摘要
连作障碍是影响名贵中药材三七种植业的主要瓶颈，而真菌群落变化是三七连作障碍的主要成因。利用土培试验，探索蚯蚓活动对三七连作土壤真菌群落的调节效应；向三七连作土壤中添加赤子爱胜蚓（Eisenia foetida），牛粪添加量为 0%（M0）、1%（M1）、2%（M2）和 5%（M3），以未处理的连作土为对照（CK）。土培 2.5 个月后，采集土样，测定土壤团聚体结构特征、理化性质和酶活性；利用高通量测序技术，分析土壤真菌群落组成与多样性，并探索土壤理化因子与真菌群落变化的关联性。结果表明：与 CK 相比，M1 ～ M3 处理增加了土壤水稳性大团聚体含量；此外，M0 处理下土壤电导率、有机质与速效氮、磷、钾含量降低，而随着牛粪添加量的增加（M1 ～ M3），土壤电导率、有机质与速效养分含量相应升高；M3 处理下土壤蔗糖酶、过氧化氢酶与磷酸酶活性最高，较 CK 分别提高了 15.19 mg·g -1、5.55 mg·L-1 与 0.73 mg·g -1（P<0.05）。与 CK 相比，添加蚯蚓（M0 ～ M3）使土壤中潜在病原菌镰孢菌属（Fusarium）与癣囊腔菌属（Plectosphaerella）相对丰度分别降低了 1.09% ～ 2.27% 与 0.21% ～ 0.28%，潜在有益菌半乳糖霉属（Galactomyces）与曲霉属（Aspergillus）相对丰度分别升高了 7.75% ～ 17.70% 与 0.15% ～ 0.32%；网络分析表明，蚯蚓活动增加了土壤微生物群落的复杂性。因此，添加蚯蚓有望成为改良三七连作土壤、消减连作障碍的有效措施。
Abstract
Continuous cropping obstacle is a major bottleneck affecting the cultivation of the precious herb Sanqi （Panax notoginseng），and changes in fungal communities in the soil are the key factor leading to the continuous croping obstacle．In this study，a pot experiment was conducted to explore the regulation effects of earthworm activity on the soil fungal community under continuous cropping of Sanqi．Eisenia foetida was added to the soil and cow dung was added at 0%（M0），1%（M1），2%（M2），and 5%（M3），with untreated soil being the control（CK）．After 2.5 months of pot experiment，soil samples were collected to determine soil aggregates，physicochemical properties，and enzyme activities．Moreover，high-throughput sequencing technology was used to analyze the composition and diversity of soil fungal communities，and the correlations between soil physicochemical factors and changes in fungal communities were explored． The results showed that M1-M3 treatments increased the content of water-stable macroaggregates．In addition，compared to CK，soil electrical conductivity，organic matter，and available nitrogen，phosphorus，and potassium contents decreased under the M0 treatment；with the increase in the amount of cow manure addition（M1-M3），the soil electrical conductivity， organic matter，and available nutrient contents increased correspondingly；under M3 treatment，the activities of sucrase， catalase and phosphatase in soil were the highest，which increased by 15.19 mg·g -1，5.55 mg·L-1 and 0.73 mg·g -1， respectively（P<0.05）．Compared with CK，the addition of earthworms（M0-M3）reduced the relative abundance of Fusarium，and Plectosphaerella，which were the potential pathogens in soil，by 1.09%-2.27% and 0.21%-0.28%， respectively；however，the relative abundance of potential beneficial fungi Galactomyces and Aspergillus increased by 7.75%- 17.70% and 0.15%-0.32%，respectively．Network analysis indicated that earthworm activity increased the complexity of soil fungal communities．Therefore，earthworm activity was expected to be an effective measure to improve the soil health under continuous cropping of Sanqi and reduce the continuous cropping obstacle.
三七（Panax notoginseng）是五加科人参属草本植物，为多年生名贵中药材，具有活血散瘀与降血压等功效[1]，在我国中医药行业中具有重要影响，已成为仅次于人参的中药材大品种[2]。三七具有严重的连作障碍问题，已成为限制其种植业发展的瓶颈[3]。因此，消减三七连作障碍问题，促进三七种植业持续健康发展显得十分迫切。
在土壤生态系统中，真菌是有机质的主要分解者[4]。土壤真菌群落变化与镰孢菌（Fusarium）、癣囊腔菌（Plectosphaerella）和链格孢菌（Alternaria） 等病原菌丰度升高，被认为是导致三七连作障碍的主要因素[5-6]。当前主要依靠喷施农药和土壤熏蒸等消减三七连作障碍问题，但不合理地使用农药可能导致三七农残超标，给人体健康带来潜在安全隐患；土壤熏蒸对连作障碍的消减效果较好，但熏蒸剂对环境可能造成不良影响，限制了其大规模的推广应用[7]。
作为土壤生态系统的工程师，蚯蚓在维持土壤生态系统功能方面起到了重要作用。蚯蚓通过取食、掘穴等行为来调节土壤微生物群落结构及功能，提高土壤速效养分含量与作物抗病能力[8-9]。此外，蚯蚓会选择性地食用土壤中的真菌，通过破坏真菌的菌丝结构导致土壤中病原菌数量减少[10-11]。研究表明，蚯蚓活动可有效消减草莓、番茄、西瓜等作物连作障碍问题[12-14]；然而，针对名贵药用植物三七连作土壤的研究还未见报道。本研究以三七连作土壤为研究对象，探究蚯蚓活动对土壤理化性质、酶活性与真菌群落的影响，为改良三七种植土壤、消减连作障碍问题提供新的科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验设计
本研究于 2023 年 6—8 月在云南师范大学呈贡校区内的温室（24°51′44″ N，102°51′18″ E）中进行，试验区海拔 1977 m，年平均降水量约 818.4 mm，平均气温约 18℃。供试土壤为三七连作土，于 2023 年 4 月采自文山三七科技示范园，经自然风干过筛后用于试验研究，其 pH 为 7.88，电导率 （EC）为 0.37 mS·cm-1，有机质含量为 4.90%，铵态氮含量为3.33 mg·kg-1，硝态氮含量为71.25 mg·kg-1，有效磷含量为 55.81 mg·kg-1，速效钾含量为 501.95 mg·kg-1；供试蚯蚓为赤子爱胜蚓 （Eisenia foetida），每条重 0.11～0.13 g。
采用温室土培试验，共设置 CK（自然连作土）、 M0（0% 牛粪 + 赤子爱胜蚓）、M1（1% 牛粪+ 赤子爱胜蚓）、M2（2% 牛粪 + 赤子爱胜蚓）与 M3 （5% 牛粪 + 赤子爱胜蚓）5 个处理，每个处理重复 4 次；每个试验盆经清洗干净并晾晒后，添加 2 kg 土壤（干重），按试验设计添加牛粪，均匀混合后，投放 20 条生长较为均一的赤子爱胜蚓，试验期间适当浇水，确保土壤湿润。
1.2 土壤理化性质和酶活性分析
蚯蚓投放 2.5 个月后采集土样，自然风干后分别研磨过 0.85 和 0.15 mm 筛，参照《土壤农业化学分析方法》测定土壤理化因子[15]。土壤 pH 用 pH 计（雷磁 pHS-25）进行测定，水土比为 2.5∶1；土壤 EC 采用 EC 计（COMBI 5000） 进行测定，水土比 5∶1；铵态氮和硝态氮用 0.1 mol·L-1 氯化钾溶液浸提，使用流动分析仪 （AA3，Seal Analytical，Germany）进行测定；土壤有效磷用 0.5 mol·L-1 碳酸氢钠溶液浸提，用钼锑抗比色法进行测定；土壤速效钾用 0.5 mol·L-1 醋酸铵溶液浸提，用火焰光度计（AA3，Model410 Flame Photometer，Germany）进行测定；土壤有机质用重铬酸钾-硫酸消解液消解，用 0.1 mol·L-1 硫酸亚铁溶液滴定法进行测定；土壤磷酸酶、脲酶、蔗糖酶与过氧化氢酶活性的测定与表示方法参照王豪吉等[16]的方法进行。
1.3 土壤真菌群落分析
参照赵林艳等[17] 的方法，准确称取 1 g 土壤样品提取总DNA，使用引物 ITS1-F（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和 ITS2-R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）进行扩增。采用 AMPure XP 试剂盒（Beckman Coulter Life Sciences，USA）和 QuantiFluor ™-ST 荧光定量系统（Promega，USA），对 PCR 扩增片段进行纯化和定量，用 Illumina HiSeq 2500 PE250 系统进行高通量测序。
1.4 统计分析
用 FLASH 1.2.7[18] 和 Trimmomatic 0.33[19] 对高通量测序产生的原始数据进行质控过滤，并使用 Cutadapt 1.9.1[20] 去除引物序列，得到 Clean Reads。使用 Usearch 10[21] 对 Clean Reads 进行拼接与过滤，并使用 UCHIME 4.2[22]去除嵌合体。使用 UPARSE[23] 按 97% 的序列相似性划分 OTUs，并使用 RDP 以真菌 ITS UNITE 数据库（https：// unite.ut.ee/）为参照，对 OTU 进行分类注释。使用 MOTHUR[24] 计算微生物群落 Chao1 指数、 ACE 指数、Shannon 指数与 Simpson 指数。利用 R 4.4.0“Hmisc”igraph 包构建共现网络（|Spearman 相关系数 |>0.5，P<0.05）；用网络节点数和边数来反映真菌群落（属水平）网络复杂性；利用 Gephi 0.10.1 绘图。
利用单因素方差分析与 Duncan 多重比较检验不同处理间土壤理化性质与真菌多样性的差异显著性；利用冗余分析（RDA）探索不同处理间真菌群落分化特征及其与土壤因子的关联性； 以上分析均利用 SPSS 16.0 与 CANOCO 4.5 进行。
2 结果与分析
2.1 蚯蚓活动对三七连作土壤理化性质的影响
三七连作土壤主要以粒径 <1 mm 水稳性团聚体为主，占比 80% 以上。与 CK 相比，M1～M3 处理能有效提升粒径 0.25～2 mm 大团聚体的比例，降低粒径≤ 0.25 mm 微团聚体的比例（图1）。单因素方差分析表明，不同处理间土壤 EC 和有机质、铵态氮、硝态氮、有效磷、速效钾含量具有显著差异。与 CK 相比，M0 处理下土壤 EC 和有机质、速效氮、磷、钾含量降低，而 M1～M3 处理提高了土壤 EC 与有机质、速效养分含量；M3 处理下，土壤 EC 增加了 0.11 mS·cm-1、有效磷含量增加了 48.79 mg·kg-1、速效钾含量增加了 583.74 mg·kg-1、铵态氮和硝态氮含量分别增加了 3.05 和 12.68 mg·kg-1，而土壤 pH 的变化不显著 （表1）。M3 处理下，土壤脲酶、蔗糖酶、过氧化氢酶和磷酸酶活性最高，较 CK 分别提高了 0.06 mg·g-1、15.19 mg·g-1、5.55 mg·L-1 和 0.73 mg·g-1 （表2）。
图1蚯蚓活动对三七连作土壤水稳性团聚体的影响
表1蚯蚓活动对三七连作土壤理化特征的影响
注：表中数值为平均值 ± 标准差，不同小写字母代表不同处理间具有差异显著性（P<0.05）。下同。
表2蚯蚓活动对三七连作土壤酶活性的影响
2.2 蚯蚓活动对三七连作土壤真菌群落组成的影响
在门分类水平上，子囊菌门和担子菌门是三七连作土壤优势真菌类群。CK 处理子囊菌门的相对丰度为 60.42%，M0～M3 处理下其相对丰度分别为 43.85%、56.51%、55.66%、59.70%；CK 处理担子菌门的相对丰度为 8.34%，M0～M3 处理下其相对丰度分别为 27.35%、13.66%、21.93%、8.85%。单因素方差分析和 Duncan 多重比较表明，蚯蚓活动提高了三七连作土壤中半乳糖霉属（Galactomyces）、曲霉属（Aspergillus）等的相对丰度，降低了镰孢菌属（Fusarium）、癣囊腔菌属（Plectosphaerella）和小壶菌属（Spizellomyces）等的相对丰度（图2A-E）； 被孢霉属（Mortierella）相对丰度随牛粪添加量的增加呈先增后降的趋势（图2F）。
2.3 蚯蚓活动对三七连作土壤真菌群落 Alpha 与 Beta 多样性的影响
原始测序数据经拼接、过滤与去除嵌合体后，基于 97% 的序列相似性划分OTU，共得到真菌 OTU 1490 个，隶属于 14 门 50 纲 111 目 235 科 456 属 624 种。不同生境中均有分布的真菌 OTU 数为 296 个，CK 处理特有 OTU 数为 269 个，M0 处理为 120 个，M1 处理为 119 个，M2 处理为 132 个，M3 处理为 158 个。添加蚯蚓后土壤真菌群落 Chao1 指数、ACE 指数、Shannon 指数与 Simpson 指数均高于 CK 处理，且 M0 处理最高（图3）。非度量多维尺度（NMDS）分析表明，添加蚯蚓后土壤真菌群落具有明显的分化特征（图4A）。RDA 分析显示，第一排序轴和第二排序轴分别解释了 38.59% 和 11.05% 的真菌群落变化；土壤有效磷、速效钾和有机质含量与镰孢菌属和癣囊腔菌属的相对丰度呈负相关（图4B）。
图2蚯蚓活动调控三七连作土壤中代表性真菌属的相对丰度
注：A：镰孢菌属，B：癣囊腔菌属，C：小壶菌属，D：半乳糖霉属，E：曲霉属，F：被孢霉属。
图3蚯蚓活动调控三七连作土壤真菌群落 Alpha 多样性指数
2.4 蚯蚓活动对三七连作土壤真菌群落网络复杂性的调控作用
网络分析表明，不同处理下网络节点数为 M2>M0>M1>M3>CK，边的数量为 M0>M1>M3>M2>CK，均为 CK 最低；网络节点数最高为 M2 处理，边数最高为 M0 处理，较 CK 分别提高 28% 和 164%；与 CK 相比，不同处理下网络正相关占比升高（表3，图5）。
图4不同处理间土壤真菌群落的分化特征及代表性真菌类群与环境因子的关联性
注：SOM、NH4 +-N、NO3--N、AP、AK、EC 分别表示土壤有机质、铵态氮、硝态氮、有效磷、速效钾、电导率。Stress 为应力值。
3 讨论
3.1 蚯蚓活动对三七连作土壤理化性质与酶活性的影响
本研究结果表明，M1～M3 处理提高了土壤水稳性大团聚体含量，可能是因为蚯蚓对牛粪的吞食作用以及蚯蚓分泌物等的影响，提高了土壤团聚体稳定性，有利于增加土壤孔隙度，改善土壤结构[25-26]。Ma 等[27]研究表明，蚯蚓活动增加了三叶草种植土壤中大团聚体含量，减少了微团聚体含量；Wu 等[28]研究表明，蚯蚓的存在显著增加了森林土壤中大团聚体的含量，与本研究结果一致。本研究表明，与 CK 相比，M0 处理下（未添加牛粪）土壤 EC、有机质与速效氮、磷、钾含量降低 （表1），可能与蚯蚓对土壤中有机质的吞食以及分泌物对养分离子的吸附等有关。M1～M3 处理下土壤有机质与速效养分含量升高；一方面，牛粪是富含养分的有机物，其施入土壤中可直接提高土壤有机质与速效养分含量；另一方面，蚯蚓对牛粪的吞食与消化作用可能提高了土壤中速效养分的含量[29]。Lu 等[30]研究发现，在已添加牛粪的百合连作土壤中接种蚯蚓，可快速将牛粪转化为蚯蚓粪，提高土壤速效养分含量。蚯蚓活动对土壤 pH 的影响较小，与 Paz-Ferreiro 等[31]研究结果相似。本研究表明，M3 处理显著提高了土壤蔗糖酶、过氧化氢酶与磷酸酶活性，可能与蚯蚓对牛粪的吞食消化作用及对微生物群落的调节作用有关[32]。Li 等[33]的研究也表明，秸秆还田处理下蚯蚓的存在显著提高了土壤磷酸酶与过氧化氢酶活性。
3.2 蚯蚓活动对三七连作土壤真菌群落多样性及网络复杂性的调控作用
本研究表明，蚯蚓活动提高了土壤真菌群落 ACE 指数、Chao1 指数、Shannon 指数和 Simpson 指数。一方面，蚯蚓自身可能携带大量真菌；另一方面，蚯蚓活动可能改善土壤理化环境，促进多种真菌共存，从而提高土壤真菌多样性[34]。已有研究表明，蚯蚓活动可增加黄瓜种植土壤真菌多样性[35]。真菌多样性与功能的关系是土壤生态学研究的热点问题，Zhao 等[36]研究表明，施加生物炭显著提高了三七连作土壤真菌多样性，降低了三七根腐发病率。本研究发现，蚯蚓活动使土壤中镰刀菌属、癣囊腔菌属与小壶菌属等潜在病原真菌相对丰度降低（图2）。根腐病高发是三七连作障碍的主要表现形式，而镰刀菌是三七根腐病的主要病原菌，其还可引发白及、西洋参等药用植物根腐病[6，17，37-38]；此外，癣囊腔菌可引起甜瓜、黄瓜与三七等作物根腐病害的发生[39]；Liu 等[40]研究表明，外源化感物质香草酸可提高三七根际土壤中镰刀菌、小壶菌等潜在病原真菌的相对丰度。因此，蚯蚓活动导致土壤中镰孢菌、癣囊腔菌、小壶菌等相对丰度降低，有利于防控三七根腐病害、消减连作障碍问题。Tian 等[38]的研究也表明，蚯蚓粪对镰刀菌等引发的西洋参根腐病具有抑制作用。 Bonkowski 等[41]通过对 5 种蚯蚓的取食真菌偏好进行研究，发现蚯蚓可以取食镰孢菌等植物病原菌；此外，蚯蚓可释放抗生素，降低土壤中病原菌的丰度[42]。
表3蚯蚓活动调控三七连作土壤真菌群落共现网络特征
图5蚯蚓活动对三七连作土壤真菌群落网络复杂性的调控作用
注：Ascomycota：子囊菌门，Basidiomycota：担子菌门，Chytridiomycota：壶菌门，Glomeromycota：球囊菌门，Mortierellomycota：被孢霉门， Rozellomycota：罗兹菌门，unclassified Fungi：未分类真菌。
本研究发现，蚯蚓活动使土壤中半乳糖霉属和曲霉属等潜在有益菌相对丰度升高。Cai 等[43]研究表明，半乳糖霉属真菌（G. candidum JYC1146、 G. candidum JYC546 与 G. geotrichum JYC549）产生的挥发性有机化合物对多种植物病原菌具有广谱抑制作用；此外，李燕等[44] 研究表明，棉隆熏蒸草莓连作土壤后，配施含有枯草芽孢杆菌、放线菌与哈茨木霉的微生物菌剂，有效促进了曲霉属等有益菌种群的恢复。网络分析表明，蚯蚓活动导致土壤真菌群落网络节点间的正相关比例增加，负相关比例降低，表明蚯蚓活动增进了不同真菌类群之间的促进作用、减少了抑制作用。此外，蚯蚓活动导致土壤真菌群落网络复杂性增加（表3）。Batista 等[45] 研究表明，与受大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）感染的棉花种植土壤相比，健康土壤微生物群落网络复杂性较高。因此，真菌群落网络复杂性增加，可能有利于土壤健康。
4 结论
蚯蚓对牛粪的吞食消化作用可提高土壤速效氮、磷、钾养分含量及蔗糖酶、过氧化氢酶、磷酸酶的活性，增加水稳性大团聚体含量。此外，蚯蚓活动使土壤真菌多样性增加，潜在病原菌镰刀菌属、癣囊腔菌属等相对丰度降低，潜在有益菌半乳糖霉属、曲霉属等相对丰度升高，并增加了土壤真菌群落的网络复杂性。因此，添加蚯蚓有望成为改良三七连作土壤、消减连作障碍的有效措施。
