摘要
为缓解化肥过度施用造成的一系列环境问题，选取蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa GY-D12）进行规模化培养以制备微藻生物肥料。研究设置微藻生物肥（MF）、尿素（U）和对照（CK）3 个处理，通过盆栽试验探究微藻生物肥对土壤养分、大豆生长以及土壤氮转化相关功能基因的影响。结果表明：（1）与 CK 处理相比， MF 处理能提高土壤有机质、总氮、铵态氮、有效磷、速效钾的含量，降低土壤硝态氮的含量，且 MF 处理的土壤养分提升效果优于 U 处理。（2）与 U 处理相比，MF 处理能显著增加大豆植株高度、根长、根鲜重、地上部鲜重、根干重以及大豆光合色素含量，但与 CK 处理相比会显著降低大豆根瘤数。（3）与 CK 处理相比，MF 处理能显著提高土壤 AOA-amoA、AOB-amoA 的基因丰度，促进土壤硝化作用。（4）与 U 处理相比，MF 处理能显著降低土壤反硝化功能基因（narG、nirK）丰度，并显著增加 nifD、nrfA 基因丰度，促进土壤固氮和硝酸盐异化还原为铵的过程。因此，微藻生物肥作为一种有机缓释肥在保证作物正常生长所需养分外，还能有效减少因淋溶、径流等造成的氮素损失，维持土壤氮素平衡，对实现农业生产过程中的节能降碳、绿色发展具有重要意义。
Abstract
In this study，Chlorella pyrenoidosa GY-D12 was used for large-scale culture to prepare microalgae bio-fertilizer， in order to alleviate a series of environmental problems caused by over-fertilization. Three treatments were set up in the experiment，including microalgae bio-fertilizer（MF），urea（U）and control（CK）. The effects of microalgae biofertilizer on soil nutrients，soybean growth and functional genes related to nitrogen transformation were investigated by pot experiment. The results showed that：（1）Compared with CK，MF treatment increased the contents of soil organic matter，total nitrogen，ammonium nitrogen，available phosphorus and available potassium，and reduced the content of soil nitrate nitrogen；（2）Compared with U，MF treatment significantly increased the plant height，root length，root fresh weight，shoot fresh weight，root dry weight and photosynthetic pigment content of soybean，but significantly reduced the number of soybean nodules compared with CK treatment.（3）Compared with CK，MF treatment significantly increased the gene abundance of soil AOA-amoA and AOB-amoA，and accelerated soil nitrification process.（4）Compared with U， MF treatment significantly reduced the soil denitrification functional genes（narG，nirK）abundance，and significantly increased the abundance of nifD and nrfA genes，and promoted the process of soil nitrogen fixation and dissimilatory nitrate reduction to ammonium. Thus，as an organic slow-release fertilizer，microalgal bio-fertilizer can not only support the normal growth of crops，but also effectively reduce nitrogen loss（including leaching，runoff，etc.）and maintain soil nitrogen balance. It is of great significance to realize energy saving，carbon reduction and green development in the process of agricultural production.
Keywords
2021 年发布的《“十四五”全国农业绿色发展规划》指出要全面推进化肥、农药减量增效，实现化肥、农药的零增长。以往长期单一、过量的化肥施用模式存在化肥利用率低、土壤板结、酸化、微生物活性差等问题[1]。此外，过量施肥导致的土壤残留氮会通过地表径流、土壤侵蚀和地下渗漏等方式淋失，造成土壤和水体的面源污染，严重威胁生态环境和人类健康[2-3]。因此，发展现代化农业产区需要推广科学的施肥技术，开发新型有机肥、缓释肥，提高肥料利用率以实现农业绿色高效生产。
微藻是一类结构简单、环境适应性强的真核或原核微生物，广泛分布于陆地、淡水湖泊、海洋等环境[4]，因其富含多种生物活性物质和营养成分，被广泛应用于食品、医药、农业、畜牧等领域[5]。微藻具有高效的光合作用和固碳效率，能够有效吸收水体中氮、磷和微量元素[6]，因此，微藻生物质可作为农业有机肥料的来源。微藻生物质中的氮主要以有机氮的形式存在，其有效养分首先需要通过微生物的氨化作用转化为铵氮才能被作物吸收利用[7]。Zarezadeh 等[8]指出，与尿素相比，微藻生物肥养分释放速率更慢。并且，与传统肥料相比，微藻生物肥能显著降低小麦田氮氧化物 （N2O 和 NO）的排放[9]。因此，微藻生物质可以开发为良好的缓释肥料，减少因淋溶、地表径流、反硝化等造成的氮损失[10]。此外，微藻细胞还能产生植物激素（吲哚乙酸、赤霉素、细胞分裂素）、多糖等一些生物活性成分，能促进作物生长、增强抗逆性，提高作物产量[11]。Gitau 等[12]阐明了小球藻 （MACC-360 和 MACC-38）和莱茵衣藻藻株（cc124） 对蒺藜苜蓿（Medicago truncatula A17）生长刺激的分子机制，指出微藻细胞分泌的植物激素和胞外聚合物是促进蒺藜苜蓿生长的主要原因。微藻生物肥以有机物的形式输入到土壤中，为微生物群落提供有机碳、氮底物，这也将影响土壤微生物的群落组成和功能结构，尤其是参与碳、氮循环的功能微生物[13]。Zarezadeh 等[8] 研究发现，微藻生物肥处理能显著增加 hao 和 nrfA 基因丰度，促进硝化作用和硝酸盐异化还原为铵（DNRA）的过程，同时反硝化 narG、nirK 和 nosZ 基因的丰度有增加的趋势，但与化肥处理相比未达显著差异。而 Shayesteh 等[14]研究表明，微藻生物肥处理能显著增加 narG 基因的丰度，促进土壤的反硝化作用。研究差异的可能原因在于不同种类的微藻生物肥，其碳氮比差异较大，可能产生不同的底物激发效应[15]。
目前，微藻生物肥作为有机缓释肥料的研究仍处于起步阶段，且微藻生物肥作用于大豆体系的相关研究还未见报道。因此，本研究通过室内盆栽试验探究微藻生物肥对土壤养分、大豆生长以及氮转化相关功能基因的影响，以期为微藻生物肥的深入开发和推广应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 蛋白核小球藻的培养及采收
本研究蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa） 藻种购自上海光语生物科技有限公司，藻种编号为 GY-D12。将培养至对数生长期的藻种液以体积分数为 20% 的接种量接入改良的 BG11 培养基中，并置于智能光照培养箱（PGX-80A，江苏天翎仪器有限公司）中培养，培养温度为（25.0±1.0）℃，光照强度为 4500 lx，光暗比为 12 h ∶ 12 h，培养周期为 7 d。采用电磁式空气压缩机（ACO-108，广东海利集团有限公司）向培养液中通入空气，充气流量设置为 1 L/min，管道连接处用气体过滤器 （孔径 0.22 μm）进行除菌过滤，并用医用消毒棉球填充空隙。将培养后的蛋白核小球藻使用台式离心机（Thermo-scientific SL 16R，美国 Thermo Fisher Scientific 公司）进行离心浓缩，并用蒸馏水洗涤 3 次，以去除培养基中残留的养分。将浓缩后的微藻生物质一部分放入烘箱 60℃烘干至恒重，以待养分测定，微藻生物质养分含量见表1；另一部分置于 4℃培养箱（LC-SPX-BE，上海力辰仪器科技有限公司）保存，以待盆栽使用。
表1蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa GY-D12）化学特性
1.2 供试土壤
供试土壤取自陕西省榆林市清涧县高标准新垦宽幅梯田生态治理科技示范地（37°7′29″N， 110 °16′50″E）0～20 cm 的耕作层。示范地海拔 1360.80 m，土壤类型为黄绵土，土壤 pH 值为 7.93，电导率为 171.64 μS/cm，有机质为 3.80 g/kg，总氮为 0.25 g/kg，铵态氮为 7.44 mg/kg，硝态氮为 2.63 mg/kg，有效磷为 26.16 mg/kg，速效钾为 61.53 mg/kg，前茬作物为小麦。将采集的土壤进行阴干、过 2 mm 筛、混匀备用。
1.3 试验设计
试验在西北农林科技大学南校区植物保护学院人工气候室内进行。挑选籽粒饱满的大豆种子（山宁 17）用 75% 乙醇消毒 5 min，无菌水冲洗 3 次， 5% 次氯酸钠消毒 3 min，无菌水冲洗 6 次（直至无明显刺鼻气味）后置于 1% 水琼脂平板上，28℃ 避光条件催芽 2～3 d。选取长势一致的大豆种子移栽至高 205 mm、顶部直径 225 mm、底部直径 175 mm 的塑料盆中，每盆移栽 6 颗大豆种子，每盆装土量 5 kg，5 d 后进行间苗，每盆留 3 株幼苗。人工气候室温度设置为（25.0±1.0）℃，湿度为 60%，光暗比为 16 h ∶ 8 h。试验采用随机区组设计，共设置 3 个处理，分别为微藻生物肥 （MF）、尿素（U）、蒸馏水（CK），每个处理 6 个重复。尿素处理：每盆施氮量 0.15 g，尿素用量 0.33 g（根据当地推荐施氮量 90 kg/hm2，每公顷按 3.0×106 kg 土计），以微藻生物质中磷、钾含量为标准，用硫酸钾和过磷酸钙补齐磷、钾肥。微藻生物肥处理：基于每盆施氮量 0.15 g 进行等氮处理，每盆施用微藻生物肥 2.02 kg（以干重计）。所有肥料均以水溶形式灌根一次性施入，后期不进行追肥，试验期间，每隔 4 d 浇水 1 次，每次浇水量 300 mL。
1.4 样品采集与处理
于 2023 年 12 月 31 日（大豆生长第 30 d）进行第一次大豆根区和根际土（抖根法）的破坏性采样；2024 年 1 月 29 日（大豆生长第 60 d）进行大豆植株和根区、根际土的第二次采样。每个处理均采 3 盆。将采集后的根区土进行阴干、过 1 mm 筛、混匀以待测定其养分，根际土保存至-80℃冰箱以待土壤 DNA 提取。用蒸馏水洗净植株表面附着的土壤并擦干，以待大豆各指标测定。
1.5 测定项目与方法
1.5.1 微藻生物质养分含量
微藻总碳采用全自动碳氮分析仪（Primacs SNC100-IC-E，荷兰 Skalar 公司）测定；微藻总氮、总磷含量采用浓硫酸-过氧化氢消煮，流动分析仪（AA3，德国 SEAL 公司）测定；微藻总钾采用浓硫酸-过氧化氢消煮，原子吸收分光光度计 （PinAAcle900，美国 PerkinElmer 公司）测定。
1.5.2 土壤化学指标
土壤 pH 值采用便携式 pH 计（PHBJ-261L，上海仪电科学仪器股份有限公司）测定，水土比为 5∶1；电导率采用电导率仪（DDSJ-308F，上海仪电科学仪器股份有限公司）测定，水土比为 5∶1； 土壤有机质采用重铬酸钾容量法测定；土壤全氮采用全自动碳氮分析仪（Primacs SNC100-IC-E，荷兰 Skalar 公司）测定；土壤有效磷采用 0.5 mol/L 碳酸氢钠浸提，流动分析仪（AA3，德国 SEAL 公司） 测定；土壤速效钾采用 1.0 mol/L 乙酸铵浸提，原子吸收分光光度计（PinAAcle900，美国 PerkinElmer 公司）测定；土壤硝态氮和铵态氮采用 1.0 mol/L 氯化钾浸提，流动分析仪（AA3，德国 SEAL 公司） 测定。
1.5.3 植株农艺性状
对大豆植株的茎高、地上部和地下部鲜重、根长、根瘤数等进行数据采集后，将植株地上部和地下部放入烘箱 105℃杀青 30 min，后 70℃烘干至恒重，称量其地上部和地下部干重。
1.5.4 叶片光合色素含量
统一选取大豆主枝上倒 3 叶为检测对象，取 0.5 g 新鲜叶片样品加入 100 mL 无水乙醇和丙酮 1∶1（V∶V）的混合液充分研磨，避光提取 24 h 至组织呈现白色。将提取物在 4℃下 4000 r/min 离心 5 min（Thermo-scientific SL 16R，美国 Thermo Fisher Scientific 公司），取上清液在 663、645 和 470 nm 处测定提取物的吸光度（Epoch1，美国 BioTek 公司），根据 Arnon[16]公式计算叶绿素 a、 b 和类胡萝卜素的含量：
(1)
(2)
(3)
式中，A 是对应波长的吸光值，V 是提取液的体积 （mL），M 是叶片鲜重（g），Ca 是叶绿素 a 的含量 （mg/g），Cb 是叶绿素 b 的含量（mg/g）。
1.5.5 土壤 DNA 提取及实时荧光定量 q-PCR
使用 Fast DNA® Spin Kit for Soil 试剂盒（ 美国 MP Biomedicals 公司），参照试剂盒手册进行土壤 DNA 的提取。将提取后的 DNA 样本溶解在 DES 缓冲液中并用酶标仪（Epoch1，美国 BioTek 公司）检测其浓度及质量后，置于-20℃条件保存备用。采用实时荧光定量 PCR（CFX Connect ™，美国 Bio-Rad 公司）测定土壤固氮基因（nifD）、硝化基因（AOA-amoA、AOB-amoA）和反硝化基因 （narG、nirK、nrfA）丰度。反应体系为 20 μL，包括 10μL SYBR® Premix ExTaq ™、1.0 μL 引物（0.5 μL 正向引物和 0.5 μL 反向引物）、8.0 μL 无菌蒸馏水、1.0 μL 模板 DNA。基因丰度用每克湿土所含基因拷贝数表示。
1.6 数据统计与分析
采用 Excel 2019 进行数据处理；SPSS 25.0 对测定数据进行正态分布检验和方差齐性检验，本试验的数据均符合正态分布且通过了方差齐性检验，对数据进行差异显著性检验（Duncan 法，α=0.05）； 采用 Origin 2022 制图。
2 结果与分析
2.1 微藻生物肥对土壤养分含量的影响
不同肥料处理下土壤养分含量变化如表2所示，与 CK、U 处理相比，MF 处理能增加土壤 pH、电导率、有机质、总氮的含量，其中，与 U 处理相比，第二次采样（60 d）时 pH、电导率、有机质增幅分别为 1.63%、41.08%、22.02% 第一次采样 （30 d）时全氮增幅为 14.81%，且除电导率外，CK 和 U 处理之间无显著差异（P>0.05）。但在第一次采样（30 d）时，各处理土壤 pH、电导率无显著差异 （P>0.05）；第二次采样（60 d）时，各处理土壤总氮无显著差异（P>0.05）。较 CK 处理，U 和 MF 处理均能显著增加土壤铵态氮的含量（P<0.05），但第一次采样时 U 处理的增幅更大，平均分别增加 2.29、2.57 倍。 U 和 MF 处理下土壤硝态氮含量呈现不同的变化趋势，其中，U 处理能显著增加土壤硝态氮含量（P<0.05），较 CK 处理平均增加 1.09 倍；而 MF 处理能显著降低土壤硝态氮含量（P<0.05），其平均降幅为 57.50%。30 d 时，各处理间土壤有效磷含量差异不显著（P>0.05）； 60 d 时，与 CK 和 U 处理相比，MF 处理能显著增加土壤有效磷含量（P<0.05），平均增幅分别为 13.57%、 9.37%。与 CK 处理相比，第二次采样时 U 和 MF 处理均能显著增加土壤速效钾的含量（P<0.05），其中，与 CK 处理相比平均增幅分别为 34.64%、 44.02%，而 U 和 MF 处理之间无显著差异（P>0.05）。
表2施用微藻生物肥对土壤化学性质的影响
注：表中数据为平均值 ± 标准偏差，不同小写字母表示同一时间不同处理之间的差异显著（P<0.05）。
2.2 微藻生物肥对大豆生长的影响
由表3可知，不同肥料处理对大豆生长影响差异显著（P<0.05）。与 CK 处理相比，U 和 MF 处理能显著增加株高、根长（P<0.05），且 MF 处理效果优于 U 处理。较 CK 处理而言，MF 处理下株高、根长和根鲜重分别增加 58.62%、66.50%、72.22%； 较 U 处理分别增加 14.19%、24.32%、55.00%。与 CK 和 U 处理相比，MF 处理能显著增加植株地上部鲜重和根干重 （P<0.05），较 U 处理分别增加 47.18%、88.88%，但 U 和 CK 处理之间未达显著差异（P>0.05）。对于植株地上部干重，各处理之间未达显著差异（P>0.05），但整体呈现 MF>U>CK 的趋势。由表3可知，施肥处理能显著影响大豆根瘤数 （P<0.05），与 CK 处理相比，U 和 MF 处理能显著降低大豆根瘤数（P<0.05），降幅分别为 60.00%、 30.00%。各处理大豆根瘤数从大到小依次为 CK>MF>U。
表3施用微藻生物肥对大豆农艺性状的影响
注：表中数据为平均值 ± 标准偏差，不同小写字母表示处理之间的差异显著（P<0.05）。
2.3 微藻生物肥对大豆光合色素的影响
由图1可知，不同肥料处理对大豆光合色素的影响差异显著（P<0.05）。MF 处理下，大豆光合色素的含量最高，其次是 U 处理，CK 处理的光合色素的含量最低。与 CK 处理相比，MF 处理显著增加了大豆叶片中叶绿素 a、叶绿素 b 和类胡萝卜素的含量（P<0.05），其增幅分别为 137.30%、 82.46%、79.07%； 较 U 处理增幅分别为 23.55%、 52.94、26.23%。U、CK 处理之间叶绿素 b 未达显著差异（P>0.05）。不同肥料处理还显著影响大豆叶片叶绿素 a/b 值（P<0.05）。与 CK 相比，U 和 MF 处理均能增加叶绿素 a/b 值，平均增幅分别为 61.09%、 30.32%，其含量从大到小依次为 U>MF>CK。
2.4 微藻生物肥对氮转化功能基因丰度的影响
不同肥料处理下土壤氮转化关键功能基因丰度变化如图2所示。30 d 时，MF 和 U 处理之间土壤 nifD 基因拷贝数无显著差异（P>0.05）；60 d 时，MF 处理的 nifD 基因拷贝数显著高于 U 处理 （P<0.05），其增幅为 98.00%。对于 AOA-amoA 基因，U 和 MF 处理下 AOA-amoA 基因拷贝数显著高于 CK 处理（P<0.05），其增幅分别为 145.69% 和 126.95%，但 U 和 MF 处理之间无显著差异 （P>0.05），且各处理 AOA-amoA 基因丰度随着时间变化有增加趋势，第二次采样比第一次 AOA-amoA 基因丰度增加 1.39～1.90 倍。各处理 AOA-amoA 基因丰度整体呈现出 U>MF>CK 的变化趋势。对于 AOB-amoA，在 30 d 时，U 处理下 AOB-amoA 基因拷贝数显著高于 CK 和 MF 处理（P<0.05），其增幅为 101.97%、72.27%，但 CK 和 MF 处理之间无显著差异（P>0.05）；在 60 d 时，MF 处理的 AOB-amoA 基因丰度显著增加（P<0.05），较 CK 处理增加 281.08%，但其基因丰度未超过 U 处理。各处理 AOB-amoA 基因丰度整体呈现出 U>MF>CK 的变化趋势。由图2还可知，各处理 AOA-amoA 基因丰度均要高于 AOB-amoA 基因。对于 narG 基因，MF 处理较 U 处理能显著降低土壤 narG 基因丰度（P<0.05），平均降幅 36.64%，但 MF 和 U 处理的 narG 基因丰度均高于 CK 处理。MF 和 U 处理的 narG 基因丰度随着时间变化有降低趋势，总体而言，各处理 narG 基因丰度整体呈现出 U>MF>CK 的变化趋势。土壤 nirK 基因与 narG 基因具有类似的变化趋势。U 处理能显著增加 nirK 基因丰度（P<0.05），较 CK 处理平均增幅 103.41%。 MF 处理在 30 d 时较 CK 处理显著增加了 nirK 基因丰度（P<0.05），但在 60 d 时其 nirK 基因丰度下降且与 CK 处理无显著差异（P>0.05）。对于土壤 nrfA 基因，MF 处理能显著提高 nrfA 基因丰度（P<0.05），较 U 和 CK 处理平均分别增幅 92.91%、260.37%，而 U 和 CK 处理间未达显著差异（P>0.05），且 MF 处理下 nrfA 基因丰度随着时间变化有增加趋势。
图1施用微藻生物肥对大豆光合色素的影响
注：图中不同小写字母表示同一指标处理之间的差异显著（P<0.05）。
图2微藻生物肥处理下土壤氮转化功能基因丰度
注：（A）代表第一次采样时期（30 d），（B）代表第二次采样时期（60 d）；图中不同小写字母表示不同处理之间的差异显著（P<0.05）。
3 讨论
3.1 微藻生物肥对土壤养分的影响
微藻细胞中含有丰富的营养物质，可以将外界环境中的无机氮、磷以蛋白质和多聚磷酸盐的形式储存在细胞中，是土壤改良和作物增产的潜在绿色生物资源[17]。有研究表明，微藻生物肥可以改善土壤结构和肥力、提高土壤中有益微生物的活性[18]。本研究发现，MF 处理能显著增加土壤有机质、总氮、铵态氮的含量。Alobwede 等[15]通过盆栽试验研究表明，小球藻（Chlorella sp.）和螺旋藻（Spirulina）能显著增加土壤总氮和总碳含量。一些蓝藻属的物种，如念珠藻（Nostoc）、鱼腥藻 （Anabae-na）、单岐藻（Tolypothrix）等具有生物固氮功能，可以通过固定空气中的 N2 增加土壤有机氮的含量[5]。但目前还未见报道小球藻（Chlorella sp.） 具有生物固氮功能，因此笔者推测土壤中总氮含量的提升可能主要来源于小球藻（Chlorella sp.）自身的养分含量。Sido 等[19]用扁平衣藻（Chlamydomonas applanata M9V）和小球藻（Chlorella vulgaris S3）制备微藻生物肥料，通过盆栽试验发现，土壤总氮含量并没有显著增加，但与对照和尿素处理相比，总体增加了 2.31%～5.56%，这表明微藻生物肥对改善土壤总氮过程可能是一个长期效应。微藻生物肥被视为一种有机缓释肥料，本研究发现较尿素处理微藻生物肥的施用产生了更少的铵态氮。Jimenez 等[20]通过土柱淋溶试验发现，微藻生物肥处理下只有 7% 的氮被淋失，而尿素中有 50% 的氮被淋失。这表明微藻生物肥可以有效减少氮素养分淋失，提高肥料的利用率。对于土壤硝态氮，本研究发现微藻生物肥处理能显著降低土壤硝态氮含量，这在以往的研究中未见报道。Alobwede 等[15] 研究表明，小球藻（Chlorella sp.）处理的土壤硝态氮含量与对照相比没有显著差异，但在高剂量螺旋藻（Spirulina）处理下土壤硝态氮含量增加了 42%。因此，可能存在的原因有：（1）不同种类的微藻生物质中碳氮比、生物活性物质等差异较大，可能产生不同的作用效果；（2）微藻生物质中可能存在某些硝化抑制成分，阻碍了土壤铵态氮向硝态氮的转化；（3）微藻生物质的输入导致土壤某些氮转化功能微生物群落的变化，促进了土壤中硝酸盐异化还原的过程（反硝化作用、DNRA），消耗了 NO3-。此外，本研究发现微藻生物肥的施用能显著增加土壤有效磷的含量（60 d），但在第 30 d 各处理未达显著差异，表明微藻生物肥为土壤提供了一个缓慢释放的磷库，较化学磷肥更具有可持续性。Chu 等[21]研究表明，微藻基水热炭促进了可溶性和交换态磷向 Fe、Al 结合态磷的转化，有利于提高磷素利用效率。
3.2 微藻生物肥对大豆生长的影响
本研究表明，微藻生物肥的施用可以显著提高大豆株高、根长、根鲜重、地上部鲜重和根干重。大多数研究表明，微藻生物肥对作物具有一定的促生作用[4，18，20，22]。研究表明，微藻生物质或提取物可以通过植物激素、胞外多糖以及养分对植株生长产生积极效应[5]。Gitau 等[12]阐明了小球藻（MACC-360 和 MACC-38）和莱茵衣藻藻株 （cc124）对蒺藜苜蓿（M. truncatula A17）生长刺激作用的分子机制，指出微藻细胞分泌的植物激素和胞外聚合物是促进蒺藜苜蓿生长的主要原因。Sido 等[19]研究发现，无论是灭活还是未灭活的微藻细胞均对小麦生长具有促进作用。灭活后的微藻细胞 （微藻提取物）仍存在氨基酸、维生素、激素等物质，对作物同样具有促生作用，这也解释了微藻提取物具有微量效应[23]。此外，本研究发现，微藻生物肥还能提高大豆光合色素含量，这与 Dineshkumar 等[24]、Jimenez 等[20]的研究结果一致，但 Álvarez-González 等[10]研究却表明，在微藻生物肥处理下罗勒（Ocimum basilicum L.）叶绿素指数显著低于化肥处理。有研究发现，土壤氮含量以及铵态氮、硝态氮配比对植物叶绿体、光合速率具有显著影响[25-26]，笔者推断，微藻种类不同，其矿化速率各有差异，可能影响了土壤氮素供应以及铵态氮、硝态氮配比，从而影响了植物光合色素含量。目前，针对微藻生物肥对植物光合作用的影响仍还有待进一步的探究。
3.3 微藻生物肥对氮转化功能基因的影响
土壤氮素转化过程是全球氮素循环最重要的组成部分[27]。本研究发现，微藻生物肥处理能提高 AOA-amoA 和 AOB-amoA 的基因丰度，促进土壤硝化作用。但较于尿素处理，其微藻生物肥的矿化作用程度较低，主要原因是微藻生物肥中氮素主要以有机氮的形式存在，这意味着微藻生物肥中的有机氮部分必须经土壤微生物矿化为 NH4 + 才能被植物吸收利用[7]。但 Sharma 等[28]研究表明，微藻生物肥是由单细胞构成的生物肥料，与传统有机肥料相比，其矿化速率更快。这解释了微藻生物肥处理与尿素处理间 AOA-amoA 和 AOB-amoA 的基因丰度差异不显著的原因。pH 是影响土壤硝化作用的重要因素之一，本研究发现，随着微藻生物肥的施用，土壤 pH 呈上升趋势，pH 上升能提高土壤 NH3 含量，为硝化作用提供底物，促进土壤的硝化作用[29]。刘天琳[30]研究表明，pH 还会影响氨氧化微生物群落结构，随着 pH 的不断升高，AOA-amoA 和 AOB-amoA 的基因比值不断下降，这与本研究的结果一致。此外，本研究发现相较于尿素，微藻生物肥处理能显著降低反硝化功能基因（narG、nirK），硝酸盐还原酶（narG）参与硝态氮还原成亚硝态氮，亚硝态氮在亚硝酸盐还原酶（NirK）作用下还原成一氧化氮。Shrestha 等[9] 研究表明，施用微藻生物肥的小麦地 NO 排放量为 0.31～0.7 kg/（hm2 ·年），比施用尿素处理低 4 倍； N2O 排放量为 0.151~0.76 kg/（hm2 ·年），比施用尿素处理低 1.51～3.0 倍，表明微藻生物肥施用有助于减少氮素损失，提高肥料的利用效率。与对照相比，外源有机氮的添加促进了反硝化异养型微生物快速生长增殖，与硝化微生物竞争可利用的 O2 和 NH4 +，反过来抑制硝化作用，当土壤缺乏 O2 形成厌氧环境时便会促进 N2O 的排放[22]。因此，如何对微藻生物肥进行改性，降低其氮氧化物的排放潜力，是今后需要解决的问题。本研究还发现，微藻生物肥的施用能显著增加 nrfA 基因丰度，表明微藻生物肥可能促进了 DNRA 的过程，nrfA 基因编码细胞色素 cd1 型亚硝酸盐还原酶，催化亚硝酸盐还原为铵[31]，与 Zarezadeh 等[8] 和 Shayesteh 等[14] 研究结果相似。DNRA 途径将土壤中 NO2--N 还原成 NH4 +-N，为硝化作用提供底物，有利于维持土壤氮素平衡[32]，这可能解释了本研究中施用微藻生物肥导致土壤硝态氮含量下降的原因。大多数 DNRA 微生物是发酵型微生物，NO3--N 的有效性、富碳条件以及厌氧环境对其具有较大影响[33-34]。微藻生物肥具有丰富的碳含量（37.29% C），有助于促进 DNRA 微生物的生长，提高 DNRA 速率。Song 等[35] 对河口沉积物的研究发现，较高的有机质含量能增加 nrfA 基因丰度和 DNRA 微生物活性。Putz 等[36] 同样指出，土壤有机质通过影响 C/NO3- 比可以促进 DNRA 过程。目前对于微藻生物肥如何影响土壤中 DNRA 与反硝化之间的竞争过程还没有一个清晰的认识，这也是今后需要继续研究的方向。
4 结论
本研究通过盆栽试验探究了微藻生物肥对土壤养分、大豆生长以及根际土壤氮转化相关功能基因的影响。得出以下结论：
（1）与 CK 处理相比，微藻生物肥处理能提高土壤有机质、总氮、铵态氮、有效磷、速效钾的含量，降低土壤硝态氮的含量，且微藻生物肥处理的土壤养分提升效果优于尿素处理。
（2）与尿素处理相比，微藻生物肥处理能显著增加大豆植株高度、根长、根鲜重、地上部鲜重、根干重以及大豆光合色素含量，但与 CK 处理相比会显著降低大豆根瘤数。
（3）与 CK 处理相比，微藻生物肥处理能显著提高 AOA-amoA 和 AOB-amoA 的基因丰度，促进土壤的硝化作用。
（4）与尿素处理相比，微藻生物肥处理能显著降低土壤反硝化功能基因（narG、nirK），并显著增加 nifD 和 nrfA 基因丰度，促进土壤固氮和 DNRA 的过程。