摘要
为揭示光强、氮素及其交互作用对格木（Erythrophleum fordii）幼苗生长和光合生理的影响，以 1 年生格木幼苗为材料，采用 4 种氮素水平（0.0、2.0、4.0、6.0 g/ 株）和 4 种光照水平［100% 自然光（NS）、51.67%NS、 25.50%NS、9.30%NS］的双因素盆栽试验，研究光氮互作下格木幼苗的生长及光合生理特性。结果表明：（1）光照、氮素主效应及二者的交互作用对格木幼苗的株高增量、叶绿素及类胡萝卜素含量、净光合速率、核酮糖二磷酸（RuBP）羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧化酶、Na+ K+-三磷酸腺苷（ATP）酶、Ca2+Mg2+-ATP 酶、总 ATP 酶均为极显著影响（P<0.01），施加氮肥可以有效缓解遮光对格木幼苗光合作用的抑制；（2）在同一氮素水平下，随光照强度下降，格木幼苗株高增量、地径增量、净光合速率、气孔导度、蒸腾速率、PEP 羧化酶、 Na+ K+ -ATP 酶、Ca2+Mg2+-ATP 酶、总 ATP 酶均呈先增后降趋势，除 Na+ K+ -ATP 酶、Ca2+Mg2+-ATP 酶外，均在 51.67%NS 时最高。Na+ K+ -ATP 酶、Ca2+Mg2+-ATP 酶在自然光时最高。而同期叶片的 RuBP 羧化酶则随光照减弱先降后增，大体在自然光时最高；（3）与 L0N0（100%NS+N 0.0 g/ 株）处理相比，遮光和施氮均能显著提高格木幼苗叶片的光合色素含量，但氮素水平过高也会抑制光合色素的合成；（4）综合分析得出 L1N2（51.67%NS+N 4.0 g/ 株） 处理的格木幼苗处理效果最优。研究表明，适宜的光强和氮素水平有利于提高格木幼苗叶片对光能的吸收、转化与利用，提高其光合性能，促进碳同化物的合成，从而提升苗木的品质。
Abstract
To reveal the effects of light intensity，nitrogen application and their interaction on the growth and photosynthetic physiology of Erythrophleum fordii seedlings，a two-factor pot experiment with four nitrogen levels（0.0，2.0，4.0，6.0 g/plant） and four light levels（100%，51.67%，25.50%，9.30% natural sunlight，marked as NS）was conducted to study the growth and photosynthetic physiological characteristics of Erythrophleum fordii seedlings under the light-nitrogen interactions， taking the first-year Erythrophleum fordii seedlings as materials. The results showed that：（1）The main effects of light and nitrogen，as well as their interaction，had an extremely significant impact on the plant height increment，chlorophyll and carotenoid content，net photosynthetic rate，RuBP carboxylase，PEP carboxylase，Na+ K+ -ATPase，Ca2+Mg2+-ATPase and total ATPase（P<0.01），and there was a significant or extremely significant interaction effect between different light and nitrogen levels. Applying nitrogen fertilizer effectively alleviated the inhibition of shading on the photosynthesis of Erythrophleum fordii seedlings.（2）At the same nitrogen level，the increment of height，ground diameter，net photosynthetic rate，stomatal conductance，transpiration rate，PEP carboxylase，Na+ K+ -ATPase，Ca2+Mg2+-ATPase， and total ATPase of Erythrophleum fordii seedlings showed a tendency of increasing and then decreasing with the decrease of light intensity，except Na+ K+ -ATPase，Ca2+Mg2+-ATPase，all of them were the highest at 51.67%NS. In contrast，RuBP carboxylase in the same period of leaves was decreased and then increased with decreasing light intensity，and was generally the highest at maximum natural sunlighty.（3）Compared with L0N0（100%NS+0.0 g/plant）treatment，shading and nitrogen application significantly increased the photosynthetic pigment content of Erythrophleum fordii seedling leaves，but excessively high nitrogen levels also inhibited the synthesis of photosynthetic pigments.（4）Based on comprehensive analysis，it was concluded that the treatment effect of the L1N2 treatment（51.67%NS+N 4.0 g/plant）on Erythrophleum fordii seedlings was the best. The study showed that the appropriate light intensity and nitrogen level were conducive to improving the absorption， conversion and utilization of light energy by the leaves of Erythrophleum fordii seedlings，improving their photosynthetic performance，promoting the synthesis of carbon assimilates，and thus enhancing the quality of seedlings.
Keywords
光照和氮素是影响植物生长的关键因素。适量的光照可以促进植物叶绿素的合成，增强光合作用的效率，但光照过强或过弱都可能对植物造成不利影响。氮素的供应状况会直接影响植物蛋白质等其他重要生物分子的合成。而在自然条件下，光照和氮素的供应往往不是单独存在，而是共同作用于植物的生长和代谢。研究表明，光照强度的变化会影响植物对氮素的吸收和利用效率，而氮素的供应水平也会影响植物对光照的响应能力。例如，对紫椴（Tilia amurensis）、桢楠（Phoebe zhennan）适当增加氮素供应可以提高植物在低光照条件下的光合效率，但过量则抑制光合作用[1-2]。在遮光环境下施肥可以提高八角（Illicium verum）、金丝李 （Garcinia paucinervis）幼苗的叶绿素含量，但对深山含笑（Michelia maudiae）、秋枫（Bischofia javanica）、美丽异木棉（Ceiba speciosa）、紫薇（Lagerstroemia indica）施肥过量也会抑制叶绿素的合成[3-5]。而刘子晗等[6]发现杉木（Cunninghamia lanceolata）遮阴和施氮均能显著促进杉木苗高和地径的增长，尤其在中等光强和低光强下施氮能显著提高杉木叶片光合性能指数。由此可见，不同类型的植物对光照和氮素的需求和响应有所差异，因此光照和氮素之间维持平衡、协调供应才能发挥最佳的互作效应，才能使植物达到理想生长状态。
格木（Erythrophleum fordii）又名斗登风，是豆科（Fabaceae）格木属的常绿高大乔木，生长在广西、广东、福建、台湾、浙江等省区的山地密林或疏林中。格木的木材质地坚硬且具耐腐蚀性，有药用价值，是国家Ⅱ级重点保护物种[7]。前人研究表明，一定程度的遮荫更有利于格木幼苗的生长， 60% 光照条件下其植株苗高和地径增长量最大，有利于提高叶片的气孔导度和蒸腾速率[8]。周维[9] 发现适度施加氮肥有利于格木幼苗的生长，当尿素∶过磷酸钙∶氯化钾为 2.2 g∶1.5 g∶0.3 g 每株时，格木幼苗株高增量、地径增量和生物量最佳，且氮素水平对格木幼苗光合作用有显著影响。但目前仅探究了光照或施肥单个因素对格木生长生理的影响，本文将从互作效应出发，深入探究光氮互作对格木幼苗生长和光合特性的影响。
本研究以 1 年生格木幼苗为试验对象，采用双因素（光照、氮素水平）随机区组设计，研究不同光氮交互作用下格木幼苗光合色素、光合作用及相关酶活性的变化。研究揭示格木对光照强度和氮素之间的互作效应，并筛选出适合格木苗期生长的最佳光氮处理组合，为格木的苗期培育环节提供科学依据。
1 材料和方法
1.1 试验地及供试材料
本试验在广西壮族自治区南宁市广西大学林学院教学实习基地（108°17′ E，22°51′ N）内进行。该地属亚热带季风气候，年均气温在 21.6℃左右，年均降水量 1304.2 mm，年均相对湿度 79%，适宜格木幼苗生长。
供试 1 年生格木实生苗由广西林业科学研究所提供[ 株高（27.00±3.00）cm，地径（7.00± 0.50）mm）]。2016 年 9 月选取 112 株健康且长势一致的幼苗带土球移栽于塑料盆（内径 23 cm，高 20 cm）中，每盆 1 株，土重约 3.5 kg。土壤为赤红壤，其基本理化性质为 pH 5.0，全氮 8.023 g/kg，硝态氮 1.283 mg/kg，全磷 0.490 g/kg，有效磷 0.300 mg/kg。格木幼苗叶片初始氮素 6.73 mg/g。
1.2 试验设计
采用双因素完全随机区组设计，依据周维[9]研究结果设置 4 个氮素水平（0.0、2.0、4.0、6.0 g/ 株，记为 N0、N1、N2、N3）及 4 种光照强度[100.00% 自然光（NS）、51.67%NS、25.50%NS、9.30%NS，记为 L0、L1、L2、L3]。光照强度分别采用密度为 2、 3 和 6 针的黑色尼龙网来控制，各处理的透光率用照度计测定得出。本试验共 16 个处理（表1），每个处理设 7 个生物学重复，每个重复 1 株，使用苗木 112 盆。2016 年 11 月 1 日起每隔 30 d 于天气晴朗时施加 1 次氮肥，2017 年 8 月 1 日完成施肥，共施 10 次。每次施加量采用指数施肥模型[10-11]确定，其用量根据公式：NT=Ns（erT-1）、Nt =Ns（ert-1）-N（t-1）、r=ln（NT/Ns+1）/T，其中 NT 为在 r 下第 t 次施肥中的施氮量，Ns 为幼苗初始氮含量，N（t-1）为第 t-1 次施氮量，T 为施肥总次数，t 为某次施肥次数，r 为氮素相对添加速率。erT 为 T 次施肥后，苗木体内氮含量增长率；ert 为第 t 次施肥后，苗木体内氮含量增长率。施肥时将尿素溶于去离子水后，每盆均匀浇灌 50 mL，不施氮处理组加入等体积去离子水，每盆下均放置托盘，渗漏至托盘的溶液重新倒回盆中，以减少施肥损失。
表1各因素水平及试验设计处理
注：氮肥按照纯 N 含量计算，括号中的数值为实际尿素施用量。NS 表示自然光。
1.3 测定指标
1.3.1 生长指标测定
试验开始后每月施肥前测定 1 次格木的株高、地径。株高采用卷尺测定，精度到 0.01 cm，株高增量 = 测定高度-初始高度。地径使用数显游标卡尺测定，精确度 0.01 mm，地径增量 = 测定地径-初始地径。
1.3.2 生理指标测定
2017 年 11 月，各处理随机选取 3 株健康植株，每株选取自顶芽往下数第 3～6 片长势良好且无病虫害的成熟功能叶来测定生理指标。磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧化酶活性、核酮糖二磷酸 （RuBP）羧化酶活性则采用酶联免疫吸附检测法 ELISA 试剂盒测定。Na+ K+-三磷酸腺苷（ATP）酶、 Ca2+Mg2+-ATP 酶、总 ATP 酶活性根据南京建成生物生产的 ATP 酶试剂盒和超微量总 ATP 酶试剂盒提供的说明测定。
1.3.3 光合指标测定
选取植株成熟的功能叶，测定如下光合指标：
（1）光合色素含量测定：采用乙醇-丙酮混合 （体积比 1∶1）浸提法，上清液分别在 663、645、 470 nm 波长下读取吸光度，每个处理 3 次重复，取其平均值。并按公式计算叶绿素和类胡萝卜素含量[12]。
（2）瞬时光合指标的测定使用 LI-6400 XT 便携式光合仪（美国 LI-COR 公司生产），测定叶片净光合速率、气孔导度、蒸腾速率，同张叶片重复测 3 次，结果取平均值[13]。
1.4 数据统计与分析
使用 Excel 2019 整理数据，用 SPSS 26.0 进行双因素方差分析（置信区间 99%），Duncan 法进行多重比较。使用 SPSSAU 对样本数据进行 TOP-SIS 综合评价分析[14]，并用 Excel 2019 进行图表绘制。
2 结果与分析
2.1 光氮互作对格木幼苗株高和地径的影响
不同光照和氮素处理对格木株高和地径增量表现出极显著影响（P<0.01），而光氮交互作用对格木幼苗株高增量表现出极显著影响（P<0.01），对格木幼苗地径增量表现出显著影响（P<0.05） （ 图1）。除 L2N0、L3N0 处理外，其余处理对格木幼苗株高、地径增长均有促进作用，以 L1N2 （51.67%NS+N 4.0 g/ 株）处理下株高和地径增量最高（33.94 cm、8.13 mm），分别比 CK（L0N0） 提升了 282% 和 78%。相同光照强度下，株高和地径增量随氮素施用量的增加而先升后降，而氮素水平相同时，随遮光程度的增强，株高和地径增量也呈现先增后降的趋势。可见轻度遮阴并适量施加氮肥有利于格木幼苗株高和地径的增长。
图1不同光氮互作条件下格木幼苗的株高、地径增量
注：图中数据为平均值，误差棒长度表示标准差。不同大写字母表示同一指标、不同处理间差异极显著（P<0.01）；不同小写字母表示同一指标、不同处理间差异显著（P<0.05）。下同。
2.2 光氮互作对格木幼苗光合色素的影响
不同光氮主效应及交互作用对格木叶片光合色素含量有极显著影响（P<0.01）（图2）。所有处理下光合色素含量均高于 L0N0 处理，叶绿素 a、叶绿素 b 以及类胡萝卜素含量均以 L3N1（25.50%NS+ N 2.0 g/ 株）处理下最高（2.47、0.99、0.64 mg/g），分别较 L0N0 处理增加 448%、607%、276%。相同光照强度下，叶绿素 a、叶绿素 b 以及类胡萝卜素含量随着氮素施用量的增加而先升后降。而同氮素水平下，随光照强度的减弱，N2 处理叶绿素 a、叶绿素 b 以及类胡萝卜素含量随遮光程度的增强先升后降，其余处理叶绿素 a、叶绿素 b 以及类胡萝卜素含量均随遮光程度的增强而上升。可见遮光和施加氮素对格木幼苗光合色素含量有促进作用。
2.3 光氮互作对格木幼苗瞬时光合作用的影响
光照和氮素对格木幼苗叶片的净光合速率、气孔导度以及蒸腾速率影响均为极显著（P<0.01）。光氮交互作用对格木幼苗叶片净光合速率影响为极显著（P<0.01），对格木幼苗叶片气孔导度和蒸腾速率的影响为显著（P<0.05）（图3）。净光合速率、气孔导度和蒸腾速率均在 L1N2（51.67%NS+ N 4.0 g/ 株）处理最大，分别是 4.26 μmol/（m2 ·s）、 0.05 μmol/（m2 ·s） 和 1.17 mmol/（m2 ·s），分别比 L0N0 处理增加 257%、72% 和 265%。光照相同时，净光合速率、气孔导度以及蒸腾速率均随氮素施用量的增加而先升后降，并多以 N1、N2 水平下较高，N0、N3 水平下处理较低；氮素水平相同时，净光合速率、气孔导度以及蒸腾速率随遮光程度的增强先升后降，均在 L1（51.67%NS）水平时最高。可见适度施加氮素对格木幼苗光合作用有促进作用，而遮光处理下其光合作用受到了明显的抑制。
图2不同光氮互作条件下格木幼苗的光合色素含量
图3不同光氮条件对格木幼苗瞬时光合作用的影响
2.4 光氮互作对格木幼苗光合作用相关酶的影响
不同光氮主效应及交互作用对格木幼苗叶片 RuBP 羧化酶、PEP 羧化酶、Na+ K+-ATP 酶、Ca2+Mg2+-ATP 酶和总 ATP 酶有极显著影响（P<0.01）（ 图4）。 RuBP 羧化酶、PEP 羧化酶和总 ATP 酶在 L1N2 （51.67%NS+N 4.0 g/ 株）处理最大，分别为 15.47 ng/mL、 40.81 IU/L 和 3.19 U/mg，分别较 L0N0 处理增加 129%、 179% 和 569%； 而 Na+ K+-ATP 酶和 Ca2+Mg2+-ATP 酶在 L0N3（100%NS+N 6.0 g/ 株） 处理最大，分别是 2.88 和 3.16 U/mg，分别较 L0N0 处理增加 178% 和 293%。光照相同时，RuBP 羧化酶、PEP 羧化酶、 Na+ K+-ATP 酶、Ca2+Mg2+-ATP 酶和总 ATP 酶均随氮素水平的提高先升后降，并多以 N1、N2 水平下较高， N0、N3 水平下处理较低。氮素水平相同时，RuBP 羧化酶、PEP 羧化酶、Na+ K+-ATP 酶、Ca2+Mg2+-ATP 酶和总 ATP 酶也随遮光程度的增强先升后降，并多以 L0、L1 水平下较高，L2、L3 水平下处理较低。
图4不同光氮条件对格木幼苗光合作用关键酶的影响
3 光氮互作效应的综合评价
利用 TOPSIS 模型对不同光氮处理下的格木幼苗各个指标进行了综合评价，结果见表2。通过 TOPSIS 计算得到格木幼苗各处理顺序为 L1N2>L0N2>L1N1>L0N1>L0N3>L1N3>L2N2>L2N1>L1N0>L3N1>L0N0>L3N2>L2N3>L2N0>L3N0>L3N3。其中 L1N2 处理（51.67%NS+N 4.0 g/ 株）下格木幼苗综合表现最好，L3N3 处理（9.30%NS + N 6.0 g/ 株）下综合表现最差。L1（51.67%NS）和 N1（N 2.0 g/ 株）、 N2（N 4.0 g/ 株）水平下大多数处理排名较靠前。可见格木在适度遮阴环境下生长较好，通过施加适量氮肥可以提高格木的光能利用率，从而促进格木幼苗的光合作用。
表2不同光氮处理下格木幼苗综合评价结果
4 讨论
株高和地径作为幼苗生长发育的重要指标，能够从某种意义上反映幼苗对环境的适应性对策。在本研究中，同一氮素水平下株高增量和地径增量均随光照强度的减弱而先增后减，而在同一光照水平下，株高增量和地径增量随着氮素浓度的增加而先增后减。这一结果与刨花楠（Machilus pauhoi）和假苹婆（Sterculia lanceolata）在不同光照强度和氮素水平下株高、地径的变化趋势相似[15-16]。说明在适宜的光照环境下，适度施氮肥可以促进格木幼苗的生长，但遮光过度反而会造成弱光胁迫，进而抑制格木幼苗的生长。
在植物的光合作用中，光合色素可以决定叶片的光合能力。根据现有研究表明，施加氮肥可以促进叶绿素的合成，同时植物叶片中的光合色素含量也会随着光照程度的减弱而呈现上升趋势[17]。本研究结果与红皮云杉（Picea koraiensis）、水曲柳 （Coffea arabica）、茶树（Camellia sinensis）等植物的研究结果类似[18-20]。这可能是格木幼苗对弱光环境做出的适应性表现，通过增加光合色素含量来提高对光能吸收利用的能力，进而减少弱光环境对格木幼苗造成的损害[21]。此外，虽然施加氮肥可以促进叶绿素的合成，但当氮素施加量过高时，光合色素含量呈现出先增后减的趋势，与降香黄檀 （Dallergia odorifera）、东北红豆杉（Taxus cuspidate）变化趋势相似[22-23]。这可能是由于氮素供应过量后，造成植株体内的养分失衡，进一步影响到植物叶片光合色素的合成。由此可见，适宜的氮素和光强互作更有利于格木幼苗合成光合色素，进而提高叶片的光能利用率。
植物的净光合速率是衡量植物光合作用能力的重要指标。本研究发现，在轻度遮光的条件下，格木幼苗光合速率较快，表明轻度遮光下有利于提升格木幼苗的光合特性。此外，适宜的施氮量还能够提高格木幼苗的气孔导度。格木幼苗通过提高植株的气孔导度，进而影响蒸腾速率和净光合速率，达到增强格木幼苗的光合能力的目的。不过格木幼苗在高浓度氮素施肥下气孔开放程度受到了抑制，这结果与青冈栎（Cyclobalanopsis glauca）、草珊瑚（Sarcandra glabra）、海南风吹楠（Horsfieldia hainanensis）[24-26]的研究结果类似。这可能是施加氮素过量时，随着氮添加水平提高，格木幼苗气孔导度开始降低，蒸腾速率持续下降，水分利用效率和气孔限制值增加，叶片氮除了主要用于自身代谢消耗外，分配给光合作用的氮较少，导致植株光合速率的降低[27-28]。
在光合作用过程中，需要使用到多种酶进行催化，包括 RuBP 羧化酶、PEP 羧化酶、ATP 酶等。其中 RuBP 羧化酶和 PEP 羧化酶至关重要，前者决定碳同化的速率，催化 RuBP 合成三磷酸甘油酸； 后者是是 C4 植物 CO2 固定的关键酶[29]，负责催化叶绿体中的 PEP 和空气中吸收的 CO2 一起合成草酰乙酸[30]。研究发现通过施氮可以显著增加杉木[6]叶片中的 RuBP 羧化酶活性，但是在低光环境下，增施过多的氮素反而会对植物造成胁迫，降低植株中的氮含量，最后导致 RuBP 羧化酶的失活和减少[31]。本研究结果显示，随着氮素浓度的增加，PEP 羧化酶和 RuBP 羧化酶均呈现先增后减的趋势，这一结果与前人在谷子（Setaria italica）[32]上的研究相似。但是 RuBP 羧化酶与光照之间关系比较复杂，黄瓜（Cucumis sativus）[33]幼苗叶片 RuBP 羧化酶在中等光强时优于全光照，而全日照下山药（Dioscorea polystachya）[34]叶片 RuBP 羧化酶则优于遮光组。本研究中 RuBP 羧化酶的含量随着遮光程度的加深出现先降后升的趋势，最大值均出现在全光照条件下。这可能是不同植物种类的叶片中 RuBP 羧化酶的活性对光照响应存在一定的差异。ATP 酶包括 Na+ K+-ATP 酶、Ca2+Mg2+-ATP 酶、 H-ATP 酶等[35]。其中 Ca2+Mg2+-ATP 酶主要负责钙离子和镁离子的跨膜运输，直接影响到 PEP 羧化酶的合成，进而影响到植株的光合能力。本研究中还发现 Na+ K+-ATP 酶、Ca2+Mg2+-ATP 酶和总 ATP 酶活性与植物叶片净光合速率、气孔导度及蒸腾速率呈正相关，且在同一光照条件下，酶活性大体随光照强度的减弱而降低。这可能是在弱光环境下，希尔反应活性降低，叶绿体中电子传递速率下降， ATP 的合成受阻，光合产物减少，进而影响植物的净光合速率。
5 结论
光氮互作对格木幼苗的光合生理特性有显著或极显著影响。施加氮肥可以有效地缓解遮光对格木幼苗光合作用的抑制，此外适宜的光氮组合可以提高植物的光合能力，从而改善苗木的生长状况。由对不同光氮处理下格木幼苗综合评价结果可知，本试验条件下 L1（51.67%NS） 和 N1 （N 2.0 g/ 株）、N2 水平（N 4.0 g/ 株）最有利于提升格木幼苗的光合能力，其中L1N2（51.67%NS+N 4.0 g/ 株）处理的格木幼苗生长最优。因此在格木的育苗工作中，不仅要控制好氮肥施加量，还要避免过度遮阴。