摘要
为研究秸秆还田下设施黄瓜连作不同年限对土壤细菌群落结构和多样性的影响，探索秸秆还田下连作土壤修复的微生物学机理，以玉米秸秆还田下设施黄瓜连作 1、3、5、10 和 15 年的根区土壤为研究对象，利用高通量测序和实时定量 PCR 技术解析土壤细菌群落组成、群落多样性和潜在功能的变化特征，分析其变化规律。秸秆还田下连作土壤有机质和全氮含量提高，铵态氮含量降低，土壤 pH 呈先降后升的趋势，电导率呈逐年上升的趋势，碱性磷酸酶和蔗糖酶活性升高。不同处理土壤细菌的基因拷贝数为 2.98×109 ～ 7.81×109 个 /g，秸秆还田下连作提高了土壤细菌的丰度。放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、厚壁菌门（Firmicutes）4 个菌门相对丰度稳定在 75% 以上，随着连作年限延长绿弯菌门和酸杆菌门（Acidobacteria）的相对丰度均有所增加，厚壁菌门的相对丰度有所减少。多样性分析表明，秸秆还田下土壤中细菌的多样性无显著变化（P>0.05）。主坐标分析显示，连作可以影响细菌群落结构，不同处理细菌群落结构均差异极显著（P<0.01）。FAPROTAX 功能预测显示，化能异养型和好氧化能异养型为主要类型。共现网络分析中，秸秆还田下连作提升了属水平网络的复杂度和稳定性。冗余分析结果显示，全磷对土壤细菌群落结构的影响最为显著（F=3.5，P=0.002），解释了 21.3% 的群落变化，贡献率依次为全磷 > 铵态氮 > 有效磷 >pH> 速效钾 > 电导率 > 全氮 > 有机质；细菌群落对脲酶的影响最显著（F=4.6， P=0.002），解释了 26.3% 的群落变化，对各酶活的影响顺序为脲酶 > 过氧化氢酶 > 蔗糖酶 > 多酚氧化酶 > 碱性磷酸酶。因此，秸秆还田对稳定连作土壤细菌多样性具有积极作用及在缓解设施作物连作障碍中的有益效果，土壤全磷是影响土壤细菌群落结构变化的主效环境因子，细菌群落的改变对土壤脲酶活性影响最大。
Abstract
The experiment studied the effects of different years of continuous cropping on soil bacterial community structure and diversity in facility cucumber field under straw returning，so as to explore the microbial mechanism of soil restoration of continuous cropping soil．Five different rhizosphere soil treatments were sampled，including continuous corn-returning for 1， 3，5，10 and 15 years．High-throughput sequencing and quantitative PCR were used to analyze the characteristics of soil bacterial community composition，community diversity and potential functions，as well as the change patterns．Continuous cropping under straw returning increased the contents of organic matter，total nitrogen，reduced alkali-hydrolyzale nitrogen．Soil pH decreased first and then increased．With the increase of cropping years，electrical conductivity increased．The activities of alkaline phosphatase and sucrase increased．The gene copy numbers of soil bacteria in different treatments ranged from 2.98×109 to 7.81×109 copies·g -1 soil．It was found that continuous cropping under straw returning increased the abundance of soil bacteria．The relative abundance of Actinobacteria，Proteobacteria， Chloroflexi and Firmicutes was stable at more than 75%．With the increase of cropping years，the relative abundance of Chlorocurvula and Acidobacteria increased，while the relative abundance of Firmicutes decreased．Diversity analysis showed that there were no significant changes in bacteria diversity（P>0.05）．The principal coordinate analysis showed that the differences in bacterial community structure among treatments were highly significant（P<0.01）， which indicated continuous cropping could affect the bacterial community structure．FAPROTAX function prediction showed that chemoheterotrophy and aerobic_chemoheterotrophy were the main types．The co-occurrence network analysis showed that the complexity and stability of the genus level enhanced after continuous cropping．Redundancy analysis showed that total phosphorus had greatest effect on the soil bacterial community structure（F=3.5，P=0.002）， explaining 21.3% of the community changes．The order of contribution was total phosphorus>alkali-hydrolyzale nitrogen>available phosphorus>pH>available potassium>electrical conductivity>total nitrogen>organic matter．The bacterial community had the greatest effect on urease（F=4.6，P=0.002），accounting for 26.3% of the community changes． The order of effect on enzyme activity was urease>catalase>sucrase>polyphenol oxidase>alkaline phosphatase．The positive effect of straw return on stabilizing soil bacterial diversity in continuous cropping and the beneficial effect in mitigating continuous cropping barriers in facility crops were confirmed．Total phosphorus was the main effective environmental factor influencing the changes of soil bacterial community structure．The change of bacterial community had the greatest effect on soil urease activity．
中国是世界上设施作物栽培面积最大的国家，设施蔬菜生产的规模化和复种指数不断提高，农户为追求增产而实施高水、高肥的田间管理模式，导致连作障碍越发严重，主要表现为设施土壤次生盐渍化、酸碱化以及土传病害频发，制约设施蔬菜的可持续发展。连作后出现土壤养分不均匀分布、速效养分和全量养分转化率低等现象，土壤理化性质发生变化，土壤微生物数量和酶活性下降，根际微生物群落选择性富集，有益微生物减少、病原菌增加。土壤微生物是土壤生态系统中的重要组成部分，也是土壤健康质量的一个重要指标，在土壤水分运输、有机物分解、养分吸收和转化等方面都起着重要的作用[1]。土壤细菌多样性相关研究表明，作物连作会降低土壤群落丰富度和多样性，改变菌群结构，使根际微生态环境失衡，从而导致连作障碍发生[2-4]。
玉米秸秆还田作为提升土壤肥力并改善土壤理化性质的重要措施被全国范围推广，还田面积已达种植面积的 50% 以上[5]。秸秆还田可以显著增加土壤有机质含量，改善土壤水、肥、气、热等状况，促进作物光合作用，持续提升土壤质量和耕地肥力，提升农业生态系统的稳定性，有效缓解连作障碍，具有显著的经济、环境和社会综合效益[6]，长期连续秸秆还田增产效果明显[7]。秸杆还田后土壤真菌、放线菌及细菌数量显著增加，土壤过氧化氢酶和脲酶活性显著高于未还田处理[8]。秸秆还田虽然可以有效改良土壤，但能否完全消除长期连作带来的土壤功能障碍及其微生物机制的研究尚少见报道。土壤细菌是农业生态系统中最丰富多样的微生物类群，可以敏感反映土壤生态功能的变化，设施种植土壤处于高温、高湿环境，细菌的多样性和群落结构更具有代表性。因此，研究秸秆还田条件下不同连作年限设施土壤的细菌群落、功能变化特征及其驱动因素，探索连作土壤修复的微生物学机理，对国家提倡秸秆连续还田培肥地力，恢复连作土壤退化性能具有重要意义。本研究以玉米秸秆还田的设施黄瓜连作土壤为研究对象，采用 Illumina MiSeq 高通量测序技术分析土壤细菌群落结构变化，利用 FAPROTAX 数据库进行群落功能注释预测，结合土壤理化性状和酶活性冗余分析，揭示“秸秆还田-微生物介导-土壤性质变化”之间的内在关联性，为连作土壤改良策略的制定提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验概况与试验设计
试验土壤来自喀喇沁左翼蒙古族自治县官大海农场设施黄瓜种植基地（41°13′33″ N、119°63′10″ E），海拔 327 m，土壤类型为褐土。黄瓜种植期为每年 11 月至次年 6 月，7—10 月为休棚期，本试验数据采样时间为 2022 年 6 月。种植前秸秆粉碎还田，还田量为 22500 kg/hm2，起垄后秸秆深度为 30 cm。黄瓜栽培不同年限土壤分别命名连作 1 年土壤（HJ-L1）、连作 3 年（HJ-L3）、连作 5 年（HJ-L5）、连作 10 年（HJ-L10）和连作 15 年（HJ-L15）。每处理设 3 次重复，共 15 个样品。本试验区自 2008 年建成后常年施用农家肥 （牛粪），施用量为 30000 kg/hm2，2018—2021 年施用朝阳五谷丰生物科技有限公司生产的有机肥，整地时以 7500 kg/hm2 作为底肥施入，2021 年开始施用有机肥由辽宁双民农业科技有限公司生产，在整地时以 7500 kg/hm2 作为底肥施入，磷酸氢二铵 750 kg/hm2 作基肥一次性施入，其他田间管理措施相同。
1.2 样品采集
每区设 5 个土壤采样点，黄瓜种植末期按“Z” 形采样法，耕层挖 30 cm，沿切面在根系周围采集 15～25 cm 土壤样品，除去植物根系、碎石等混匀成 1 份，每次采样后用 75% 酒精擦拭土钻。微生物多样性和实时荧光定量 PCR 分析的土壤样品采用液氮保存，土壤理化性质和酶活性测定样品于-4℃下保存。部分土壤风干后研磨过 1 mm 筛，用于测定土壤理化性质。
1.3 土壤基本理化性质和酶活性测定
参照《土壤农化分析》[9]：土壤有效磷采用碳酸氢钠浸提，钼锑抗比色法测定；铵态氮使用氯化钾溶液浸提后通过北京吉天全自动流动注射分析仪 iFIA7 测定；土壤全磷采用氢氧化钠熔融，钼锑抗比色法测定；全氮采用凯氏定氮法测定；速效钾通过乙酸铵浸提，采用火焰光度计法使用普析通用原子吸收 A3 测定；有机质含量采用重铬酸钾-外加热法测定。土壤 pH 按 5∶1 水土比使用 Thermo A211 酸度计测定；电导率（EC）使用 ORIONTDS 型电导率仪测定。
土壤酶活性采用北京索莱宝科技有限公司试剂盒测定：土壤过氧化氢酶（BC0100）、多酚氧化酶（BC0110）、碱性磷酸酶（BC0280）、蔗糖酶 （BC0240）、脲酶（BC0120）。
1.4 土壤微生物总 DNA 的提取和细菌 16S rDNA PCR 扩增及测序
称取 0.5 g 鲜土，采用 E.Z.N.A.®soilDNAkit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.） 试剂盒，根据说明按步骤提取 15 个土壤样品中的微生物基因组 DNA，1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 质量并通过 NanoDrop 2000 对 DNA 进行定量[10]。
扩增和测序委托上海美吉生物医药科技有限公司完成。特异性引物为 338F：5′-ACTCCTAC GGGAGGCAGCA-3′、806R：5′-GGACTACHVGG GTWTCTAAT-3′，对 16S rRNA 基因 V3～V4 区进行 PCR 扩增[11]，每样本 3 个重复。PCR 产物 2% 琼脂糖凝胶电泳（120 V，20 min）检测，AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）回收目的片段。利用 Illumina 公司的 Miseq PE300 平台进行双端测序。
1.5 实时荧光定量 PCR 分析
使用博日 LineGene9600 plus 实时荧光定量 PCR 仪测定细菌 16S rRNA 基因拷贝的丰度。反应体系： ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix 10 μL，采用 1.4 中正反向引物各 0.4 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL， 2 μL DNA，补加 ddH2O 至 20 μL。程序扩增：95℃ 5 min 40 个循环，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s。荧光定量 PCR 扩增效率为 95.68%，R2 为 0.9998。
1.6 序列获取与生物信息分析方法
使用 Fast QC 对测序原始数据进行拼接、过滤，舍弃低质量序列，进行质量控制以获得用于分析的序列。使用 Usearch 11 在 0.97 的相似度进行去冗余、聚类和 OTU 表格生成。采用单因素方差分析方法进行差异显著性分析，用 SPSS 20.0 进行。通过 R 4.4.2 比较处理细菌门、科水平的相对丰度，选择相对丰度 >1% 的为优势菌门，选择相对丰度 >2% 的为优势菌科，采用 Origin 8.5 进行柱状图绘制。采用 Mothur[12] 计算 Shannon 指数和 Chao1 指数来表征细菌群落的 α 多样性。基于 Bray_curtis 距离矩阵的 PCoA 来分析细菌群落的群落结构和聚类分析。采用 R 中 ggClusterNet 包构建关系网络，调用 psych 包中的 corr.test 函数计算 Spearman 相关系数，Spearman 相关系数和 P 值阈值分别设定为 0.6 和 0.05，N 参数提取丰度最高的 200 个属。通过 FAPROTAX 数据库进行细菌功能预测。使用 CANOCO 将土壤理化性质、酶活性分别细菌门水平群落结构进行冗余分析（RDA）。
2 结果与分析
2.1 秸秆还田下不同连作年限土壤理化性质和酶活性的变化
秸秆还田下不同年限连作土壤养分含量及 pH、电导率变化如表1所示。土壤有机质含量在秸秆还田第 3 年开始显著提升（P<0.05），并且观测期内趋于稳定，HJ_L3 处理含量最高，比 HJ_L1 处理显著提高 41.8%。连作土壤 pH 呈先降后升的趋势，HJ_L5 处理降低至 6.93，比 HJ_L1 处理下降 5.33%，HJ_L15 处理回升幅度达到 11.40%。全氮含量无规律波动，HJ_L1 处理含量最低，HJ_L15 处理含量最高，相差 2.22 倍，但是铵态氮含量从 HJ_L5 处理开始大幅降低（P<0.05），说明连作后土壤中可利用的氮含量降低。土壤全磷含量在 HJ_ L5 处理中最高，HJ_L10 和 HJ_L15 处理显著下降 （P<0.05），有效磷则是 HJ_L15 处理最高，其他观测期变化趋势与全磷一致。电导率呈逐年上升的趋势，说明土壤内可溶盐含量逐渐增加，在黄瓜连作 10 年时已转为轻盐化土壤（0.37<电导率 <0.96）。
由表2可以看出，秸秆还田下连作不同年限可引起连作土壤酶活性的改变。过氧化氢酶在 HJ_ L10 处理中最高，蔗糖酶活性在处理 HJ_L3、HJ_ L5、HJ_L10 和 HJ_L15 中显著提升，在 HJ_L10 处理中最高，是 HJ_L1 处理的 2.9 倍。多酚氧化酶和碱性磷酸酶活性在 HJ_L15 处理中最高，分别是 HJ_L1 处理的 2.8 和 2.1 倍。脲酶活性在各处理土壤中表现为 HJ_L10>HJ_L3>HJ_L1>HJ_L5>HJ_L15。
表1秸秆还田下不同连作年限土壤理化性质变化
注：同列数字后的字母不同表示各处理在 0.05 水平上差异显著。下同。
表2秸秆还田下不同连作年限土壤酶活性
2.2 秸秆还田下连作土壤细菌 16S rRNA 基因丰度的变化
秸秆还田下不同连作年限土壤中细菌 16S rRNA 基因拷贝数为 2.98×109～7.81×109 个 /g（图1）。与 HJ_L1 处理相比，连作后土壤中细菌拷贝数显著提升 （P<0.05），其中 HJ_L10 处理的细菌 16S rRNA 基因拷贝数最多，为 7.81×109 个 /g，比 HJ_L1（2.98×109 个 /g）处理增加 2.6 倍，HJ_L5、HJ_L3、HJ_L15 处理比 HJ_L1 处理分别增加 115.8%、113.8%、82.3%。
图1秸秆还田下不同连作年限土壤细菌 16S rRNA 基因拷贝数
注：柱上字母不同表示各处理在 0.05 水平上差异显著。
2.3 秸秆还田下连作土壤细菌丰度和群落组成变化
通过高通量测序，5 个处理样品共获得 774270 条优化序列，321242080 个优化碱基数，每个样本为 43215～65187 条优化序列（平均 51618 条优化序列），平均长度 414 bp。将获得的数据在 97% 相似性水平上进行分类，检测得到了 38 个门、129 个纲、311 个目、510 个科、968 个属、5952 个 OTU。在门分类水平上，5 个处理土壤样品的优势菌门均为放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、厚壁菌门（Firmicutes）、酸杆菌门（Acidobacteria）（图2a），相对丰度分别为 25.20%～34.64%、24.53%～31.58%、7.85%～14.34%、7.64%～14.19%、4.15%～8.65%，约占总体群落的 83.80%～87.10%。另外，样品中还检测到很多相对丰度较低的细菌门，如拟杆菌门 （Bacteroidetes，2.20%～5.37%）、芽单胞菌门 （Gemmatimonadetes，2.71%～4.46%）、Patescibacteria （1.16%～3.55%）、黏球菌门（Myxococcota，0.93%～2.35%）、Cyanobacteria（0.07%～1.09%）。秸秆还田下不同年限连作土壤细菌门水平上群落组成如图2a所示，HJ_L5 处理放线菌门相对丰度最高， HJ_L1 处理厚壁菌门和 Cyanobacteria 相对丰度最高，HJ_L3 处理中变形菌门高于其他处理。随着连作年限的延长，绿弯菌门和酸杆菌门的相对丰度均有所增长，厚壁菌门相对丰度均有所减少。
在科分类水平上，丰度 2% 以上的科主要有鞘脂单胞菌科（Sphingomonadaceae） （3.53%～7.03%）、类诺卡氏菌科（Nocardioidaceae）（3.96%～7.55%）、芽孢杆菌科（Bacillaceae）（1.51%～6.64%）、微球菌科（Micrococcaceae）（0.37%～10.17%）、小单孢菌科（Micromonosporaceae）（1.51%～4.30%）、 JG30-KF-CM45（2.11%～3.53%）、芽单胞菌科 （Gemmatimonadaceae）（2.14%～3.89%）、黄单胞菌科（Xanthomonadaceae）（1.60%～3.46%）、Vicinamibacteraceae（1.01%～3.57%） 和 uncultured_o_ Vicinamibacterales（1.16%～3.18%）等（图2b）。不同连作年限土壤样品的优势科鞘脂单胞菌科、类诺卡氏菌科、芽孢杆菌科在 HJ_L1 处理相对丰度最高，随后不同程度下降。微球菌科、芽单胞菌科在 HJ_ L5 处理中相对丰度最高。
图2秸秆还田下不同年限土壤细菌门（a）、科（b）分类水平上群落组成变化
2.4 秸秆还田下连作土壤细菌群落多样性分析
Chao1 指数用于估算样品中所含 OTU 总数， Chao1 指数和 ACE 指数用于描述菌群丰富度，指数越大说明细菌群落丰度越高。Shannon 指数反映细菌群落 α 多样性，数值越大说明细菌群落多样性越高。Goods_coverage 指数用于描述测序深度，数值越高表明未被检出的概率越低。由表3可以看出，不同连作年限土壤 Shannon 指数处理间差异不显著（P>0.05），但随着连作年限的延长，Chao1 指数和 ACE 指数值均呈不同程度的降低趋势，HJ_ L10 和 HJ_L15 处理显著降低（P<0.05）。
表3土壤细菌α多样性指标
对土壤细菌群落整体进行主坐标分析（PCoA） （图3），组间明显分开，证实不同年限根连作土壤细菌群落结构均差异极显著（P<0.01）；ANOSIM 分析表明，不同年限之间的细菌群落结构的差异明显高于组内差异，说明各处理分组合理。
图3土壤细菌群落主坐标分析（PCoA）
2.5 秸秆还田下不同连作年限土壤细菌潜在功能分析
通过 FAPROTAX 对土壤中细菌的潜在功能进行预测，将功能类别中排名前 10 在不同处理间的数量绘制成相对百分比图，秸秆还田下各处理功能细菌百分比存在差异。如图4所示，5 个处理中化能异养型和好氧化能异养型为主要类型，可以通过氧化分解秸秆中的有机碳化合物促进自身的生长繁殖。化能异养型、好氧化能异养型、几丁质溶解、发酵作用在 HJ_L10 处理中最高，比 HJ_L1 处理分别高 14.4%、5.4%、168.7%、166.5%；芳香族化合物降解、碳氢化合物降解、尿素分解在 HJ_L5 处理中最高，其中碳氢化合物降解是 HJ_L1 处理的 2.5 倍；锰氧化 HJ_L3 处理中最高，硝酸盐还原、木聚糖分解在 HJ_L15 处理中最高，分别是 HJ_L1 处理的 1.9 和 2.6 倍。
图4各处理土壤前 10 种细菌功能累积占比
细菌属水平生态集群及构建的共现网络如图5所示，各处理相关性程度不同，其中随着连作年限的延长，各处理连接数和平均连通度均高于 HJ_L1 处理，说明秸秆还田下连作提升了属水平共现网络的复杂度。HJ_L3 处理细菌共现网络的连接线中正相关比例略低于 HJ_L1 处理，其余 3 个处理正相关比例均高于 HJ_L1 处理（表4）。
图5细菌属水平共现网络
表4土壤细菌属水平共现网络特征参数
在 5 个处理所有节点中，变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）为占比最多的节点，分别占 30.0%～37.5%、 21.0%～24.0%、20.0%～25.5%，说明变形菌门、放线菌门、厚壁菌门与其他物种的相关性密切，在土壤中占有非常重要的地位。
2.6 土壤细菌群落与土壤理化性质和酶活性间的相关分析
通过 Canoco 将 5 个处理的土壤理化性质和酶活性分别与土壤门水平群落组成进行 RDA 分析（图6a），发现土壤全磷（F=3.5，P=0.002）对细菌群落的影响最显著，解释了 21.3% 的群落变化； 其次是土壤铵态氮（F=2.4，P=0.018），解释了 19.2% 的群落变化，所有理化性质总共解释了 69.4% 的群落变化，影响顺序依次为土壤全磷 >铵态氮 >有效磷 >pH>速效钾 >电导率 >全氮 >有机质。土壤全磷、铵态氮、有效磷、pH 是影响土壤细菌群落结构的主要环境因子，全磷对 Actinobacteriota、Patescibacteria、Firmicutes、 Gemmatimonadota 和 Cyanobacteria 均有正相关作用，对 Bacteroidota、Acidobacteriota、Myxococcota、Chloroflexi 和 Proteobacteria 均有负相关作用。RDA 前 2 个轴总共解释 44.77% 的群落变化，第 1 个轴解释 29.41%，第 2 个轴解释 15.36%。
将土壤酶活性与土壤细菌群落作 RDA 分析 （ 图6b），结果显示，RDA 前 2 个轴总共解释 48.74% 的群落变化，第 1 个轴解释 31.11%，第 2 个轴解释 17.63%。细菌群落对脲酶（F=4.6， P=0.002）的影响最显著，解释了 26.3% 的变化，其次是过氧化氢酶（F=2.7，P=0.024）和蔗糖酶 （F=2.4，P=0.02）分别解释了 12.0% 和 12.5% 的变化，细菌群落共解释了 64.0% 的酶活性变化，对酶活性影响顺序依次为脲酶 >过氧化氢酶 >蔗糖酶 >多酚氧化酶 >碱性磷酸酶。脲酶是受土壤细菌群落结构影响的主要酶活性因子，其中 Chloroflexi、 Acidobacteriota、Myxococcota、Bacteroidota 和 Proteobacteria 与其表现为正相关，Gemmatimonadota、 Actinobacteriota、Firmicutes、Patescibacteria 和 Cyanobacteria 表现为负相关。
图6土壤理化性质（a）和酶活性（b）与细菌门水平群落组成冗余分析
注：OM、TN、TP、AN、AP、AK、EC 分别表示有机质、全氮、全磷、铵态氮、有效磷、速效钾、电导率。CAT、PPO、ALP、SC、UE 分别表示过氧化氢酶、多酚氧化酶、碱性磷酸酶、蔗糖酶、脲酶。
3 讨论
3.1 秸秆还田条件下连作土壤细菌与土壤理化性质的相关性
长期连作会导致土壤养分失衡、土壤酶活性降低、土壤微生物总量和群落结构及多样性降低，从而降低了作物产量和品质[13]。作者前期研究发现，设施黄瓜连作导致土壤细菌多样性显著下降[14]，真菌多样性增加，土壤由“细菌型”向“真菌型” 转化[15]。秸秆还田可以提升土壤碳储量，改变土壤物理结构特性和微生物群落组成，影响土壤养分循环过程，有效缓解连作带来的诸多障碍[16]。本研究中，采用秸秆还田处理后，用于衡量物种多样性的 Shannon 指数显示连作土壤细菌多样性没有显著差异（P>0.05），这与之前报道中连作土壤细菌多样性显著下降结果不一致[17-18]，应该是由于秸秆还田对稳定土壤细菌多样性具有一定积极作用，同样在玉米等作物[19-20]中也得到证实。细菌群落和多样性变化受土壤类型、作物种类、耕作方式等多因素影响，如水稻栽培采用秸秆还田则显著提升土壤细菌群落多样性[21]。Chao1 指数和 ACE 指数用于估算群落中物种总数，反映群落的丰富度。秸秆还田条件下连作年限增加，除第 5 年外，其余土壤细菌丰富度均显著低于首年秸秆还田处理 （P<0.05），说明即使在秸秆还田情况下，连作后土壤中细菌的 OTU 总数依然呈下降趋势，细菌群落丰富度降低，不能完全消除连作障碍带来的微生物区系改变。
常温木质素、纤维素降解细菌多归属于放线菌门、变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门[22-24]，放线菌是相对寡营养菌，可以产生有效降解有机碳的活性酶，加速秸秆等有机物的降解，兼性利用易分解碳源和难分解碳源[25-26]。变形菌门是细菌中最大的门类，也是变化最快的门类，对环境因素反应敏感，与土壤碳固定和芳香族污染物降解关系密切[27-28]。厚壁菌门细菌在有机质分解中发挥重要作用，促进纤维素的降解，与大多数碳代谢途径具有显著的正相关[29]。拟杆菌普遍存在土壤生态系统和各种真核宿主相关联，在秸秆厌氧分解过程中发挥非常重要的作用，介导的多聚糖类有机物质分解[30-31]。作物连作后，放线菌门、变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门 4 个细菌门相对丰度显著降低[32]，且研究发现 4 个门与病原真菌的拮抗相关[33]，本研究各处理土壤中 4 个菌门相对丰度均稳定在 75% 以上，说明秸秆还田可以通过提升有益菌丰度，有利于驱动土壤中有益微生物群落结构稳定，这与前人研究结果一致[34]。绿弯菌门丰度随观测时间延长逐步增加，它的营养方式多样化包括光能自养、光能异养、化能自养、化能异养和混合营养等，是碳、氮、硫等元素地球化学循环的重要驱动者，自养型绿弯菌驱动碳-硫耦合、碳-氮耦合、碳-铁耦合推动无机碳的同化[35-36]。绿弯菌门相对丰度增高趋势与土壤电导率变化趋势一致，推测与秸秆还田持续改善土壤理化性质以及化肥稳定投入有关，设施环境内碳容量、可溶盐含量逐渐增加，土壤由非盐化（电导率 <0.37）向轻盐化（0.37<电导率 <0.96）转变，使绿弯菌门在微环境与菌群协同稳定方面扮演的角色越发重要。
土壤 pH 呈现先降后升的趋势，在 HJ_L5 处理中 pH 出现拐点，推测是由于秸秆还田使得土壤有机质含量提高，在前期的秸秆分解过程中生成二氧化碳和大量有机酸，导致短期还田土壤 pH 降低，但秸秆还田在一定程度上对土壤 pH 起到调节作用，最终维持在中性水平。土壤酶活性在土壤碳氮代谢和养分循环过程中发挥着重要作用，与土壤化学性质、养分含量有着紧密的联系，是评价土壤肥力的关键因素[37]。脲酶、过氧化氢酶、碱性磷酸酶、多酚氧化酶活性大致呈现酸化抑制、碱化激活的规律。在 HJ_L5 处理中，过氧化氢酶、多酚氧化酶、碱性磷酸酶和脲酶活性出现同样的降低趋势，推测与 pH 的降低密切相关。微球菌属是化能异养菌，代谢为严格的呼吸型，通常可利用的碳水化合物有丙酸盐、乙酸盐、乳酸盐、琥珀酸盐、谷氨酸盐。在酸性条件下形成的盐是微球菌科的良好营养物质，因此该菌属相对丰度在 HJ_L5 处理中增加可能与 pH 的降低相关。
3.2 秸秆还田下连作土壤细菌潜在功能分析
秸秆还田可提供大量的有机物质，促进根区菌群的繁殖，影响菌群的结构和功能。化能异养和好氧化能异养是菌群的基础营养方式，与碳循环相关，执行最广泛的生态系统功能[38]。本研究中放线菌门、变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门 4 个菌门相对丰度均稳定在 75% 以上（图4），同样这 4 类微生物执行的化能异养和好氧化能异养功能也是秸秆还田条件下连作土壤的主要功能类型。化能异养型、好氧化能异养型随着连作年限的延长呈现先降低后升高的趋势，发酵作用是葡萄糖代谢的一种厌氧途径，连作后各处理丰度得到提升，3 种类型均在 HJ_L10 处理中最高，表明秸秆还田条件下连作土壤中有更高比例的细菌参与土壤碳循环，更有利于有机质释放出更多的无机养分，供作物吸收利用，这可能是秸秆还田缓解连作障碍的一种途径。
筛选细菌属水平具有显著差异的排名前 10 的属（图7），Gaiella、g_unclassified_f_JG30-KF-CM452、链霉菌属（Streptomyces）、g_uncultured_f__Xan-thobacteraceae 和 g_unclassified_f_A4b 的相对丰度在连作后显著升高。其中 Gaiella 和 Streptomyces 属于放线菌门，在土壤中具有促进植物残体降解和抑制病原菌传播的作用，连作后相对丰度的提升与土壤生态健康的提升密切相关[39-40]。萨如拉等[41]研究显示秸秆还田后增加了有益细菌 Gaiella 属相对丰度，Gaiella 属被证明为抑制番茄枯萎病的关键微生物类群[42]。链霉菌属具备良好的木质纤维素降解能力[43]，可产生活性代谢产物拮抗部分病原菌，具有明显的抑制效果[44]。g_unclassified_f_JG30-KF-CM452 属能够降解化学杀虫剂和除草剂[45]。这些优势菌属相对丰度的升高也进一步证实秸秆还田条件下不同年限连作土壤的连作障碍得到缓解，土壤功能得到提升。虽然通过功能预测分析能部分反映秸秆还田下连作土壤细菌功能丰度的改变，但土壤中大量细菌的功能仍未知，有待进一步深入研究。
图7属水平具有显著差异排名前 10 丰度变化
4 结论
（1）秸秆还田条件下连作 3 年后细菌 16S 基因丰度显著提升，证实秸秆还田对稳定土壤细菌多样性具有积极作用及在缓解设施黄瓜连作障碍中的有益效果。
（2）秸秆还田下连作土壤放线菌门、变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门相对丰度均稳定，与有机物降解和土壤碳固定关系密切，属水平共现网络复杂度和稳定性得到提升。
（3）土壤细菌群落与土壤理化性质和酶活性间的相关性总结。土壤全磷是影响土壤细菌群落结构变化的主效环境因子，细菌群落的改变对土壤脲酶活性影响最大。
