摘要
探索稻虾共作模式下氮肥用量对稻田氮盈余量及土壤微生物群落的影响，在确保粮食安全的同时减少土壤的活性氮损失，并为水稻可持续生产提供理论支撑。大田试验以稻虾种植模式为研究对象，以不施氮为对照 （CK），设置 4 种施氮量（N60、N120、N180、N240），研究稻虾共作模式下不同施氮量对共作模式氮表观平衡 （氮输入与氮输出量间的氮平衡状态）及土壤微生物群落特征的影响。结果表明，虾体系氮输出量占比氮输入量分别为 45.9%（2021 年）和 57.8%（2022 年），成虾氮输出量占比氮输入量分别为 27.2%（2021 年）和 32.6%（2022 年），大量氮滞留在虾体系中。稻田模式中 CK、N60 处理表观氮平衡均为负值，N120、N180、N240 处理表观氮平衡均为正值，其中 N240 处理氮盈余量最大，分别达到 N 130.4 kg/hm2 （2021 年）和 N 163.1 kg/hm2 （2022 年）。化肥氮投入量增加有利于土壤（0 ～ 60 cm）铵态氮、硝态氮、无机氮含量氮累积量增加，且随土层（0 ～ 60 cm） 深度增加而降低；2022 年土壤不同土层无机氮含量高于 2021 年。土壤（0 ～ 20 cm）中基因型细菌群落 AOA、 AOB、nirS、nirK、nosZ、narG 均随化肥氮投入量的增加而增加。推荐适宜氮肥施用量为 N 120 ～ 180 kg/hm2 ，稻田表观氮平衡为正数，最大氮盈余量为氮 103.5 kg/hm2 ，符合荷兰矿物核算模式和欧盟建议氮盈余量标准（100 和 80 kg/hm2 ）。长期稻虾共作和增施氮肥有利于土壤无机氮含量增加，扩充土壤氮库。
Abstract
The effects of nitrogen fertilizer application on nitrogen surplus and soil microbial community in paddy soil under the rice-crayfish co-culture system（RC）were explored，in order to ensure food security and reduce soil active nitrogen loss，and provide theoretical support for sustainable rice production. The field experiment used RC cultivation mode as the research object， with no nitrogen application as the control（CK），and four nitrogen application rates（N60，N120，N180，N240）were set up to study the effects of different nitrogen application rates on nitrogen balance（the nitrogen balance between nitrogen input and nitrogen output）and soil microbial community characteristics under the RC. The proportion of nitrogen output to nitrogen input in the Procambarus clarkii system was 45.9%（2021）and 57.8%（2022），respectively. The proportion of nitrogen output to nitrogen input in adult crayfish was 27.2%（2021）and 32.6%（2022），respectively. A large amount of nitrogen was retained in the crayfish system. In the paddy field model，the apparent nitrogen balance of CK and N60 was negative，while the apparent nitrogen balance of N120，N180 and N240 was positive. Among them，N240 had the largest nitrogen surplus， reaching N 130.4 kg/hm2 （2021）and N 163.1 kg/hm2 （2022），respectively. The increase in fertilizer nitrogen input was beneficial for the accumulation of ammonium nitrogen，nitrate nitrogen，and inorganic nitrogen in soil（0-60 cm），which decreased with the increase of soil depth（0-60 cm）；the inorganic nitrogen content in different soil layers in 2022 was higher than that in 2021. Soil AOA，AOB，nirS，nirK，nosZ and narG（0-20 cm）all increased with the increase of fertilizer nitrogen input. The recommended suitable nitrogen fertilizer application amount was N 120-180 kg/hm2 . The apparent nitrogen balance in the rice field was positive，and the maximum nitrogen surplus was 103.5 kg/hm2 ，which met the recommended nitrogen surplus standards of the Netherlands MINAS and EU（N 100 and 80 kg/hm2 ）. Long term rice-crayfish co-culture and increased application of nitrogen fertilizer were beneficial for increasing soil inorganic nitrogen content and expanding soil nitrogen pool.
水稻传统稻作模式主要通过增施化肥、喷洒农药等措施实现水稻稳产增产，但该类模式存在经济效益低下、土壤退化和稻田面源污染等多项问题[1]。稻田综合种养将水稻种植和动物养殖有机结合，通过物种间互惠和资源的互补利用，能够节约土地资源、增加经济产出并改善稻田生态环境[2]。稻虾共作模式（RC）是稻渔综合种养的模式之一，在全国，特别是长江中下游地区得到了迅速推广，目前已成为我国应用面积最大、总产量最高的稻渔综合种养模式[3]。
稻虾共作模式往往投入更多的养分，如肥料、饲料等[4-5]。小型农户种植占我国主导地位[6]，不科学施肥在稻田生产中导致更高的肥料消耗，克氏原螯虾的经济效益优于水稻，部分农户倾向于使用更多的饲料，导致模式剩余营养过多[4]。有研究者认为，饲料中只有 20.4% 的氮（N） 被转化到水生动物体内，导致大量的氮素留在环境中，易造成水体富营养化[7-8]。田面长期覆水能显著降低氮素以氨氮等气态方式损失，实现水稻增产增效。克氏原螯虾会取食稻田内水草，是天然的生物除草剂，降低田间作物对养分竞争[5]。虾、蟹等挖洞、觅食行为会改善土壤物理结构，加速土壤养分转化[9-10]。克氏原螯虾蜕壳和排泄物能作为微生物的底物提高土壤微生物活性和改善微生物群落结构[11]，土壤微生物含量和良好的微生物群落结构有利于土壤养分转化，增强土壤养分供应[12-13]。饲料和虾排泄物等在田间能被分解作为无机养分供应水稻生长，饲料和虾排泄物等在虾沟中通过灌溉也能被水稻吸收利用。此外，鱼和水禽在稻田摄食等活动会经常袭击或机械碰撞水稻及根系，这会导致害虫落入水中并被吃掉，并通过机械刺激促进水稻生产[14-15]。
养分平衡是通过对农业模式的养分利用效率、土壤肥力和潜在养分损失等因素来评估养分管理效果的指标之一[16]。氮盈余是指土壤中氮素含量大于植物对氮素的需求量，而过多的氮盈余会导致土壤酸化、氮素淋失等一系列生态环境问题[17]。例如，荷兰矿物核算模式（MINAS）的监管政策工具[18]建议黏性土壤中最大氮盈余为 N 100 kg/hm2，欧盟建议种植模式中最大氮盈余为 N 80 kg/hm2。 Zhang 等[19]基于经济上最优的氮素管理，建立了中国水稻种植模式 N 40～190 kg/hm2 的氮盈余基准值。RC 较传统水稻单作模式更具复杂性，研究表明，RC 有利于植株氮累积和土壤氮库的增加[20-21]，因此，迫切需要探索 RC 下适宜的氮盈余基准值，避免氮肥投入过多造成生态环境问题。
前人研究指出，RC 下参与氮循环的微生物丰富度和多样性显著降低，从而削弱了水稻土土壤的养分转化能力[22-23]。然而，也有报道称 RC 下微生物的多样性增加[24]，提高了土壤的稳定性，能促进微生物的功能和活性，有利于土壤养分的转换与固定[25]。稻田土壤微生物群落与农业生态模式功能之间存在着内在联系，微生物能通过氮矿化、硝化作用和固氮作用等过程来调节稻田土壤中硝酸盐（NO3-）与铵盐（NH4 +）之间的相互转换，参与氮硝化和反硝化过程相关的基因型编码微生物包括硝化（AOA、AOB）和反硝化（nirS、nirK、nosZ 和 narG）细菌，已被广泛用于评估土壤氮转化过程微生物的丰度和多样性[26-27]。不同施氮量下土壤微生物变化趋势是调控土壤硝化和反硝化过程的重要因素，影响土壤氮供应量和氮矿化量。土壤表观氮平衡能直观分析种植系统养分投入和输出，RC 下土壤养分积累作为输出量却鲜有分析。因此，本研究通过对 RC 不同氮投入量与各方面氮输出量的研究，分析不同氮投入量下 RC 表观氮平衡和氮盈余情况，对土壤氮硝化和反硝化微生物及土壤不同土层氮累积量的影响，综合分析 RC 适宜氮投入量。
1 材料与方法
1.1 研究区域
试验于 2020—2022 年在湖北省仙桃市彭场镇前锋村（330°14′34 ″N，113°32′27 ″E） 进行（本研究只对 2021—2022 年数据进行统计分析）。仙桃市属北亚热带大陆性气候，年平均气温 16～16.6℃，年均日照时长约 2028 h，年均降水量 1074～1286 mm，无霜期约 261 d。试验场地土壤 pH 值为 6.8，有机质为 25.1 g/kg，碱解氮为 108 mg/kg、有效磷为 14.1 mg/kg、速效钾为 110 mg/kg。虾沟宽度 5～8 m，占总耕地的 5%～10%，深度 1.3～2.0 m。
1.2 试验设计
肥料试验共设置 5 个处理，氮肥用量分别设定为 N 0、60、120、180 和 240 kg/hm2，记作 CK、 N60、N120、N180 和 N240。基肥用量为 70%，追肥 30%，移栽前 3 d 施基肥，移栽后 7～15 d 施分蘖肥。各处理的磷肥和钾肥用量相同，分别为 P2O5 120 kg/hm2 和 K2O 120 kg/hm2 （表1）。小区面积 30 m2，采用单因素区组试验，每个处理 3 次重复，试验小区铺设防水塑料薄膜（高 × 宽 × 深为 30 cm×30 cm×20 cm）。水稻品种选用富优 135，行距和株距为 25 cm×20 cm，水稻于试验年限间每年 5 月 20 日左右移栽，9 月 30 日前收获。追肥后约 10 d，克氏原螯虾（Procambarus clarkia）虾苗入田，密度为 75 kg/hm2。投喂阶段采用玉米等粗粮和高蛋白饲料，投喂量以上一次食用完为宜，并关注小龙虾生长和气候等因素，根据小龙虾摄食量调整，年总投喂量约 3000 kg/hm2。饲料主要是正大克氏原螯虾专用配方饲料（N 46.6 g/kg；P 11.0 g/kg；K 10.5 g/kg），酌情添加玉米（N 2.5%；P 1.1%；K 3.2%）。每天 9：00 喂食 1 次，撒于虾沟，并根据当地养殖习惯进行管理。在捕捞克氏原螯虾时，体长≤ 5 cm 克氏原螯虾体需要重新放回虾沟。稻虾共作系统边界及氮循环模式如图1所示。
表1稻虾共作模式各施肥处理的养分投入
非稻季水位即水稻收获后会适当放水不超过 20 cm，有利于秸秆还田腐烂。稻季 6 月初水稻播种前，为避免小龙虾对水稻的伤害以及适应水稻种植水分需求，田面退水至 5～10 cm，小龙虾会躲避到四周虾沟中。水稻返青-分蘖期完成追肥后 10 d 左右覆水，保证小龙虾和水稻生长所需水量，水位逐渐加深至 20 cm。水稻收获前将水排干晒田 1 周左右后开始进行水稻收获。
图1稻虾共作氮循环模式
1.3 取样和测量方法
水稻成熟期，根据水稻植株的平均分蘖数选择 5 株具有代表性的植株。以水稻根系为中心取长 × 宽 × 深为 20 cm×20 cm×20 cm 的土块，通过清水清洗获得水稻根系样品。植物样品置于 105℃的烘箱中杀青 30 min，80℃下烘干至恒重。采用浓 H2SO4-H2O2 消煮，半微量凯氏定氮法[28]测量植物氮浓度。
采用与水稻植物样品相同分析方法，分别测量饲料、幼年克氏原螯虾、成年克氏原螯虾和克氏原螯虾壳的水分和全氮含量。根据虾壳重量与成虾重量的平均比值（12.4%）计算克氏原螯虾总蜕壳量[29]。 Kristiansen 等[30]研究表明，水温在 20℃饲料喂养条件下，成虾排泄物平均氮含量为 24.9 g/kg，根据成虾重量和养殖时间，估算克氏原螯虾排泄物氮累积量。
在水稻成熟期，取 0～60 cm 土壤剖面，按 20 cm 分层，每重复（小区）随机三点取样。0～60 cm 土层的土壤容重，使用 100 cm3 环刀，每 20 cm 取一次样，105℃烘干至恒重，测定单位体积土壤重量。用 2 mol/L 的 KCl 浸提后，分别用靛酚蓝比色法和分光光度法测定铵态氮和硝态氮含量。提取土壤微生物 DNA 含量，称取 0.5 g 冻土样品，使用 Power soil TM DNA 提取试剂盒（MO BIO Laboratories，USA）提取土壤中的 DNA 基因组。对提取的基因组 DNA（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA pH 8.0）进行琼脂糖电泳检测，并使用 NanoDrop 2000（Thermo Scientific，USA）测定 DNA 的含量和质量[31]。
1.4 参数计算公式
表观氮平衡计算公式如下[32]：
土壤无机氮累积量公式如下：
式中，M 为土壤无机氮累积量（kg/hm2），Hi 为土层厚度（cm），Gi 为土壤容重（g/cm3），Li 为土壤无机氮含量（mg/kg），10 为单位转换系数。
1.5 数据处理
使用 Excel 2010 进行数据处理。SPSS 26.0 用于方差分析和 Duncan 法多重比较，以 P<0.05 为差异显著性水平。
2 结果与分析
2.1 虾尺度的氮平衡
RC 中，克氏原螯虾的引入较水稻单作模式出现新的氮投入和输出。由表2可知，饲料氮投入量为 N 107.4 kg/hm2，2021 和 2022 年虾产量分别为 1500 和 1800 kg/hm2，按照 77.9% 含水量计算，2021 年虾壳成虾氮累积量分别为 N 10.4 和 29.1 kg/hm2，2022 年虾壳和成虾 N 分别为 N 15.6 和 35.0 kg/hm2。Kristiansen 等[30] 研究表明，在 20℃ 且喂养饲料的情况下，成虾排泄物氮输出量为 24.9 g/kg。根据虾养殖时间约为 90 d 以及成虾产量，克氏原螯虾排泄物氮输出量粗略估算分别为 12.5（2021 年）和 14.9（2022 年）kg/hm2。在 2021 和 2022 年虾模式中氮输出 / 输入的值分别为 45.9% 和 57.8%，成虾氮输出 / 输入的值分别为 27.2% 和3 2.6%，这表明大部分的氮滞留在 RC 体系中。
表2稻虾共作体系虾尺度氮平衡
2.2 稻虾共作模式稻田尺度氮平衡
如表3所示，RC 的灌溉水来源于虾沟，2021、 2022 年累计灌溉量分别约为 12000、15000 t/hm2，平均氮含量为 2.2 mg/L，累计灌溉水输入的氮分别为 N 26.4、33.0 kg/hm2。本文将虾壳与虾排泄物作为有机物料参与到稻田模式中，总累计氮输入量分别为 N 19.4、23.2 kg/hm2，年际差异与成虾产量不同有关。CK 没有化肥氮输入，氮投入量仍有 N 82.1（2021 年）和 87.9（2022 年）kg/hm2。水稻的氮输出包括籽粒、秸秆、根部，累计氮含量依次降低，随化肥氮投入量的增加表现为先增加后持平或者降低；CK 没有氮肥输入，氮输出仍有 N 134.2（2021 年）和 86.9（2022 年） kg/hm2。稻田模式中 CK、N60 的表观氮平衡均为负值，表现为氮亏损，N120、N180、N240 处理的表观氮平衡均为正值，表现为氮盈余，N240 处理的氮盈余量最大，分别达到 N 130.4（2021 年）和 163.1（2022 年）kg/hm2。
2.3 稻虾共作模式平衡特征
虾壳、虾排泄物、水稻秸秆、水稻根部即为投入氮，也为输出氮，因此 RC 未作分析。表4的数据反映出两年的氮投入量年际间差异不大，区别在降水量和灌溉量（水渠）输入的氮累积量不同。施氮处理的水稻籽粒氮累积量较 CK 明显增加，随化肥氮投入增加，变化趋势表现为先增加后持平，2022 年 N180、N240 处理水稻籽粒氮累积输出量低于 N120 处理。2021 年成虾的氮输出量较 2022 年降低了 5.8 kg/hm2，分别占系统总氮输出量的 17.3%～21.7% 和 22.7%～40.0%。2021 和 2022 年表观氮平衡变化范围分别为 N 35.8～243.6 和 82.8～280.9 kg/hm2，RC 中氮表观平衡均出现盈余。
表3稻虾共作模式稻田尺度表观氮平衡
表4稻虾共作模式表观氮平衡
2.4 稻虾共作体系土壤无机氮固定特征
稻田相同土层的铵态氮、硝态氮、无机氮对氮肥投入量的响应存在显著性差异，随氮肥输入量增加而增加，N180 与 N240 处理间有差异但整体上无显著性差异。铵态氮和无机氮两年均表现为随土层深度的增加而降低，2021 年硝态氮在土层 0～40 cm 差异不大，2022 年在 20～40 cm 土层差异达到最大值。且 2022 年不同土层的铵态氮、硝态氮、无机氮含量均高于 2021 年。
图2稻田模式不同土层铵态氮、硝态氮、无机氮含量特征
注：小写字母不同表示处理间差异显著（P<0.05）。
2.5 稻田模式部分微生物的响应特征
0～20 cm 土层中，化肥氮对土壤微生物存在显著性影响，AOA、AOB、nirS、nirK、nosZ、narG 基因型细菌群落均随化肥氮投入量的增加呈现显著性上升（ 表5）。AOA 与 AOB 在 N180 和 N240 处理下增长趋于平缓，nirS、nirK、nosZ 在 N120 与 N180 和N240 处理间无显著差异，高施氮量下 narG 活性优于 nirS、nirK、nosZ（表5）。化肥氮投入增加有利于土壤 0～20 cm 土层无机氮累积量的增加，收获后土壤 20～60 cm 土层无机氮累积量高于移栽前，例如 N240 处理下收获后高于移栽前 N 23.3 kg/hm2 （表6）。
表5稻田氮转换过程部分细菌的定量分析
注：表中数据单位为每克 DNA 中 DNA 片段拷贝数；同列不同小写字母表示差异达 5% 显著水平（P<0.05）。
表6稻虾共作模式稻田土壤无机氮累积量特征（2022 年）
3 讨论
3.1 稻虾共作模式氮输出特征
水稻和克氏原螯虾共作存在明显的互利共生关系，克氏原螯虾的蜕壳及残饵等被分解后为水稻生长提供了丰富的营养，克氏原螯虾掘穴等生物习性改善了稻田土壤环境[10]，稻田中繁盛的浮游生物和杂草等为克氏原螯虾提供食物来源[33]。虾沟废水作为稻田灌溉用水可降低虾沟水质的氨氮浓度，为水稻生长提供氮素，缓解水体富营养化[34]。2021 和 2022 年虾系统氮投入量相同，2022 年成虾氮输出量高于 2021 年（表2），因为 2021 年较小（≤ 5 cm）的克氏原螯虾没有捕获，虾沟养殖至 2022 年捕获；在 RC 中，饲料、秸秆、虾壳、排泄物等丰富的底物促进了微生物群落、浮游植物、藻类、浮游动物的增加，补充了 2022 年克氏原螯虾对养分的需求。克氏原螯虾生长过程中的蜕皮和排泄物以及未被食用的饲料通过微生物作用分解、转化为了养分[15]，本文研究中，虾壳和排泄物的总累计氮输入量分别为 N 19.4 kg/hm2 （2021 年）、N 23.2 kg/hm2 （2022 年）（表2）。2021 年 N180 与 N240 处理植株氮吸收总量差异不大，2022 年 N180、N240 处理水稻籽粒氮累积量低于 N120 处理，可能与以下 3 个原因有关：（1）土壤固定和转化能力存在一定限度，且水稻生长前期氮素需求有限，造成养分过于集中而大量损失；（2）氮投入过多会促进水稻营养生长，贪青晚熟不利于叶片的氮转运到籽粒中[35]；（3）淹水状态下创造了厌氧环境，导致土壤中还原性化学物质的浓度增加，从而导致土壤透气性差、温度低、肥力供给缓慢[15]。与此同时，土壤中的还原性物质（如过氧化氢）会毒害水稻根系，抑制水稻生长发育[36]。
3.2 稻虾共作模式氮平衡特征
成虾的氮输出 / 输入的值分别为 45.9%（2021 年）和 57.8%（2022 年），这表明虾饲养系统中部分饲料氮滞留（表2），农户为了获得更高的经济利润，促进克氏原螯虾生产而出现了一系列不当的农业管理，如过度扩大克氏原螯虾养殖面积、不适当的高密度克氏原螯虾养殖、过度滥用饲料等都会降低水稻对饲料氮的吸收和利用[17]。稻田模式中 CK、N60 处理的表观氮平衡均为负值，表现为氮亏损，N120、N180、N240 处理的表观氮平衡均为正值（表3），表现为氮盈余，适宜氮盈余量有利于水稻增大光合面积，促进光合产物的积累和水稻生长，增加水稻氮积累量[37]，在氮盈余明显过剩的情况下群体竞争将会加剧，对于光合效应具有制约作用[38]，从而抑制水稻生长。N180 处理稻田氮盈余量为 N 71.9～103.5 kg/hm2 （表3），符合荷兰 MINAS 和 EU 建议氮盈余量，分别是 N 100 和 80 kg/hm2。低氮盈余量或负氮素平衡表明更多的氮素从土壤中流失，导致土壤存量耗竭，最终损害作物生产力的可持续性；氮盈余量过大表明养分可以部分积累在土壤中，提高环境氮损失量[39-40]。
土壤氮供应是作物氮来源的重要途径之一。RC 模式下水稻收获后较移栽前土壤 0～20 cm 土层无机氮累积量增加（表6），秸秆、虾壳、排泄物等有机氮分解，化肥氮的输入和虾沟废水循环灌溉均能补充土壤氮库的消耗[40]，土壤中微生物代谢产物和作物根系分泌物也能调控土壤氮转化过程[23，36]，是提高土壤无机氮含量增加的因素之一。化肥氮投入量增加会导致土壤下层无机氮累积量增加，如表6所示，土壤 20～60 cm 土层无机氮累积量增加，且累积量高于 0～20 cm 土层。土壤耕作层以下大部分无机氮难以被水稻吸收利用，长期稻虾共作土壤在水饱和缺氧还原状态下会导致土壤潜育化，降低土壤有机氮矿化率，氮淋溶量增加[15，36]。
3.3 稻田模式土壤硝化和反硝化细菌含量特征
微生物坏死块是土壤可水解氮的重要组成部分[41]。Wang 等[42] 研究发现，RC 的土壤有生物总量增加了约 1 倍，使微生物氮对土壤速效氮的贡献达到 46.72%。RC 对土壤微生物群具有复杂的生态效应，虾壳、排泄物、未食用的饲料、秸秆等有机物料都能作为微生物养料来源，促进微生物量增加。AOA、AOB、nirS、nirK、nosZ、narG 基因型细菌群落均随化肥氮投入量的增加呈现显著上升（ 表5）。氮投入量增加可以刺激微生物活性[43]，促进土壤酶的合成和分泌[44-45]。AOA、 AOB 作为硝化细菌以 AOA 的响应程度优于 AOB （ 表5），AOA 和 AOB 通常是需氧微生物，RC 淹水深度高于传统水稻模式，导致土壤氧水平降低，AOB 活性可能受到抑制[46-47]。AOA 能够适应更大范围的氧浓度，并具有在自养和异养之间切换的能力，AOA 在水稻季节能够保持更高的活性[48]。然而，氮肥投入过多导致土壤酸化，酶的合成和功能在酸性 pH 下受到抑制[49]，且细菌群落种间竞争抑制微生物的持续增长。
4 结论
稻虾共作模式增施氮肥能维持稻田表观氮平衡，保证稻田氮盈余在适宜水平。推荐适宜氮肥施用量为 N 120～180 kg/hm2，该条件下稻田表观氮平衡为正数且最大氮盈余量为 N 103.5 kg/hm2，荷兰 MINAS 和欧盟建议氮盈余量为 N 100 和 80 kg/hm2，基本符合要求。长期稻虾共作和增施氮肥能提高稻田土壤耕作层无机氮，过多氮肥施用量也会增加土壤 20～60 cm 土层无机氮累积量，提高氮淋溶损失风险。