摘要
研究木质素对烤烟生长和土壤微生物的影响，为木质素的资源化利用提供参考。采用烤烟盆栽试验，添加土壤重量 2‰和 5‰的木质素作为处理组（L2 和 L3），并以不添加木质素作为对照处理（L1），在测定烤烟农艺性状和土壤 pH 的基础上，结合高通量测序和共现网络分析的方法，研究木质素对烤烟生长和土壤微生物的影响，并使用 FAPROTAX 数据库和 FUNGuild 进行细菌和真菌功能组进行分析。结果显示：与 L1 处理相比，L2 和 L3 处理烤烟的株高分别增加了 10.1% 和 15.6%，上部烟叶长分别增加了 6.9% 和 12.2%；成熟前期 L2 和 L3 处理土壤的 pH 显著降低了 0.38。Alpha 多样性分析和 PCoA 分析表明，木质素添加对土壤微生物多样性指数（Shannon index）、丰富度指数（Chao1 index）和 β 多样性均无显著影响。门水平上微生物群落组成分析表明，木质素的加入显著减少了成熟前期拟杆菌门、芽单胞菌门和硝化螺旋菌门及上部烟叶成熟期酸杆菌门的相对丰度；真菌中明显增加了成熟前期和上部烟叶成熟期子囊菌门和担子菌门的相对丰度，减少了被孢霉门的相对丰度。微生物共现网络分析结果表明，木质素使土壤微生物共现网络的复杂性降低，并增加了细菌共现网络的稳定性、削弱了真菌群落之间的合作关系，同时木质素的添加使放线菌成为细菌共现网络的主导菌群之一。功能预测结果表明，木质素的添加均显著增加了硝酸盐呼吸作用和氮呼吸作用的相关基因丰度；显著降低了动物病原-内生-附生-真菌病菌-植物病原-木腐菌的基因相对丰度。相关性分析结果表明，Saccharibacteria genera incertae sedis，Gemmatimonas 和 Minutisphaera 分别在不同时期与烤烟株高和上部叶叶长均存在正相关关系。总体上，木质素的添加改变了植烟土壤中微生物群落结构组成，其中 Saccharibacteria genera incertae sedis，Gemmatimonas 和 Minutisphaera 对烤烟株高和上部烟叶叶长的提高可能具有重要作用。
Abstract
The effects of lignin on the growth of flue-cured tobacco and soil microorganisms were studied to provide reference for the utilization of lignin asresources．The effects of lignin on flue-cured tobacco growth and soil microorganisms were studied in a pot experiment in which lignin with 2‰ and 5‰ of soil weight was added as the treatment groups（L2 and L3）and no lignin was added as the control group（L1）．Based on the determination of flue-cured tobacco agronomic traits and soil pH，the effects of lignin on flue-cured tobacco growth and soil microorganisms were studied by high-throughput sequencing and co-occurrence network analysis．Functional groups of bacteria and fungi were analyzed using the FAPROTAX database and FUNGuild．The results showed that compared with the control treatment，the plant height of L2 and L3 treated tobacco increased by 10.1% and 15.6%，and the upper leaf length increased by 6.9% and 12.2%，respectively．The pH ofsoil treated with L2 and L3 decreased by 0.38 unitsin the early stage of maturation．Alpha diversity analysis and PCoA analysis showed that lignin addition had no significant effects on soil microbial diversity index（Shannon index）， richness index（Chao1 index）and β diversity．The analysis of microbial community composition at gate level showed that the addition of lignin significantly reduced the relative abundance of Bacteroides，blastomonas and Nitrocellulosis in early maturity and Acidobacteria in upper tobacco leaf maturity．The relative abundances of ascomycetes and basidiomycetes were significantly increased in the early and upper mature stages of tobacco leaves，while the relative abundances of mortierella were decreased．The results of microbial co-occurrence network analysis showed that lignin reduced the complexity of soil microbial co-occurrence network，increased the stability of bacterial cooccurrence network，and weakened the cooperative relationship between fungal communities．At the same time，the addition of lignin made actinomyces become one of the dominant bacterial groups in the bacterial co-occurrence network．The functional prediction results showed that the addition of lignin significantly increased the abundance of genes related to nitrate respiration and nitrogen respiration． The relative gene abundance of Animal Pathogen-Endophyte-Epiphyte-Fungal Parasite-Plant Pathogen-Wood Saprotroph was significantly reduced．Correlation analysis showed that Saccharibacteria genera incertae sedis，Gemmatimonas and Minutisphaera were positively correlated with plant height and upper leaf length at different periods，respectively． In general，the addition of lignin changed the microbial community composition in tobacco-growing soil．Among them，Saccharibacteria genera incertae sedis，Gemmatimonas and Minutisphaera may play an important role in increasing the plant height and upper leaf length of flue-cured tobacco.
Keywords
土壤微生物是对维持农业生产至关重要的土壤过程的驱动力[1]。微生物分解有机物质以释放植物可利用的无机营养物质，通过氧化、还原、溶解和螯合过程改变营养物质的可利用性，并在坏死体中储存和释放营养物质[2]。这些过程驱动了全球养分循环[3]，并调节了土壤中约 90% 的能量流动[4]。当土壤环境发生变化时，微生物能够迅速做出反应，因此，微生物数据在预测土壤健康指标方面比土壤的物理或化学性质更好[5]。土壤微生物与植物相互作用，由植物根系分泌物招募到根际区域后，通过调节根系周围的营养转化促进植物生长，提高植物对非生物胁迫的耐受性[6]。因此，合理利用土壤微生物，对于促进土壤健康、提高作物产量和质量具有重要意义。
烤烟是我国重要的经济作物，良好的植烟土壤是优质烤烟生产的基础。然而，过量施用化肥破坏土壤生物化学平衡，引起土壤板结、酸化、微生物多样性下降等问题。木质素是一种存在于大部分陆地植物木质部中的复杂高分子化合物，是植物骨架的主要成分，在自然界非常丰富，数量上仅次于纤维素[7]。工业木质素的来源主要是纸浆生产的副产物，分为碱木质素和木质素磺酸盐两大类[8]。近年来，人们开始逐渐开发和利用木质素，已发现木质素可以作为土壤的改良剂和修复剂[9]，也可以作为肥料与氮肥配施[10]。另外，其作为共代谢底物时，也可以刺激土壤微生物促进多环芳烃污染物的降解[11]。但目前，人们对木质素的利用才开始，利用率仍较低，在实际修复及应用中也存在一定的局限性[12-13]。因此全面了解木质素的作用机制，以及更合理地利用木质素对农业生产和环境保护都具有重要意义。笔者通过设立盆栽试验，添加木质素处理组，在测定烤烟农艺性状和土壤 pH 的基础上，结合高通量测序和共现网络分析的方法，研究木质素对烤烟生长和土壤微生物的影响，以期为后续木质素的资源化利用提供基础资料。
1 材料与方法
1.1 供试材料
供试烤烟品种为云烟 87。试验于 2023 年在福建省三明市泰宁县下渠镇烟草实验站的大棚 （26°49′32.78″N、117°09′50.86″E）进行。供试土壤为砂壤土，前茬作物为水稻，土壤肥力中等，其理化性质：pH 5.18，有机质 38.6 g/kg，全氮 2.66 g/kg，全磷 0.77 g/kg，全钾 8.26 g/kg，碱解氮 205 mg/kg，有效磷 112 mg/kg，速效钾 210 mg/kg，NH4 +-N 11.28 mg/kg， NO3--N 14.80 mg/kg。供试肥料包括饼肥（N 2%）、烟草专用肥（N-P2O5-K2O=12-7-22）、硝酸钾、硫酸钾、氧化镁、硼砂。木质素为山东格瑞兰德添加剂公司购买的 MN-2 型号的木质素，碳氮比为 251∶1。
1.2 试验设计
盆栽试验所用盆为棕色花盆，其规格：上口直径 44 cm，高 36 cm。每盆装土 25 kg，施入基肥（以每公顷计，饼肥 300 kg、烟草专用肥 900 kg、硫酸钾 300 kg、氧化镁 150 kg、硼砂 22.5 kg），同时每千克土添加不同水平用量的木质素（L1：0 g/kg， L：2 g/kg，L3：5 g/kg），与供试土壤混合均匀后装入实验盆中，置放 7～10 d。盆栽按 17250 株 /hm2 计算每株施肥用量。于 2 月 21 日移栽，每盆植烟一株，每个处理重复 3 次。烟苗移栽缓苗 6 d 后，每隔 6 d 浇施硝酸钾 150 kg/hm2，总计分 4 次施入。试验管理与常规的烟草田间管理措施一致。
农艺性状测定：参考烟草农艺性状调查测量方法（YC/T142—2010）。打顶后 7～10 d 用卷尺测定烤烟株高、茎围、节距、叶数；中上部烟叶成熟采收时测定中上部代表叶的叶长和叶宽。
土壤样品采集处理：打顶后 5 d（成熟前期）、 32 d（中部烟叶成熟期）、60 d（上部烟叶成熟期） 时，利用土钻取 2 份 0～20 cm 烤烟根际土壤样品，一份保存在 4℃冰箱中，用于测定理化性质；另一份保存在-20℃冰箱中，用于土壤 DNA 提取。
1.3 试验测定指标与方法
土壤 pH 测定：土壤样品与无 CO2 蒸馏水混合 （水土比 2.5∶1）后，振荡 30 min，使用电位法测定。
土壤微生物高通量测序：
（1）土壤总 DNA 提取：使用 FastDNA SPIN Kit for Soil 试剂盒（MP Biomedical，Santa Ana，CA，USA） 从根际土壤样品中提取 DNA，所有提取的样品均使用 FastPrep24 仪器（MP）进行破壁，具体步骤参照试剂盒说明书。DNA 的提取质量采用 1% 琼脂糖凝胶进行测定，使用 Nanodrop2000 微量光谱（Thermo）测定 DNA 的浓度和纯度，并将其置于-20℃保存。
（2）PCR 扩增： ① 细菌 16S rRNA 的扩增引物为带有 12 bp 头部序列的 515F（5′-GTGCCAGC MGCCGCGGTAA-3′） 和 806R（5′-GGACTACHVG GGTWTCTAAT-3′），扩增体系（50 μL）含有 5 μL 10×buffer，4μL dNTP，0.5μL rTaq（Takara）， 36.5 μL ddH2O，10 μmol/L 的正反引物分别为 1μL 以及 2μL 模板 DNA；扩增条件：94℃预变性 5 min，94℃解链 45 s，55℃退火 35 s，72℃延伸 45 s，30 次循环；最后 72℃延伸 10 min。②通过两轮 PCR 扩增得到核糖体蛋白基因之间的内部转录间隔子（ITS），第一轮扩增引物为 ITS1F 和 ITS2，扩增体系（25μL）包含：2.5μL 10×buffer， 2 μL dNTP，0.25 μL rTaq（Takara），18.25 μL ddH2O，10 μmol/L 的正反引物各 0.5 和 1 μL 模板 DNA；扩增条件为：94℃预变性 5 min，94℃解链 40 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 40 s，20 次循环，然后 72℃延伸 10 min。第一轮的扩增产物作为第二轮扩增的模板 DNA，第二轮扩增引物为带有 10-bp 头部序列的 ITS1 和 ITS2，扩增体系（50 μL） 包含：5 μL 10×buffer，4 μL dNTP，0.5 μL rTaq （Takara），36.5 μL ddH2O，10 μmol/L 的正反引物分别为 1、2μL 模板 DNA；扩增条件为：94℃预变性 5 min，94℃解链 30 s，55℃退火 40 s，72℃延伸 40 s，25 次循环，然后 72℃保持 10 min。
采用 1% 琼脂糖凝胶检测 PCR 产物是否扩增成功，PCR 产物的浓度采用 Picogreen dsDNA 定量试剂盒测定，根据测得的浓度计算扩增产物总质量，然后等质量混匀，再使用 DNA 纯化试剂盒（TIAN GEN）进行纯化回收。
（3）16S 和 ITS 测序：在 Illumina Hiseq6000 平台（Novogene）上进行。
1.4 数据分析
采用重复测量方差分析（ANOVA）对不同木质素添加量与烤烟农艺性状、土壤 pH 以及微生物多样性的影响进行方差分析和多重比较（P<0.05）。土壤微生物 DNA 测序数据经过处理并以 97% 相似性水平进行分类操作单元（OTU）聚类。使用 UCHIME 筛选序列嵌合体，并使用 USEARCH 软件包进行序列分析，使用 RDP 分类器和 UNITE 数据库对代表性序列进行分类。分别使用 FAPRO TAX 数据库和 FUNGuild 进行细菌和真菌功能组分析。使用 R 语言分析微生物数据，其中，使用 “vegan”包中的 pcoa、diversity 函数分析微生物多样性和群落结构，使用“psych”包中的 corr.test 函数计算相关矩阵，使用“complexHeatmap”包以及 “ggplot2”包进行绘图。微生物网络分析在 iNAP 平台上进行，采用基于随机矩阵理论（RMT）的网络方法构建了不同处理下土壤样品细菌共现网络和真菌共现网络。使用 Gephi 绘图。
2 结果与分析
2.1 木质素添加对烤烟农艺性状的影响
烤烟定型后测量不同处理下烟株的农艺性状，结果如图1所示。各处理株高变化在 95.83～110.83 cm，L3>L2>L1（CK），且差异显著（P<0.05）。与 L1 处理相比，株高提升了 10.1%～15.6%。各处理的有效叶片数为 15～16 片、茎围为 8.9～8.93 cm、节距为 5.53～5.83 cm、中部叶的叶长和叶宽分别为 72.33～73.43 和 24.87～25.33 cm、上部叶的叶长和叶宽分别为 73.03～81.93 和 21.76～23.5 cm，其中上部叶叶长 L3>L2>L1（CK），且差异显著（P<0.05）。与 L1 处理相比，上部叶叶长提升了 6.9%～12.2%。综上所述，木质素的添加显著提高了烤烟的株高和上部烟叶叶长，对其他农艺性状影响不显著。
图1不同木质素添加处理下烤烟烟株的农艺性状
注：不同小写字母表示各木质素处理间具有显著性差异（P<0.05）。下同。
2.2 木质素添加对烤烟生长后期土壤 pH 的影响
对不同木质素添加量处理后的植烟土壤在打顶后不同时间取样检测 pH（图2），结果显示，在打顶后 5 d，与不添加木质素的处理 L1 相比，添加木质素处理 L2 和 L3 的 pH 均显著降低了 0.34。而在打顶后 60 d，所有处理土壤的 pH 都升高，且无显著差异。
2.3 木质素添加对土壤微生物群落多样性的影响
图3是不同木质素添加量处理下的植烟土壤在不同时期的微生物群落结构的多样性和主成分分析结果。由图3A、C 可见，与 L1 处理相比，在不同取样时间木质素添加处理的土壤中细菌物种丰富度指数和香浓指数均没有显著差异；从图3E 可以看出，细菌群落的第一主成分和第二主成分的贡献分别为 20.99% 和 9.62%。在打顶后的 5 d与其他两个取样时间相比，土壤细菌群落的组成差异较大，但不同木质素添加处理之间的差异不明显。
图2烤烟打顶后不同取样时间土壤 pH
图3土壤细菌和真菌群落的香浓指数、丰富度指数和 PCoA 分析
注：A、C、E 为土壤细菌；B、D、F 为土壤真菌。
由图3B、D 可见，在打顶后的 5 和 32 d，木质素添加对土壤中的真菌丰富度指数和香浓指数与 L1 处理相比没有显著差异。然而，在打顶后 60 d，低木质素 L2 处理土壤中的真菌丰富度指数和香浓指数显著低于 L1 处理和高木质素 L3 处理；从图3F 可以看出，真菌群落的第一主成分和第二主成分的贡献分别为 23.25% 和 11.34%，不同取样时间和木质素添加处理之间的差异不明显。
2.4 木质素添加对土壤微生物群落结构的影响
图4显示了门水平和属水平下木质素添加处理对植烟土壤中细菌和真菌群落相对丰度的影响。从图4A 可以看出，不同木质素添加处理之间细菌群落的组成主要包括变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、厚壁菌门（Firmicutes）、酸杆菌门（Acidobacteriota）、芽单胞菌门 （Gemmatimonadetes）、奇古菌门（Thaumarchaeota）、懒杆菌门（Ignavibacteriae）、硝化螺旋菌门 （Nitrospirae）、装甲菌门（Dictyoglomi）、异常球菌-栖热菌门（Deinococcus-Thermus）。在打顶后 5 d，拟杆菌门、芽单胞菌门和硝化螺旋菌门的相对丰度均随着木质素添加量的增多而显著减少。在打顶后 32 d，各处理土壤中的优势细菌菌门相对丰度没有显著差异。在打顶后 60 d，酸杆菌门的相对丰度也随着木质素添加量的增多而显著减少。
由图4B 可以看出，各木质素添加处理下的相对丰度前 20 的细菌菌属有 Gp1、狭义梭菌属 （Clostridium sensu stricto）、Gaiella、Gp16、Gp6、Gp3、地杆菌属（Subdivision3 genera incertae sedis）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、脱硫念珠菌（Desulfomonile）、 Saccharibacteria_genera_incertae_sedis、芽孢杆菌属 （Bacillus）、地芽孢杆菌属（Geobacter）、Litorilinea、 Dictyobacter、Ornatilinea、Thermomarinilinea、磁螺菌属 （Magnetospirillum）、厌氧粘细菌（Anaeromyxobacter）、 Candidatus_Solibacter 和芽单胞菌属（Gemmatimonas）。芽单胞菌属的相对丰度在打顶后 5 d 时随木质素添加量增多而显著减少，但在打顶后 60 d 时随着木质素增多又显著增加；另外，打顶后 32 d，Gp6 的相对丰度在添加木质素的 L2 和 L3 处理中明显低于 L1 处理。
由图4C 可以看出，不同木质素添加处理间植烟土壤中真菌的群落组成主要为子囊菌门（Ascomycota）、被孢霉门（Mortierellomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、壶菌门（Chytridiomycota） 和罗兹菌门（Rozellomycota），其中，子囊菌 （Ascomycota）在所有样品中相对丰度最高。子囊菌门和担子菌门的相对丰度在打顶后 5 和 60 d 时均随着木质素的添加而增多，且在打顶后 60 d 时达到显著水平；相反，被孢菌门的相对丰度在打顶后 5 和 60 d 时均随着木质素的添加而减少。
图4在门水平和属水平下土壤中细菌和真菌的相对丰度
注：A、B 为土壤细菌，C、D 为土壤真菌。
由图4D 可以看出，各木质素添加处理下的相对丰度前 20 的真菌菌属有 Phlyctis、阿太菌（Amphinema）、丝盖伞属（Inocybe）、青霉属（Penicillium）、被孢霉属（Mortierella）、枝顶孢属（Acremonium）、篮状菌属（Talaromyces）、红酵母属（Rhodotorula）、Podospora、枝孢菌属（Cladosporium）、菌寄生属（Hypomyces）、 Gomphillus、梭状芽孢杆菌（Spirosphaera）、附球霉属（Paracremonium）、Zopfiella、脉孢菌属 （Neurospora）、花褶伞属（Panaeolus）、囊二孢菌属（Allophona）、玉星属（Bacidia）、Minutisphaera。被孢霉属的相对丰度在打顶后 5 和 60 d时随着木质素添加量的增多而降低；另外，在打顶后 60 d 脉孢菌属的相对丰度随着木质素的增多而显著升高。
2.5 木质素添加对土壤微生物共现网络的影响
图5A～C 是不同木质素添加处理对土壤细菌共现网络的分析结果。如表1所示，不同添加木质素的 L1 处理的细菌网络由 542 个节点和 1619 条边组成，低木质素添加 L2 处理的细菌网络由 526 个节点和 1253 条边组成，高木质素添加 L3 处理的细菌网络由 468 个节点和 789 条边组成。与不添加木质素的 L1 处理相比，高木质素添加 L3 处理的平均连通度和平均聚集系数更低（5.974vs3.372，0.349vs0.263），平均路径长度更长（5.858vs9.018），图密度和模块数也更低 （0.011vs0.007，51vs47），这表明木质素的添加使细菌共现网络更简单。木质素的添加还提高了土壤细菌共现网络的稳定性（0.675vs0.737）。另外，如表2所示，在不添加木质素时细菌网络的主导细菌类群为变形菌门、芽单胞菌门和厚壁菌门，添加木质素处理中放线菌门逐渐成为主导菌群之一。
图5D～F 是不同木质素添加处理对土壤真菌共现网络的影响结果。如表1所示，添加不同木质素的 L1 处理的真菌网络由 87 个节点和 369 条边组成，其中正相关边的比例为 91.33%；低木质素添加 L2 处理的真菌网络由 87 个节点和 457 条边组成，其中正相关边的比例为 88.62%；高木质素添加 L3 处理的真菌网络由 94 个节点和 322 条边组成，其中正相关边的比例为 73.29%，这表明真菌菌群之间的合作关系变弱。与不添加木质素的 L1 处理相比，高木质素添加 L3 处理的平均连通度和平均聚集系数更低（8.483vs6.851，0.424vs0.271），平均路径长度和模块数相差不大（2.908vs2.863， 6vs6），密度相比更低（0.099vs0.074），这表明木质素的添加降低了真菌共现网络的复杂性。另外，表2、表3数据表明，各处理下土壤中真菌网络的主导真菌类群均为子囊菌门，纲水平下为粪壳菌纲 （Sordariomycetes）、座囊菌纲（Dothideomycetes）、散囊菌纲（Eurotiomycetes），添加木质素对其没有产生显著影响。
图5不同木质素添加处理下土壤细菌和真菌共现网络
注：A、B、C 为土壤细菌，D、F、F 为土壤真菌。
表1土壤微生物共现网络的拓扑属性
2.6 木质素添加对土壤微生物功能预测的影响
图6A 是基于 FAPROTAX 数据库的土壤细菌功能预测，基因相对丰度较高的功能包括：好氧氨氧化（aerobic ammonia oxidation）、有氧化能异养（aerobic chemoheterotrophy）、无氧光能自养（anoxygenic photoautotrophy）、光合自养硫氧化 （anoxygenic photoautotrophy S oxidizing）、芳香族化合物降解（aromatic compound degradation）、化能异养（chemoheterotrophy）、发酵（fermentation）、烃降解（hydrocarbon degradation）、铁呼吸作用（ironrespiration）、硝酸盐还原（nitrate reduction）、硝酸盐呼吸作用（nitrate respiration）、硝化作用（nitrification）、固氮作用（nitrogen fixation）、氮呼吸（nitrogen respiration）、光能自养 （photoautotrophy）、光能异养（photoheterotrophy）、光合营养（phototrophy）、硫化合物呼吸作用（respiration of sulfur compounds）、硫酸呼吸（sulfate respiration）、尿素分解（ureolysis）。氮、硫、铁转化相关功能基因的丰度集中在打顶后 5 d，其中硝酸盐呼吸、硝酸盐还原和氮呼吸的基因丰度随着木质素的添加而降低。芳香族化合物降解、烃降解等与碳转化相关功能的丰度集中在打顶后 32 d，并随着木质素的添加而升高。在打顶后 60 d，木质素的添加均显著增加了硝酸盐呼吸作用和氮呼吸作用的相关基因丰度。
图6B 是基于 FUNGuild 数据库的土壤真菌功能预测，基因相对丰度较高的功能包括：海藻寄生-苔藓寄生-寄生型真菌-未定义腐生菌（Algal Parasite-Bryophyte Parasite-Fungal Parasite-Undefined Saprotroph）、动物内共-动物内生病原-真菌病原菌-未定义腐生菌（Animal Endosymbiont-Animal Pathogen-Endophyte-Plant Pathogen-Undefined Saprotroph）、动物病原-内生-附生-真菌病菌-植物病原-木腐菌（Animal Pathogen-Endophyte-Epiphyte-Fungal Parasite-Plant Pathogen-Wood Saprotroph）、动物病原-内生-真菌寄生-地衣寄生-植物病原-木腐菌（Animal Pathogen-Endophyte-Fungal Parasite-Lichen ParasitePlant Pathogen-Wood Saprotroph）、粪腐生-内生-凋落物腐生-未定义腐生菌（Dung SaprotrophEndophyte-Litter Saprotroph-Undifined Saprotroph）、粪腐生-植物腐生菌（Dung Saprotroph-Plant Saprotroph）、外生菌根（Ectomycorrhizal）、寄生型真菌（Fungal Parasite）、植物病原菌（Plant Pathogen）、未定义腐生菌（Undefined Saprotroph）。在打顶后 5 和 32 d，各真菌预测功能基因丰度在不同处理间均无显著差异，而在打顶后 60 d，木质素的添加显著降低了动物病原-内生-附生-真菌病菌-植物病原-木腐菌的基因相对丰度。
2.7 相关性分析
图7呈现了不同木质素处理下各土壤样品中相对丰度前 20 的菌属和烤烟农艺性状之间的相关性分析结果。从图7A～C 可以看出，不同取样时间均有超过一半细菌菌属与烤烟株高和上部叶叶长之间存在负相关关系，如 Gp1、Gp3、Subdivision3 genera incertae sedis、地杆菌属、Litorlinea、Magnerospirillum、厌氧黏细菌、Candidatus Solibacter。在打顶后 5 d 时，Saccharibacteria genera incertae sedis 与烤烟的株高、节距、中部叶宽和上部叶叶长之间存在正相关关系，其属于 Candidatus Saccharibacteria 门。在打顶后 60 d 时，芽单胞菌属与烤烟的株高和上部叶叶长之间存在正相关关系。从图7D 可以看出，在打顶后 5 d，真菌中被孢霉属与烤烟株高之间均存在呈负相关关系，柄孢壳菌属和 Minutisphaera 与其之间呈正相关关系；被孢霉属与烤烟上部叶叶长之间呈负相关关系，Paracremonium 与其呈正相关关系。打顶后 60 d，被孢霉属与烤烟株高之间均存在负相关关系，Minutisphaera 与其之间呈正相关关系；被孢霉属与烤烟上部叶叶长之间呈负相关关系，脉孢菌属、Minutisphaera 与其呈正相关关系。
表2土壤细菌共现网络的主导 OTU
表3土壤真菌共现网络的主导 OTU
图6基于 FAPROTAX 数据库的土壤细菌功能预测和基于 FUNGuild 数据库的真菌功能预测
注：A 为土壤细菌，B 为土壤真菌。
图7相对丰度前 20 的细菌菌属和真菌菌属与烤烟农艺性状之间的相关性分析
注：A、B、C 为细菌，D、E、F 为真菌。
3 讨论
土壤 pH 是影响土壤肥力的重要因素。木质素的添加显著影响打顶后 5 d 时土壤 pH，添加木质素后的土壤 pH 显著低于 L1 处理，这可能是因为打顶后烤烟需要吸收大量硝态氮，因此，土壤硝化作用强度大于反硝化作用强度，产生大量氢离子，导致打顶后 5 d 土壤 pH 较低，明显低于打顶后 60 d。而木质素作为一种碳源，在酸性土壤中对微生物反硝化作用基因数量和表达量存在抑制作用[14]，从而使打顶后 5 d时土壤的 pH 显著低于 L1 处理。这也与图5细菌功能预测的结果中，木质素的添加降低了打顶后 5 d 时硝酸盐还原和硝酸盐呼吸及氮呼吸作用的基因相对丰度但对硝化作用相对丰度无显著影响的结果相一致。而打顶后 5 d 时，添加木质素的土壤硝态氮含量增高会促使烤烟烟株在打顶后成熟期前吸收更多的氮素，从而提高烟叶产量。
从微生物群落分析可以看出，木质素对一些微生物产生抑制作用的同时，也促进了部分微生物的快速生长和繁殖。结果发现，木质素明显提高了真菌中子囊菌门和担子菌门的相对丰度，这可能与木质素的降解过程有关。真菌是迄今为止发现的参与木质素代谢最活跃的微生物，根据真菌对木质素的降解类型可以分为白腐菌、褐腐菌和软腐菌[15]，白腐菌和褐腐菌属于担子菌门，而软腐菌多属于子囊菌门[16]。木质素的加入可能促进了能利用这类碳源的潜在降解菌的富集，显著提高了这部分微生物的丰度。另外，由于这类降解菌的富集，促进了土壤中木质素的分解，木质素结构复杂含有多种活性官能团，可被微生物降解转化为腐殖质，对可持续的土壤肥力具有重要意义[17]。对于土壤细菌群落，在打顶后 5 d 时，木质素的添加明显减少了拟杆菌门、芽单胞菌门和硝化螺旋菌门的相对丰度及打顶后 60 d 的酸杆菌门的相对丰度。这与孙月等[18]的试验结果一致。木质素的分解过程中会产生大量酚酸类等小分子物质，这类物质常被认为是会对植物自身产生毒害作用的自毒物质[19]，这些物质在土壤中与微生物互作，进而改变土壤生态环境，这类物质的产生可能也是导致部分微生物群落丰度减少的原因。拟杆菌门细菌主要负责硝化过程，破坏复杂的生物大分子，与凋落物木质素和纤维素的分解有关[20]。硝化螺旋菌门属于亚硝酸盐氧化细菌，在陆地环境中普遍存在，并且在农业土壤的生物氮循环和硝化作用中发挥重要作用[21]。添加木质素处理中拟杆菌门和硝化螺旋菌的丰度较低表明打顶后 5 d 时氮循环发生了变化。细菌群落属水平上，添加木质素在打顶后 5 d 时显著降低了芽单胞菌属的相对丰度，这可能是因为添加木质素显著降低了土壤 pH，而芽单胞菌属是革兰氏阴性、兼性需氧型细菌，对生长环境要求相对较高，所以环境一旦恶化就表现出降低[22]，相反，在打顶后 60 d 土壤 pH 回升后，芽单胞菌属的相对丰度也随之升高；在打顶后 32 d，木质素添加处理中 Gp6 的相对丰度显著低于对照处理，Gp6 作为一种酸杆菌门的菌属，与 pH[23]和土壤有机质含量[24]呈正相关关系，木质素分解增加了土壤有机碳的含量，但不同量木质素的添加又使植烟土壤在打顶后 32 d 有不同的酸碱度的变化，pH 和有机质含量及其他因素综合作用导致 Gp6 菌属的相对丰度随着木质素添加而降低[25]。
共现网络结果表明，木质素的添加使细菌网络更简单、更稳定，使真菌网络更简单但削弱了真菌之间的合作关系。网络中节点、边和度能够代表网络的复杂性，随着木质素添加量增加，细菌和真菌共现网络节点、边的数量和连接度均呈现减少的趋势，说明木质素添加降低了细菌和真菌网络的复杂性，且细菌共现网络中放线菌门转变为主要功能菌群，放线菌门可促进土壤中有机物的分解，产生挥发性有机化合物抑制植物病原真菌繁殖[26]，且放线菌具有抗病促生多种功能，在防止烟草青枯病方面具有良好效果[27]。木质素添加显著降低了真菌共现网络的正相关连接比例，这是因为木质素作为一种碳源，分解木质素的真菌之间形成了竞争关系，并使真菌群落的稳定性变差。
4 结论
木质素的添加显著提高了烤烟株高和上部烟叶叶长，降低了土壤 pH，并影响了土壤微生物群落组成：显著降低了拟杆菌门、芽单胞菌门、硝化螺旋菌门和酸杆菌门的相对丰度，增加了子囊菌门和担子菌门的相对丰度。Saccharibacteria genera incertae sedis、芽单胞菌属和 Minutisphaera 是提高烤烟株高和上部烟叶叶长的重要菌属。木质素的添加因其降解降低了土壤 pH 并改变了土壤微生物群落的组成，从而提高了烤烟株高和上部烟叶叶长。本研究为木质素在农田生态系统中的资源化利用提供了科学依据。