摘要
筛选获得具有 Fe3+ 还原活性及固氮能力的细菌，用于构建基于新型生物固氮体系的绿色低氮水稻生产。通过无氮培养基、柠檬酸铁培养基筛选和 LB 培养基纯化，从水稻土中分离筛选得到一株细菌 ZLJ24；通过形态特征观察、16S rRNA 基因序列测定、nifH 基因扩增，对菌株进行分类鉴定。结果显示，菌株 ZLJ24 为肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae），属革兰氏阴性杆菌，含 nifH 基因。在厌氧条件下培养 72 h，其 Fe3+ 还原效率为 90.24%。在无氮培养基中培养 24 h，其固氮酶活性为 89.28 nmol-C2H4/（min·mg 蛋白质）。在添加不同碳源的处理中，ZLJ24 在添加低浓度葡萄糖后固氮酶活性最高，为 19460.76 nmol-C2H4/（h·mg 蛋白质）。本研究表明，菌株 ZLJ24 具有良好的铁还原能力和固氮能力，添加葡萄糖对菌株 ZLJ24 固氮活性具有明显地促进作用。本研究将为构建基于新型生物固氮体系的绿色低氮水稻生产提供新思路。
Abstract
This study aimed to isolate and characterize a novel bacterium with iron-reducing and nitrogen-fixing capabilities from rice paddy soil，with potential applications in green，low-nitrogen rice production．A strain ZLJ24 was isolated from paddy soil through a series of screening processes，including cultivation on nitrogen-free medium，ferric citrate medium， LB agar medium．Morphological observations，16S rRNA gene sequencing，and nifH gene amplification were employed for identification，revealing strain ZLJ24 to be a member of the genus Klebsiella pneumoniae，a Gram-negative bacillus，and it was positive for the nifH gene，which is associated with biological nitrogen fixation．The efficiency of iron reduction by strain ZLJ24 under anaerobic conditions was found to be 90.24% after 72 hours of cultivation．Its nitrogenase activity in a nitrogen-free medium was 89.28 nmol-C2H4/（min·mg protein）．Intriguingly，the addition of low concentrations of glucose significantly enhanced the nitrogenase activity，reaching a maximum of 19460.76 nmol-C2H4/（h·mg protein）．These results demonstrated that strain ZLJ24 could possesse both robust iron reduction and nitrogen fixation capabilities，with glucose acting as a potent stimulant for its nitrogenase activity．This study contributed a promising strategy for developing a green，low-nitrogen rice production system based on biological nitrogen fixation，and offered a novel approach to sustainable agriculture．
水稻（Oryza sativa L.）是全球最重要的粮食作物之一，是世界 50% 以上人口的主食[1]。我国水稻种植面积约 3000 万 hm2，约占全国粮食作物播种面积的 29.8%，水稻是我国 60% 人口的主要粮食[2]。施用氮肥是保证水稻正常生长和稳产高产的关键措施。我国水稻单位面积氮肥用量为 N 180 kg/hm2，比世界平均水平高 75%；太湖地区水稻的氮肥用量甚至高达 N 300 kg/hm2[3]。我国稻田氮肥施用量大、氮素利用效率低，加剧了农业面源污染、空气雾霾和地下水硝酸盐超标等环境污染和全球变暖[4-6]。生物固氮是维持水稻田氮肥力水平的重要基础[7-10]。以有固氮微生物为核心的新型生物肥料不仅可以部分替代化学肥料，还可以减少氮环境负效应与温室气体排放，有利于强化水稻田生态系统减排增汇，从而促进水稻种植业绿色健康发展。
固氮微生物具有固氮能力，通常是因为它们具有特殊功能的蛋白质-固氮酶。固氮酶有固氮基因 nif 编码，nif 一般存在于细菌的质粒或者染色体上[11]。固氮酶由两部分组成：nifH 编码的铁蛋白（又称为固氮还原酶）和 nifDK 编码的钼铁蛋白 （又称为固氮酶）[12]。nifH 基因是最广泛用于研究固氮微生物生态学和进化的生物标志物[13]。
在发现铁还原细菌具有固氮功能之前，珠藻目和真枝藻目蓝细菌[14]、细鞘丝藻属和微鞘藻属[15] 等微生物被普遍认为是进行水稻田生物固氮的主要贡献者。而在我国不同地区的水稻土中，蓝细菌门和变形菌门则是优势的固氮微生物[16]。目前，由于聚合酶链式反应（PCR）扩增引物的选择性、扩增中的偏好性，以及只能根据已知序列设计特异性引物，很难扩增出尚未被认识的微生物。Masuda 等[16]通过提取水稻土核糖核酸（RNA）进行宏转录组分析，发现 δ 变形菌纲铁还原细菌具有完整的固氮基因。δ 变形菌纲铁还原细菌不仅是水稻土中常见的铁还原细菌[17-18]，还是其中的优势菌群[16，19-20]。我国海伦、常熟、鹰潭三地水稻土中变形菌门固氮细菌占到整个固氮菌群的 78.05%，其中 Geobacter（9.81%）和 Anaeromyxobacter（4.81%） 为优势属[21]，在水稻田生物固氮中起到关键作用。然而，到目前为止，对来自水稻土中铁还原细菌固氮能力的相关研究仍然较少。
本研究拟从水稻土中分离鉴定具有固氮能力的铁还原细菌，评价其固氮潜力，将为调控水稻田氮肥力水平、有效减少氮环境负效应和开发新型微生物肥料提供关键科学基础，并为水稻田化肥减施和绿色低氮水稻生产提供关键菌种资源。
1 材料与方法
1.1 菌株来源
铁还原细菌 ZLJ24 从江苏省宜兴市典型水稻土中分离筛选获得，分离培养基为阿须贝无氮培养基和柠檬酸铁培养基，纯化培养基为 LB 培养基。菌株纯化 5～6 代后，以甘油管置于-80℃保存，待用。
1.2 培养基
阿须贝无氮培养基（g/L）：甘露醇 10，CaCO3 5，MgSO4·7H2O 0.2，FeSO4·7H2O 0.04，Na2MoO4 0.005，K2HPO4 0.8。pH 6.8～7.0，固体培养基另加琼脂粉 10～15 g/L。
柠檬酸铁培养基（g/L）：柠檬酸铁 3.3，NH4Cl 1， CaCl2·2H2O 0.07，MgSO4·7H2O 0.6，K2HPO4· 3H2O 0.722，KH2PO4 0.25，葡萄糖 10，琼脂粉 10。用 NaOH 调节培养基 pH 为 7.0。当去除琼脂粉后即为柠檬酸铁液体培养基。
LB 培养基（g/L）：胰蛋白胨 10，酵母提取物 5，NaCl 10。用 NaOH 调节该培养基的 pH 为 7.4，另加 15 g 琼脂粉用于制作固体培养基。
1.3 菌株形态观察、生理生化特征分析和基因序列分析
1.3.1 菌株形态观察
挑取单菌落进行革兰氏染色，在光学显微镜下进行显微形态观察。
1.3.2 菌株生理生化特征
利用 Biolog 半自动细菌鉴定仪分析菌株生理生化特性，按 Biolog Gen Ⅲ MicroPlateTM 使用说明书操作。
利用 Biolog ECO 板评价菌株对不同碳源的利用能力。当微生物利用微孔中的碳源进行呼吸代谢时，微孔中化学物质的颜色随之发生变化。微生物的整体活性利用微孔平均颜色变化率（AWCD）来描述，碳源利用程度越大，AWCD 值越大[22]。
吸取过夜培养的菌液（OD600=1）离心去上清液，用 0.05 mol/L pH=7.0 的磷酸缓冲液重悬，稀释至 10-3，加入微孔板中。Biolog ECO 生态板于 28℃ 恒温培养，在 24、36、48、60、72、84、96、108、120 h 后使用 Biolog Emax 读板仪读取各孔在 750 和 590 nm 波长下的光吸收值。
1.3.3 菌株 16S rRNA 基因序列分析
采用细菌全基因组试剂盒提取菌株的 DNA，作为模板扩增 16S rRNA 基因。PCR 扩增所用引物为 27F（5 ′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′） 和 1492R（5 ′-TACCTTGTTACGACTT-3′）[23-24]。PCR 反应体系（20 μL）：Taq DNA 聚合酶 0.1 μL，10× PCR buffer 2 μL，dNTP（2.5 mmol/L）1.6 μL，27F （10 μmol/L）0.4 μL、1492R（10 μmol/L）0.4 μL，DNA 模板量（50～100 ng/μL）0.1 μL，dd H2O 15.4 μL。PCR 扩增程序：95℃预变性 10 min； 95℃变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 90，32 个循环；72℃终延伸 7 min。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测、割胶回收后进行测序。测序结果在 NCBI 数据库中进行同源性比对分析。下载同属的序列，用软件 MEGA11 进行 cluster 比对，邻接法（Neighbor-joining tree）绘制基于 1000 次重复对其进行评估的 16S rRNA 基因序列的系统发育树。
1.3.4 菌株 nifH 基因扩增
以菌株 ZLJ24 的 DNA 为模板，用特异性引物扩增 nifH 基因。PCR 扩增所用引物采用 nifH-F （5 ′-AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC-3 ′） 和 nifH-R（5′-TTGTTSGCSGCRTACATSGCCAT CAT-3 ′）[25]，获得约 458 bp 的基因片段。PCR 反应体系（20 μL）：Taq DNA 聚合酶 0.1 μL、10× PCR buffer 2 μL、nifH-F（10 μmol/L）0.4 μL、 nifH-R（10 μmol/L）0.4 μL、dNTP（2.5 mmol/L）1.6 μL、DNA 模板量（50～100 ng/μL）0.1 μL、dd H2O 15.4 μL。PCR 扩增程序为：94℃预变性 2 min； 94℃变性 30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，36 个循环；72℃终延伸 10 min，PCR 产物 4℃保存。 PCR 产物进行 1% 琼脂糖凝胶电泳检测，割胶回收、测序。
1.4 新分离菌株的铁还原能力
1.4.1 菌液制备
挑取 ZLJ24 单菌落，接种到装有 100 mL 无菌的 LB 培养基中，置于 30℃、180 r/min 的摇床 （ZQZY-88CN，上海知楚仪器有限公司）中暗培养。
1.4.2 菌株的铁还原率与铁还原特征曲线
在 50 mL 培养瓶中，分别加入 1 mL 铁源（柠檬酸铁溶液：Fe 含量为 1.08 mg/mL）、1 mL 5 g/L 的氯化铵，加盖后经高压灭菌，冷却后加入过 0.22 μm 滤膜的 pH 为 9.18 的缓冲液 1 mL、300 mmol/L 葡萄糖溶液 1 mL，接种 1.4.1 中 OD600=1 的菌液 1 mL，通 Ar2 除去瓶中 O2，用橡胶塞封口，并加盖。试验处理中以不加 ZLJ24 菌液（补 1 mL 无菌水）为对照，置于 30℃、180 r/min 的摇床中暗培养，分别在不同培养时间下测定培养瓶中 Fe2+ 浓度的变化。菌株的铁还原率依据测定的 Fe2+ 浓度与体系中加入的总 Fe3+ 浓度比值计算，用百分数（%） 表示。
1.5 菌株固氮能力的定量测定
1.5.1 菌液制备
取 1.4.1 中 OD600=1 的菌液 5 mL 于 10 mL 离心管中 3500 r/min 离心 5～10 min，用无菌水洗涤 2 次，溶于 5 mL 阿须贝无氮液体培养基备用。
1.5.2 乙炔还原活性测定
采用乙炔还原法测定菌液的乙炔还原活性，是定量表征菌株固氮能力的重要方法[26-30]。取上述 1.5.1 浓缩菌液 5 mL，接种于已盛有 30 mL 无菌阿须贝无氮液体培养基，以不加菌液（补 5 mL 阿须贝无氮液体培养基）作为对照。用无菌注射器抽出 10% 的气体，置换成乙炔，在 28℃下培养 24 h 后收集瓶内气体（存于抽真空的小血清瓶中），用注射器从血清瓶抽 0.06 mL 气样注入带有氢火焰离子化检测器（FID）的气相色谱仪分析乙烯浓度。
采用 Bradford 法[31]测定菌液的蛋白量来表征其生物量，计算单位时间单位质量蛋白的乙烯生成速率[nmol C2H4/（h·mg）]。
1.5.3 不同碳源及用量对菌株乙炔还原活性的影响
取上述 1.5.1 浓缩菌液 5 mL，接种于 30 mL 无菌的阿须贝无氮液体培养基中，将阿须贝无氮液体培养基中的碳源甘露醇替换为等碳量（0.30 mol C）、缩小 5 倍碳量（0.06 mol C）、扩大 5 倍碳量（1.50 mol C）的葡萄糖、甲酸钠、丙氨酸、柠檬酸，不做碳源（甘露醇）替换的处理为对照。用无菌注射器抽出 10% 的气体，置换成乙炔，在 28℃下培养 68 h 后收集瓶内气体，用注射器从血清瓶抽 0.06 mL 注入带有 FID 的气相色谱仪分析乙烯浓度。采用 Bradford 法[31]测定菌液的蛋白量来表征其生物量，计算单位时间单位质量蛋白的乙烯生成速率 [nmol C2H4/（h·mg）]。
2 结果与分析
2.1 菌株的形态观察与鉴定
筛选的菌株 ZLJ24 在 LB 固体平板培养基上培养 24 h 时，菌落呈圆形突起、白色光滑，边缘整齐、饱满而黏稠，接种环挑取菌落时黏连而易拉成丝（图1a）；液体培养静止时浑浊黏稠（图1b）。细菌的革兰氏染色镜检结果（图1c）显示，ZLJ24 菌株为革兰氏阴性细菌，杆状、有荚膜，菌体两端钝圆。
菌株 ZLJ24 的 16S rRNA 经测序得到长度为 1407 bp 的片段。在 NCBI 数据库中进行 BLASTN 序列比对，发现 ZLJ24 与克雷伯菌属（Klebsiella sp.） 多株细菌的 16S rRNA、nifH 基因序列相似性达 99%。通过检索与 ZLJ24 亲缘性相近菌株比对并建系统发生树，结果表明该菌株与多株肺炎克雷伯菌 （Klebsiella pneumoniae）高度同源（图2、图3）。进一步采用 Biolog 自动微生物鉴定系统的 GENIII 微孔板鉴定其表型指纹（表1），将 ZLJ24 鉴定为肺炎克雷伯菌。
图1菌株 ZLJ24 的表型特征
注：a 为菌株在平板上形态特征，b 为菌株在液体培养基中的状态，c 为革兰氏染色镜下形态。
图2菌株 ZLJ24 的 16S rRNA 基因系统发育树
注：节点上的数字表示邻居加入分析的引导值，通过邻接法构建，并基于 1000 次重复对其进行评估。图3 同。
图3菌株 ZLJ24 的 nifH 基因系统发育树
表1菌株 ZLJ24 在 Biolog Gen Ⅲ微孔板的反应结果
注：+ 表示可利用或敏感，-表示不可利用或不敏感，—表示介于可利用或敏感和不可利用或不敏感之间。
通过 Biolog ECO 生态板分析，菌株 ZLJ 在 24、 36、48、60、72、84、96、108、120 h 的 AWCD 值分别为 0.46、0.62、0.66、0.75、0.79、0.85、0.82、 0.84、0.85。随着培养时间的延长，AWCD 明显呈现增加的趋势（图4）。Biolog ECO 微孔板中含有 31 种碳源；这些碳源多为常见的植物根系分泌物，因而更能够代表根际土壤微生物群落可利用的碳源，与土壤微生物群落的生态功能更具相关性。
以 nifH-F、nifH-R 为引物对菌株 ZLJ24 的基因组 DNA 样品进行 PCR 扩增，并进行琼脂糖凝胶电泳检测，发现 500 bp 左右清晰可见的特异电泳条带。这表明该菌株含有 nifH 基因，也在一定程度上显示该菌株具有潜在的固氮能力。
图4菌株 ZLJ24 的微孔平均颜色变化率
2.2 菌株 ZLJ24 铁还原能力
2.2.1 菌株铁还原效率
以柠檬酸铁为惟一电子受体进行培养，加入 Fe3+ 的量为 1.08 mg/mL，利用 Ar2 置换瓶中 O2，接着在转速为 180 r/min、30℃ 暗培养 72 h 后，接种 ZLJ24 的处理产生了 0.98 mg/mL 的 Fe2+ （图5）。该菌株铁还原效率为 90.24%，表现出了较高的铁还原能力。
图5菌株 ZLJ24 还原 Fe3+ 的能力
注：加入 Fe3+ 的量为 1.08 mg/mL，对照表示未接种菌株 ZLJ24 培养 72 h，ZLJ24 表示接种菌株 ZLJ24 培养 72 h。**** 表示处理间差异显著（P<0.0001）。
2.2.2 菌株铁还原特征曲线
菌株 ZJL24 在厌氧条件下以柠檬酸铁为唯一电子受体进行培养，测定不同培养时间下 Fe2+ 浓度的变化，得到铁还原特征曲线（图6）。该菌株在培养 1 d 后其 Fe3+ 还原进入快速增长期，2 d 后 Fe3+ 还原率速率减慢。
图6菌株 ZLJ24 的铁还原特征曲线
注：对照表示未接种菌株 ZLJ24 培养，ZLJ24 表示接种菌株 ZLJ24 培养。
2.3 菌株 ZLJ24 的乙炔还原能力
使用乙炔还原法测定了菌株 ZLJ24 在液体阿须贝无氮培养基中的乙炔还原活性。结果显示，菌株 ZLJ24 在 10% 乙炔中培养 24 h，其乙烯生成速率为 89.28 nmol-C2H4/（min·mg 蛋白质）（图7）。
图7菌株 ZLJ24 的乙烯生成速率
注：对照表示未接种菌株 ZLJ24 培养 24 h 未检测到乙烯，ZLJ24 表示接种菌株 ZLJ24 培养 24 h。** 表示处理间差异显著（P<0.01）。
2.4 不同碳源及用量对菌株 ZLJ24 乙炔还原活性的影响
菌株 ZLJ24 在液体无氮培养基中培养 68 h，使用乙炔还原法测定不同碳源及用量对该菌株乙炔还原活性的影响（图8）。结果显示，菌株 ZLJ24 在低浓度葡萄糖处理（含碳量 0.06 mol C）下的乙烯生成速率最高，为 19460.76 nmol-C2H4/（h·mg 蛋白质）；其次是中浓度葡萄糖处理（含碳量 0.30 mol C）下的乙烯生成速率，为 5281.22 nmol-C2H4/（h·mg 蛋白质）。该菌株的乙烯生成速率随着碳源用量的增加而呈下降趋势。
图8菌株 ZLJ24 在不同碳源及用量条件下的乙烯生成速率
注：对照表示碳源为甘露醇（0.30 mol C），碳源前的 L 表示含碳量 0.06 mol C，M 表示 0.30 mol C，L 表示 1.50 mol C。* 表示处理间差异显著（P<0.05），** 表示处理间差异显著（P<0.01）。
3 讨论
增加水稻田生物固氮量不仅可以减少化学氮肥使用和氮环境负效应，还可以降低能源消耗、增加农民收入。然而，该领域的研究进展比较缓慢，特别是针对铁还原细菌生物固氮的研究鲜有报道[32]。以往的研究中，筛选获得的具有生物固氮能力的微生物更多是非铁还原细菌，例如靳海洋等[33]从 3 种水稻土中筛选分离出 7 株固氮蓝细菌，汪蕊露等[34]从玉米根际土壤中筛选到一株自生固氮菌 Azotobacter sp.strain C-5-2，王秀呈[35]从长期稻-稻-绿肥轮作定位农田土壤中筛选获得一株水稻内生固氮菌。接种这类固氮微生物菌株不仅能明显提高生物固氮量，还能增加水稻叶绿素含量、提高植株氮含量和水稻幼苗干重[36]。本研究分离筛选到 1 株具有固氮功能的铁还原细菌，属于变形菌门 γ 变形菌纲，也是水稻土中一类重要的微生物类群[16，19-20]。水稻土中的铁还原细菌具有较强的铁还原能力和固氮能力，具有潜在的开发利用价值。分离筛选这些铁还原细菌，可为构建基于新型生物固氮的绿色低氮稻作生产提供宝贵的菌株资源。
在大多数情况下，固氮酶活性与环境中的无机氮含量呈负相关[37]。然而，氮添加对固氮微生物群落组成和多样性、丰度的负效应也随土壤有机碳浓度的增加而减弱，可能原因是高浓度有机碳提供更多碳源驱动微生物固氮，以及固氮微生物需要维持自身碳氮化学计量比平衡[38]。在水稻田生态系统中，高氮投入往往抑制了生物固氮活性，而这可能与碳源限制有关。已有的研究表明，添加有机物料能促进水稻田生物固氮[39-41]。然而，固氮微生物对碳源的利用情况也存在差异。Li 等[42]发现，外源葡萄糖的添加可能通过促进铁还原细菌的代谢活动来提高其生物固氮量。本研究在不同碳源及用量条件下，发现添加含碳量为 0.06 mol C 的葡萄糖处理中，菌株固氮活性显著高于含碳量为 0.30、 1.50 mol C 的葡萄糖处理，也高于其他碳源处理。在 Biolog 微孔板培养试验中，发现该菌株均能利用甘露醇、葡萄糖、丙氨酸和甲酸，说明碳源种类及用量影响菌株 ZLJ24 的生长及固氮活性，以及潜在的碳限制可能抑制菌株的固氮活性。
龙亚欧等[43]开展的田间原位试验则表明，在传统施氮肥用量基础上减氮 20% 配施纯铁粉，既能保证作物稳产，又能减少包括氨挥发、N2O 排放与硝态氮淋溶等活性氮损失。事实上，除了碳源以外，其他生化反应底物也可能对生物固氮起到重要的调节作用。例如，在土壤微宇宙条件下，Masuda 等[44-45]发现，添加水合氧化铁或氧化铁，可以显著提高 δ 变形菌纲的 Anaeromyxobacter 和 Geobacter 属细菌的固氮活性。因此，在将来的研究中，还需要进一步关注呼吸基质种类和用量等对铁还原细菌生物固氮的影响。
4 结论
从水稻土中分离筛选出一株含 nifH 基因、且在无氮培养基中生长状况良好的菌株 ZLJ24；经 Biolog Gen Ⅲ微孔板鉴定其表型指纹和 16S rRNA 基因、 nifH 基因序列分析，将 ZLJ24 鉴定为肺炎克雷伯菌 （Klebsiella pneumoniae）。在兼性厌氧条件下，暗培养 3 d，菌株 ZLJ24 产生 0.98 mg/mL 的 Fe2+，其铁还原效率为 90.24%。添加不同碳源培养下，菌株 ZLJ24 的固氮能力各不相同。其中，添加葡萄糖处理（含碳量 0.06 mol C）的生物固氮活性最高，为 19460.76 nmol-C2H4/（h·mg 蛋白质）。该菌株的生物固氮活性随着碳源添加量的增加而呈下降趋势。