitrosoglobus 的相对丰度。另外，与 N0 和 NN 处理相比，NB0.1 处理可以提高培养 30 d 和培养 90 d 时 Aeromonas 的相对丰度，以及培养 180 d 时 Acinetobacter 的相对丰度。 NB0.05 处理可以提高培养 90 d 时 Candidatus Nitrosoglobus 的相对丰度，氮肥配施生物炭相较于 NN 处理可提高咖啡种植土壤 AOA 和 AOB 的相对丰度，特别是在培养 90～180 d 时效果显著。
图3不同时期不同处理的物种组成丰度图
注：A：物种组成柱状图，B：物种组成热图。AOA 为氨氧化古菌，AOB 为氨氧化细菌。
2.3 生物炭和氮肥配施对土壤氨氧化微生物多样性的影响
通过 α 多样性分析、Kruskal-Wallis 和 Dunn’s Test 检测发现，相对于 N0 处理，NN 处理对氨氧化微生物的 α 多样性指数（ACE、Chao1、Shannon、 Simpson）无显著影响（图4A）。NB0.1 处理在培养 30 d 时 α 多样性指数（ACE、Chao1、Shannon、Simpson）显著高于 N0 处理，在培养 180 d 时 ACE、Chao1 指数显著高于 N0 处理，ACE、Chao1、 Shannon、Simpson 显著高于 NN 处理。说明氮肥配施生物炭显著提高了供试土壤中氨氧化微生物物种总数、多样性和丰富度，其中 NB0.1 处理效果最好。
通过非度量多维尺度分析发现，N0、NN 处理和氮肥配施生物炭处理的 β 多样性存在差异，特别是培养 30 和 180 d 时，各处理间的 β 多样性差异显著（图4B），说明不同施肥处理使得咖啡种植土壤形成了不同的氨氧化微生物群落。
图4不同时期不同处理的群落结构分析
注：A：α 多样性指标，B：非度量多维尺度（NMDS）分析。Stress 为胁强系数。
2.4 土壤性质与氨氧化微生物的相关性
通过冗余分析（RDA）发现，培养 90 d 时不同处理土壤性质与氨氧化微生物相对丰度具有显著相关性（图5A）。Aeromonas 和 Nitrospira 与土壤 pH、 EC、交换性 H+ 含量和 TOC 含量呈显著正相关，而与交换性 Al3+ 含量和 DOC 含量呈显著负相关； Candidatus Nitrosoglobus 与土壤中 DOC 含量呈显著正相关，而与土壤 pH、EC、交换性 H+ 含量、交换性 Al3+ 含量和 TOC 含量呈显著负相关；Nitrosopumilus 与土壤 pH、EC、交换性 H+ 含量、交换性 Al3+ 含量和 TOC 含量呈显著正相关，而与 DOC 含量呈显著负相关。以上结果说明，培养 90 d 时，随着生物炭用量的增加，土壤 pH 升高，TOC 含量增多，提高了部分 AOA（Nitrosopumilus）和 AOB（Nitrospira 和 Aeromonas）的相对丰度。
图5土壤理化指标的冗余分析（RDA）
注：A：属水平物种相对丰度，B：多样性指数。Permutation Test：随机置换非参数检验；Other：其他属。
培养 30 和 180 d 时不同处理土壤理化性质与氨氧化微生物 α 多样性具有显著相关性（图5B）。培养 30 d 时，氨氧化微生物 ACE 和 Chao1 指数与土壤 pH、EC、交换性 Al3+ 含量、TOC 含量呈显著正相关，与土壤中交换性 H+ 含量和 DOC 含量呈显著负相关；Simpson 和 Shannon 指数与土壤 pH、 EC、交换性 H+ 含量、交换性 Al3+ 含量、TOC 含量和 DOC 含量呈显著正相关。培养 180 d 时，ACE 和 Chao1 指数与土壤 pH、EC、交换性 H+ 含量、 TOC 含量和 DOC 含量呈显著正相关，与交换性 Al3+ 含量呈显著负相关；Simpson 和 Shannon 指数与土壤 pH、EC、交换性 H+ 含量、交换性 Al3+ 含量、 TOC 含量和 DOC 含量呈显著负相关。以上结果说明，培养 30 和 180 d 时，随着生物炭用量的增加，土壤 pH、EC 和 TOC 含量增加，氨氧化微生物的物种多样性和丰富度随之提高。综上所述，生物炭引起土壤性质变化是影响土壤氨氧化微生物相对丰度和多样性变化的主要环境因子。
3 讨论与结论
大量外源氮输入易导致土壤 pH 降低、有机碳分解[17-19]。本试验中，培养 180 d 后单施氮肥处理土壤 pH 下降 0.83，酸化趋势明显。与单施氮肥相比，生物炭和氮肥配施至培养 90 d 时可降低土壤交换性 H+，至培养 180 d 时降低土壤交换性 Al3+，具有一定缓解土壤酸化的能力，可能与生物炭呈碱性，以及增强土壤缓冲性能有关[20-21]，生物炭表面的羧酸盐（—COO-）会与 H+ 结合形成羧酸 （—COOH），这一过程会释放盐基离子[22-23]。
氨氧化过程是硝化作用的第一个反应步骤（也是限速步骤），施用铵基氮肥土壤硝化活性增强，释放更多 H+ 是土壤酸度增加的重要原因[24-26]，该过程主要由 AOB 和 AOA 驱动。生物炭能提高细菌的生物合成能力[27]，所含的易分解有机物质为土壤微生物提供碳源[28-29]，发达的孔隙结构为土壤微生物提供生存与繁殖场所[30-31]，或者土壤关键酶活性或代谢标志物发生改变影响了微生物群落结构[32-33]，因此提高了土壤 AOB 和 AOA 的基因丰度，并改变了 AOB 和 AOA 的群落结构。本试验发现，生物炭和氮肥配施显著提高土壤氨氧化微生物的丰度、多样性和群落结构，其中 AOB 的种类和丰度高于 AOA。施加生物炭可提高土壤中的 AOB 丰度，影响其群落结构[34]，与本研究结果一致。但也有生物炭对 AOA 丰度没有影响的报道[35]，可能与 AOA 更适宜酸性和低氮环境有关[36]，如试验前期在云南省保山市潞江镇和德宏州芒市咖啡种植土壤（pH<5）中发现 AOA 丰度显著高于其他氨氧化细菌[37]。
生境差异驱动土壤中氨氧化微生物结构与组成的改变。本试验对土壤理化因子与氨氧化微生物相对丰度进行冗余分析发现，培养 90 d 时，部分氨氧化微生物相对丰度与土壤的 pH 和 TOC 含量呈显著正相关，培养 30 和 180 d 时，氨氧化微生物物种的丰富度和多样性与土壤 pH、EC 和 TOC 含量呈显著正相关，与生物炭“石灰效应”理论[38]、土壤 pH 是影响土壤氨氧化微生物群落组成的主要因素[39-40]、土壤中氨氧化细菌与有机质含量密切相关[41-43]等报道相符。因此，本试验中氮肥配施生物炭对氨氧化微生物丰度和多样性的促进，主要是生物炭的施用可以提高土壤 pH 和 TOC 含量，改变了氨氧化微生物群落结构，其中对 AOB 的种类和丰度的影响更显著。
本试验明确了占烘干土重 10% 的生物炭配施氮肥可有效缓解咖啡种植土壤酸化以及提高氨氧化微生物多样性，为云南省咖啡栽培和土壤改良提供了参考方案。
