摘要
果园连作障碍影响土壤养分矿化与有效性，与苗木的生长发育密切相关。探索桃重茬育苗地土壤微生物群落结构、代谢产物和土壤性质的变化，为现代化果园管理提供科学依据。高通量测序技术结合非靶向代谢组学进行分析连作 3 年的桃育苗地不同土层（0 ～ 20、20 ～ 40 cm）和对照（CK，自然生草地）土壤细菌群落结构、多样性以及代谢产物的变化，进一步研究微生物群落与土壤性质间的相关性。结果表明，0 ～ 20 cm 土层，较 CK 处理，连作 3 年的土壤中有机质、全磷、速效钾、有效铁和有效锌的含量降低，而全氮和有效磷含量则增加， 20 ～ 40 cm 土层，所有测试养分含量均下降；细菌群落多样性显著降低，构成细菌分子生态网络的关键微生物减少，导致细菌群落的稳定性下降；代谢组学分析发现，连作土壤中酸类物质含量显著增加，4-（苄氧基）苯甲酸、 （R）-3- 羟基肉豆蔻酸、3，5- 二甲氧基苯甲酸等潜在的自毒物质积累显著。同时 , 土壤中花生四烯酸代谢、羟色胺突触和抗生素的生物合成途径发生显著变化。通过相关性分析发现，土壤 pH 及有效铁、有效锌、全盐量、全氮、碱解氮、有机质和速效钾含量是影响桃重茬育苗地土壤细菌群落变化的主要化学因素，而棕榈酸、5- 氯 -2， 8- 二甲基 -4-［（3- 硝基 -2- 吡啶基）氧基］喹啉和 γ- 壬内酯等是调控土壤细菌群落的主要代谢产物。综上所述，与同层 CK 相比，在 20 ～ 40 cm 土层较 0 ～ 20 cm 土层中有机质、全磷、速效钾、有效铁和有效锌含量降幅增大，细菌群落的 α 多样性减小，优势细菌门、属均发生变化，致使土壤中酸类物质的含量显著增加，花生四烯酸代谢、羟色胺突触和抗生素的生物合成通路富集强度较高且所含的差异代谢产物的含量显著降低。相关性分析发现，桃重茬地土壤微生物群落的变化与土壤 pH 及有效铁和有效锌等含量具有显著相关性，而棕榈酸、5- 氯 -2，8- 二甲基 -4-［（3- 硝基 -2- 吡啶基）氧基］喹啉和 γ- 壬内酯等代谢产物是影响桃重茬育苗地土壤细菌群落结构的主要代谢产物。
Abstract
Continuous cropping obstacles in orchards affect soil nutrient mineralization and availability，and are closely related to the growth and development of seedlings. To investigate the effects of continuous cropping barriers on soil microbial communities and metabolites in peach multi-planting seedling sites，natural grassland was used as the control（CK，uncultivated grass）and peach seedling land with 3 years of continuous cropping as the research object（0-20，20-40 cm），and Illumina high-throughput sequencing technology combined with LC-MS non-targeted metabolomics analysis were used to study the characteristics of the changes in soil microbial community structure and metabolites of the peach seedling land in the process of continuous cropping. Compared with the CK treatment，the content of organic matter，available potassium，available iron and available zinc decreased， and the content of total nitrogen and total phosphorus increased in the soil with 3 years of continuous cropping. The diversity of the bacterial community was significantly reduced，and the key microorganisms constituting the molecular ecological network of the bacteria were reduced，which led to a decrease in the stability of the bacterial community. The metabolomics analyses revealed a significant increase in the content of acids in the soil with continuous cropping，and the content of 4-（benzyloxy）benzoic acid， （R）-3-hydroxymyristic acid，3，5-dimethoxybenzoic acid and other potential autotoxic substances accumulated significantly. Continuous cropping had significant effects on arachidonic acid metabolism，serotonin synapses and antibiotic biosynthetic pathways in soil. Correlation analyses revealed that soil pH，and available iron，available zinc，total salt，total nitrogen， alkaline hydrolysis nitrogen，organic matter，available potassium contents were the main factors affecting the changes in soil bacterial communities in peach multi-planting seedling sites，whereas palmitic acid，5-chloro-2，8-dimethyl-4-［（3-nitro-2- pyridinyl）oxy］quinoline and γ-nonanolactone were the main metabolites regulating the soil bacterial communities in peach multi-planting seedling sites. In summary，compared with the same layer of CK，organic matter，total phosphorus，available potassium，available iron and available zinc contents were decreased more in the 20-40 cm soil layer than those in the 0-20 cm soil layer. Changes in the dominant bacterial phyla and genera resulted in a significant increase in the content of acid substances in soil，biosynthetic pathways of arachidonic acid metabolism，serotonin synapses and antibiotics were enriched with higher intensity and the content of differential metabolites was significantly reduced. The correlation analysis showed that，changes in soil microbial communities in peach multi-planting sites were significantly correlated with soil pH，available iron and available zinc contents， while metabolites such as palmitic acid，5-chloro-2，8-dimethyl-4-［（3-nitro-2-pyridinyl）oxy］quinoline，and γ-nonanolactone were the main metabolites affecting the structure of soil bacterial communities in peach multi-planting seedling sites.
Keywords
桃（Amygdalus persica L.）属于蔷薇科李属植物，是一种多年生落叶乔木，其果肉和核仁均可食用，花可作观赏，具有较高的经济价值[1]。桃源产自中国，在我国桃的种植历史长达上千年[2]。桃生产周期短，老龄桃、重茬果园、碱性土壤的新植桃园及重茬育苗地等反复使用导致桃连作障碍现象日益凸显，主要表现为桃树长势减弱，根系的分生能力降低，抗逆性降低，产量和品质下降等[3-4]。连作障碍效应已成为影响桃产业发展的主要因素之一。
连作障碍现象在大田作物、园艺植物、中药材植物等栽培过程中普遍存在[5-6]。引起连作障碍的原因包括非生物因素和生物因素，非生物因素包括土壤理化性质恶化、养分失衡和自毒物质积累等，而生物因素包括土壤微生物群落失调和病原微生物累积等[7-8]。连作过程中，单一种植模式易导致土壤养分失衡，植物需求量高的养分易出现匮乏，而植物需要量低的养分易出现积累[9-10]。作物连作过程中，植物自毒物质在土壤中大量积累，对植物根系产生毒害作用，影响植物的正常生长[11]。随着连作年限的增加，土壤微生物群落特征发生显著变化，并且连作过程中土壤有害微生物的积累导致植物土传病害发病率显著增加，造成作物减产甚至大面积死亡[12]。目前，关于桃连作障碍的研究主要集中于土壤养分和自毒作用方面。研究发现，随着种植年限的增加，土壤理化性质恶化易导致桃发生缺素现象，如桃连作过程中土壤酸化情况严重，桃易出现缺钙、镁等元素[13-14]。此外，桃连作过程中自毒物质，如扁桃苷、苯甲酸和苯甲醛等在土壤中大量积累，严重影响桃的正常生长[14]。
本文通过微生物基因组测序技术结合土壤代谢组学分析，探讨了连作对桃育苗地土壤理化性质、微生物群落特征和代谢产物的影响，分析了引起桃连作障碍的主要因素，以期为阐明桃连作障碍成因提供一定的理论基础。
1 材料与方法
1.1 试验地概况
试验地位于甘肃省农业科学院内果园桃育苗地，其基本理化性状见表1。
表1试验地土壤基本理化性状
1.2 试验设计和采样方法
本试验选取自然生草地为对照 0～20 cm（CK 20）、20～40 cm（CK 40），选取连作 3 年 0～20 cm（3a20）、20～40 cm 土层（3a40）桃育苗地的土壤为研究对象。每个处理划分为 3 个小区，每个小区为一个重复，于 2023 年 9 月中旬采集土壤样本，采样前先移去土壤表面的植物残体，采用 5 点取样法分层采取 0～20 和 20～40 cm 的重茬育苗地土壤（CK 采集自然生草地土壤），装入无菌密封袋，冰盒保存，迅速带回实验室[15]。将每个重复分为 3 份，一份避光风干过 0.25 mm 筛后用于土壤理化性质的测定，其余两份均于-80℃保存用于非靶向代谢组学分析和高通量测序。
1.3 土壤理化性质测定
土壤 pH 使用 pHS-25 型酸度计测定，水土比为 2.5∶1，土壤电导率使用 DDS-12A 电导仪测定，土壤全氮采用凯氏定氮法测定，土壤全磷采用碱融-钼锑抗比色法测定，土壤全钾采用碱融-火焰光度法测定，土壤碱解氮采用碱解扩散法测定，土壤有效磷采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法测定，土壤速效钾采用乙酸铵浸提-火焰光度法测定，土壤有机质采用重铬酸钾硫酸氧化-外加热法测定，土壤有效铁、有效锌均采用原子吸收分光光度法测定[16]。
1.4 土壤微生物群落测序
准确称取 0.5 g 的土壤样品，按照试剂盒（Fast DNA SPIN kit for soil）上的操作流程提取土壤微生物总 DNA，使用引物 338F（5′-ACTCCTACGG GAGGCAGCAG-3 ′） 和 806R（5 ′-GGACTACHVG GGTWTCTAAT-3′）对细菌 16S rRNA 基因序列进行 PCR 扩增，反应体系：PCR 2×Master Mix（2×） 15 μL，引物（0.2 μmol·μL-1）338F/806R 各加1 μL，DNA 模板（1 ng·μL-1）加 1 μL，ddH2O 加 2 μL。反应条件：预变性 98℃ /30 s，变性 98℃ /30 s，退火 50℃ /30 s，延伸 72℃ /30 s，25 次循环，再延伸 72℃ /5 min。使用 NanoDrop 1000 超微量分光光度计和 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物纯度，纯化后的产物使用 Qiagen Gel Extraction Kit 试剂盒进行回收。使用 TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Ki 试剂盒构建基因文库，使用 Qubit 进行 DNA 定量和文库检测，使用 Illumina MiSeq 平台进行 16s 基因测序，测序工作由北京诺禾致源科技股份有限公司完成。
1.5 土壤代谢组分析
另取 0.5 g 土壤样品用于测定代谢组。具体方法采用郭俏等[17]的方法。
1.6 数据分析
利用 SPSS 26.0 分析不同样本之间不同指标的显著性差异（ANOVA，LSD，P<0.05）。使用 R 4.2.1 的 ggvenn 包和 Psych 包分析细菌群落不同 OTU 之间的相关性，并绘制不同处理细菌 OTU 之间的韦恩图，使用 R 4.2.1 的 circlize 包绘制差异代谢产物的和弦图，使用 R 4.2.1 的 ggplot2 包绘制差异代谢通路富集气泡图，采用 R 4.2.1 的 ggcorplot 绘制微生物、土壤理化性质和代谢组的相关性热图。微生物分子生态网络图使用 Gephi 0.10.1 进行数据可视化分析，使用 Canoco 5 进行代谢物的主成分分析 （PCA）进行分析，利用偏最小二乘判别分析 （PLS-DA）筛选桃重茬育苗地土壤差异代谢产物，使用 Origin 2021 绘制差异代谢产物的火山图，采用 Origin 2021 绘制代谢通路中差异代谢产物含量条形图。
2 结果与分析
2.1 连作对桃重茬育苗地土壤理化性质的影响
由表2可知，在 0～20 cm 土层，连作 3 年土壤的有机质、全磷、碱解氮、速效钾、有效铁和有效锌含量分别降低了 19.90%、7.29%、19.82%、 64.72%、54.10% 和 33.76%。而连作 3 年的土壤全氮含量显著增加了 26.96%。在 20～40 cm 土层范围内，较 CK 40 处理，3a40 处理土壤的有机质、全磷、全钾、碱解氮、速效钾、有效锌和有效铁的含量分别下降了 7.69%、17.48%、7.04%、17%、 46.04%、48.14%、46.24%。在 0～20 和 20～40 cm 土层中，pH 值较同层 CK 略低。
表2连作对桃重茬育苗地土壤理化性质的影响
注：表中数据为平均值 ± 标准误差（n=3）；同一行不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。下同。
2.2 连作对桃重茬育苗地土壤微生物多样性的影响
由表3可知，不同处理的 Coverage 指数均在 98% 以上，表明测序结果良好且能够反映整体样本中微生物群落的真实情况。在 0～20 cm 土层范围内，较 CK 20 处理，3a20 处理的土壤细菌 OTU 数量降低了 4.9%，土壤 Shannon、Chao1 和 Ace 指数显著降低（P<0.05），在 20～40 cm 土层范围，较 CK 40 处理，3a40 处理土壤细菌群落 Ace、Chao1 和 Shannon 指数显著降低，而 Simpson 指数则显著升高。
相同处理不同土层之间细菌多样性指数存在一定的差异性（表3）。CK 40 和 3a40 处理的 OTU 数量较 CK 20 和 3a20 处理分别下降了 8.92% 和 4.54%，相应细菌群落的 Ace、Chao1、Simpson 和 Shannon 指数均显著下降。同时发现，较 CK 20 处理，3a40 处理的 OTU 数量下降了 9.00%，细菌群落的 Ace、Chao1 和 Shannon 指数均显著下降。较 CK 40 处理，3a20 处理的 OTU 数量增加了 4.67%，细菌群落的 Simpson 和 Chao1 指数均显著下降，而 Shannon 和 Ace 指数显著增加。
表3桃重茬育苗地土壤细菌群落的 α 多样性分析
2.3 连作对桃重茬育苗地土壤细菌群落结构和丰度的影响
由图1a所示，在 0～20 cm 土层范围，土壤中优势细菌门（相对丰度 >1%）为变形菌门（Proteobacteria，CK 20：34%，3a20：31%）、未分类细菌门（unidentified_Bacteria，CK 20：20%，3a20： 19%）、酸杆菌门（Acidobacteria，CK 20：13%， 3a20：12%）、拟杆菌门（Bacteroidota，CK 20： 7%，3a20：5%）、疣微菌门（Verrucomicrobia， CK 20：4%，3a20：4%）、放线菌门（Actinobacteria，CK 20：4%，3a20：4%）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes，CK 20：2%，3a20：4%）、浮霉菌门（Planctomycetes，CK 20：2%，3a20：3%）、粘菌门（Myxomycophyta，CK 20：2%，3a20：3%）、 Actinobacteriota（CK 20：2%，3a20：2%）、绿弯菌门（Chloroflexi，CK 20：2%，3a20：2%）、厚壁菌门（Firmicutes，CK 20：2%，3a20：1%） 和硝化螺旋菌门（Nitrospira，CK 20：1%，3a20： 1%）。较 CK 20 处理，3a20 处理的变形菌门、未分类细菌门、酸杆菌门、拟杆菌门、厚壁菌门的丰度均呈降低的趋势，而芽单胞菌门、浮霉菌门和粘菌门的丰度均呈增加的趋势。
由图1b可知，在 0～20 cm 土层范围，土壤中优势细菌属（相对丰度 >1%）为鞘脂单胞菌属（Sphingomonas，CK 20：6%，3a20：5%）、 NMD1 属（CK 20：4%，3a20：12%）、Ellin6067 属（CK 20：3%，3a20：2%）、Acidibacter 属 （CK 20：3%，3a20：2%）、Arthrobacter 属（CK 20：2%，3a20：4%）、RB41 属（CK 20：2%， 3a20：4%）、Steroidobacter 属（CK 20：2%，3a20：3%）、Skermanella 属（CK 20：2%，3a20： 3%）、Chryseolinea 属（CK 20：2%，3a20：1%）、 Chthoniobacter 属（CK 20：2%，3a20：1%）、 Subgroup_10 属（CK 20：2%，3a20：4%）、小梨形菌属（Pirellula，CK 20：2%，3a20：1%）、 Thermomonas 属（CK 20：2%，3a20：1%）、 Nitrospiraceae 属（CK 20：3%，3a20：2%）、 Lysobacter 属（CK 20：2%，3a20：1%）、Candidatus_Nitrocosmicus 属（CK 20：1%，3a20：1%）、 Bryobacter 属（CK 20：1%，3a20：1%）。较 CK 20 处理，3a20 处理的鞘脂单胞菌属、Ellin6067 属、 Acidibacter 属、Chryseolinea 属、Chthoniobacter 属、小梨形菌属、Thermomonas 属、Nitrospiraceae 属、Lysobacter 属的丰度均呈降低的趋势，而 NMD1 属、 Arthrobacter 属、RB41 属、Steroidobacter 属、Skermanella 属、Subgroup_10 属的丰度均呈升高的趋势。
由图1c可知，在 20～40 cm 土层，土壤中优势细菌门（相对丰度 >1%）为变形菌门（CK 40： 68%，3a40：60%）、酸杆菌门（CK 40：8%，3a40：11%）、放线菌门（CK 40：5，3a40：5）、 unidentified_Bacteria（CK 40：1%，3a40：2%）、厚壁菌门（CK 40：2%，3a40：1%）、泉古菌门 （Crenarchaeota，CK 40：2%、3a40：1%）、疣微菌门（Verrucomicrobia，CK 40：1%，3a40：2%）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes，CK 40：2%，3a40：4%）、Actinomycetota（CK 40：2%，3a40： 3%）、浮霉菌门（Planctomycetes，CK 40：1%，3a40：2%）、Thermoplasmatota（CK 40：1%，3a40： 2%）、Elusimicrobiota（CK 40：2%，3a40：1%）、 Methylomirabilota（CK 40：1%，3a40：1%） 和 Armatimonadota（CK 40：1%，3a40：1%）。较 CK 40 处理，3a40 处理的变形菌门、厚壁菌门、泉古菌门和 Elusimicrobiota 的丰度均呈降低的趋势，而酸杆菌门、疣微菌门、芽单胞菌门、Actinomycetota、浮霉菌门和 Thermoplasmatota 丰度均呈升高的趋势。
由图1d看出，在 20～40 cm 土层，土壤中优势细菌属（ 相对丰度 >1%） 为 NMD1 属（CK 40：8%，3a40：11%）、鞘脂单胞菌属（CK 40： 1%，3a40：2%）、Ellin6067 属（CK 40：2%，3a40：1%）、Acidibacter 属（CK 40：1%，3a40： 1%）、Arthrobacter 属（CK 40：2%，3a40：1%）、 RB41 属（CK 40：5%，3a40：5%）、Steroidobacter 属（CK 40：1%，3a40：2%）、Chryseolinea 属（CK 40：1%，3a40：1%）、Subgroup_10 属（CK 40：2%，3a40：3%）、Thermomonas 属 （CK 40：1%，3a40：1%）、Nitrospiraceae 属（CK 40：1%，3a40：2%）。较 CK 40 处理，3a40 处理的 Ellin6067 属、Arthrobacter 属的丰度均呈降低的趋势，而 NMD1 属、鞘脂单胞菌属、Steroidobacter 属、 Subgroup_10 属和 Nitrospiraceae 属的丰度均呈升高的趋势。
2.4 连作对桃重茬育苗地土壤细菌群落结构的影响
筛选相对丰度 >5% 的 OTU，计算 OTU 之间的相关性系数，构建微生物分子生态网络。如图2所示，图中每个圆圈代表一个细菌属，相同颜色的圆隶属同一个门；圆圈之间的连线代表相连的两个 OTU 之间的 Spearman 系数，蓝色连线代表正相关，粉色连线代表负相关；线条的粗细与 r 值呈正相关，连线越多，表明该节点与其他节点的相关性越高，其中心性越强，节点就越大，为构建细菌分子生态网络的关键物种。
图1桃重茬育苗地土壤细菌群落丰度
注：a 为 0～20 cm 门水平；b 为 0～20 cm 属水平；c 为 20～40 cm 门水平；d 为 20～40 cm 属水平。
不同处理之间细菌分子生态网络之间的互作关系均以协同作用为主，正相关系数均在 50% 以上（表4）。在 0～20 cm 土层中，较 CK 20 处理， 3a20 处理的网络节点数和连接边数减少，其中构成 CK 20 处理的分子生态网络的关键类群主要为变形菌门（37.57%）、拟杆菌门（13.23%）、放线菌门（11.64%） 和厚壁菌门（4.76%） 等。构成 3a20 处理的分子生态网络的关键类群主要为变形菌门（37.57%）、放线菌门（13.73%）、拟杆菌门（9.8%） 和粘菌门（5.88%） 等。而在 20～40 cm 土层中，较 CK 40 处理，3a40 处理的网络节点数和连接边数减少，其中构成 CK 40 处理的分子生态网络的主要类群为变形菌门（37.57%）、厚壁菌门（15.82%）、拟杆菌门（10.17%） 和放线菌门（8.47%） 等。构成 3a40 处理的分子生态网络的主要类群为变形菌门（37.4%）、放线菌门（12.2%）、拟杆菌门（8.13%）和粘菌门 （5.88%）等。
图2桃重茬育苗地土壤细菌群落分子生态网络分析
表4桃重茬育苗地土壤细菌群落分子生态网络参数
2.5 桃重茬育苗地土壤代谢物组分分析
本文中不同土壤样品中共检测出 292 种代谢产物，其中包括脂质和类脂分子（Lipids and lipid-like molecules，67 种）、有机酸及其衍生物 （Organic acids and derivatives，22 种）、苯类物质 （Benzenoids，21 种）、有机氧化合物（Organic oxygen compounds，18 种）、核苷及核苷酸和类似物（Nucleosides，nucleotides and analogues，14 种）、有机杂环化合物（Organoheterocyclic compounds，11 种）、苯丙类和聚酮类（Phenylpropanoids and polyketides， 6 种）、有机氮化合物（Organic nitrogen compounds， 1 种）和生物碱及其衍生物（Alkaloids and derivatives，1 种）（图3a）。
通过对不同处理土壤代谢产物的 PCA 分析可知，3a20 和 CK 20 处理分别在第一象限和第四象限，3a40 和 CK 40 处理分别在第二象限和第三象限，总解释率为 68.11%，其中 PC1 和 PC2 的贡献率分别为 41.19% 和 26.92%。表明不同处理的土壤代谢组成分差异较大（图3b）。
图3桃重茬育苗地土壤代谢产物组分分析
注：a 为代谢产物分类饼图，b 为代谢产物主成分分析。
2.6 桃重茬育苗地土壤差异代谢物筛选
通过 PLS-DA 分析，筛选出差异代谢产物 105 种（VIP>1 且 P<0.05）（图4）。CK 20 vs 3a20 处理筛选得到差异代谢产物 59 种，包括上调代谢产物 30 种，下调代谢产物 29 种（图4a），其中上调代谢产物中酸类占比最高（33.33%），下调代谢产物中糖类占比较高（22.21%）。CK 40 vs 3a40 处理筛选得到差异代谢产物 57 种，包括上调代谢产物 24 种，下调代谢产物 33 种（图4b），其中上调代谢产物中酸类占比最高（24%），下调代谢产物中酯类占比较高（15.15%）。可见，连作 3 年时土壤中 （R）-3-羟基肉豆蔻酸、3，5-二甲氧基苯甲酸、4-（苄氧基）苯甲酸、4-羟基苯甲酸、棕榈酸和棕榈油酸等自毒含量显著增加。
根据差异代谢产物之间的 Pearson 相关系数，筛选 P 值较低的前 20 个差异代谢产物绘制和弦图，其中每个圆圈为一个代谢产物，圆圈的大小与 FC 值（Fold Change）呈正相关，圆圈之间的连线代表代谢物之间的相关性，其中蓝色连线代表正相关，红色连线代表负相关，线条的粗细与 r 值呈正相关。
由图5a可知，CK 20 与 3a20 处理相比，美沙酮-D9（methadone-d9）（FC：7.00；P<0.001）、20-羟基-（5Z，8Z，11Z，14Z）-二十碳四烯酸 [20-Hydroxy-（5Z，8Z，11Z，14Z）-eicosatetraenoic acid]（FC：2.94；P<0.001）、15-氧代乙二胺 （15-OxoEDE）（FC：2.59；P<0.001）和（±）12 （13）-DiHOME（FC：2.45；P<0.001）等显著上调，而 5-羟基色醇（5-HydroxytryPtoPhol）（FC：-6.70； P<0.001）、Mag（18∶ 1）（FC：-5.37；P<0.001）、对乙酰基-L-酪氨酸（P-N-Acetyl-L-tyrosine）（FC：-5.18；P<0.001） 和木质素酸（Lignoceric Acid）（FC：-5.18；P<0.001）等显著下调；不同处理的土壤中不同代谢物之间以正相关关系（52%） 为主。
图4桃重茬育苗地土壤差异代谢产物筛选
注：a 为 0～20 cm 土层，b 为 20～40 cm 土层。图5 同。
由图5b所示，CK 40 与 3a40 处理相比，美沙酮-D9（FC：7.00；P<0.001）、20-羟基-（5Z，8Z， 11Z，14Z）-二十碳四烯酸（FC：2.94；P<0.001）、 （±）12（13）-DiHOME（FC：2.45；P<0.001） 和 N，5-二苯基-1，3，4-恶二唑-2-甲酰胺（N， 5-diPhenyl-1，3，4-oxadiazole-2-carboxamide）（FC： 2.41；P<0.001）等显著上调。而四氢皮质酮（Tetrahydrocorticosterone）（FC：-5.11；P<0.001）、N-苄基-N-异丙基-N′-[4-（三氟甲氧基）苯基]脲 [N-benzyl-N-isoProPyl-N′-[4-（trifluoromethoxy） Phenyl]urea]（FC：-3.53；P<0.001）、2-羟基-1-（4-甲氧基苯基）丙基吡喃己糖苷[2-Hydroxy-1-（4-methoxyPhenyl）ProPyl hexoPyranoside]（FC：-3.14；P<0.001） 和 9-（3-O-甲基呋喃糖基）-1，9-二氢-6H-嘌呤-6-酮[9-（3-O-MethylPentofuranosyl）-1， 9-dihydro-6H-Purin-6-one]（FC：-1.47；P<0.001） 等显著下调；不同处理的土壤中不同代谢物之间的互作关系主要以正相关（50.5%） 为主。
图5桃重茬育苗地土壤差异代谢产物互作和弦图
2.7 桃重茬育苗地土壤差异代通路分析
通过对桃重茬育苗地土壤代谢产物进行 KEGG 代谢通路分析（图6）可知，CK 20 与 3a20 处理相比，植物次生代谢产物的生物合成（Biosynthesis of plant secondary metabolites）、植物激素生物合成（Biosynthesis of plant hormones）、不饱和脂肪酸的生物合成（Biosynthesis of unsaturated fatty acids）和二级胆汁酸的生物合成（Secondary bile acid biosynthesis）等所含的代谢产物数量较多 （图6a）。其中花生四烯酸代谢（Arachidonic acid metabolism） 和羟色胺突触（Serotonergic synapse） 通路的富集程度较高，所含的差异代谢产物的数量最多（均为 3 个） （图6b）。CK 40 与 3a40 处理相比，抗生素的生物合成（Biosynthesis of antibiotics）、植物激素的生物合成（Biosynthesis of plant hormones）、磷酸转移酶系统（Phosphotransferase system）和不饱和脂肪酸的生物合成（Biosynthesis of unsaturated fatty acids）等所含的代谢产物数量较多（图6c），其中抗生素生物合成通路的富集程度较高，所含的差异代谢产物的数量最多（3 个）（图6d）。
图6桃重茬育苗地土壤差异代谢通路的 KEGG 富集分析
注：a、c 为二级代谢通路，b、d 为一级代谢通路。
2.8 桃重茬育苗地土壤理化性质、代谢组学和微生物组学的相关性分析
选取相对丰度较高的前 20 个细菌门，通过分析土壤理化性质、代谢产物和微生物群落之间的相关性，筛选与微生物群落相关的土壤理化因素和代谢产物，绘制相关性热图。如图7所示，土壤 pH 及有效铁、有效锌、全盐量、全氮、碱解氮和速效钾均与变形菌门、拟杆菌门和浮霉菌门呈显著正相关，而有机质则与变形菌门、拟杆菌门、浮霉菌门和疣微菌门呈显著正相关。pH 与芽单胞杆菌门、放线菌门、NB1-j、Methylomirabilota、硝化螺旋菌门呈显著负相关。有机质与粘菌门、芽单胞杆菌门、放线菌门、Methylomirabilota、硝化螺旋菌门和 Latescibacterota 呈显著负相关。全盐量与芽单胞杆菌门、粘菌门、放线菌门、硝化螺旋菌门和 Latescibacterota 呈显著负相关。碱解氮与芽单胞杆菌门、放线菌门、 NB1-j、Methylomirabilota、硝化螺旋菌门和 Latescibacterota 呈显著负相关。速效钾与芽单胞杆菌门、粘菌门、NB1-j、Methylomirabilota、硝化螺旋菌门、 Entotheonellaeota 和 Latescibacterota 呈显著负相关。全氮与芽单胞杆菌门、放线菌门、Methylomirabilota、硝化螺旋菌门和 Latescibacterota 呈显著负相关。有效锌与芽单胞杆菌门、粘菌门、放线菌门、NB1-j、 Methylomirabilota、硝化螺旋菌门、Latescibacterota 和泉古菌门（Crenarchaeota）呈显著负相关。有效铁与芽单胞杆菌门、放线菌门、Methylomirabilota 和 Latescibacterota 呈显著负相关。
棕榈酸与芽单胞杆菌门、放线菌门、NB1-j、 Methylomirabilota、硝化螺旋菌门和 Latescibacterota 呈显著正相关，与浮霉菌门、变形菌门、拟杆菌门和 Actinobacteria 呈显著负相关。5-氯-2，8-二甲基-4-[（3-硝基-2-吡啶基）氧基]喹啉与 Entotheonellaeota 和 RCP2-54 呈显著正相关，与酸杆菌门呈显著负相关，γ-壬内酯和 Actinobacteria 呈显著正相关。异佛尔酮与放线菌门、NB1-j、Methylomirabilota、硝化螺旋菌门和 Latescibacterota 呈显著负相关，与疣微菌门、变形菌门和酸杆菌门呈显著负相关。东莨菪素与酸杆菌门呈显著正相关，七叶苷与疣微菌门和酸杆菌门呈显著正相关。延胡索酸与 Planctomycetota 呈显著正相关。
图7桃重茬育苗地土壤理化性质、代谢产物和微生物群落的相关性分析
3 讨论
3.1 桃重茬育苗地土壤理化性质的变化
作物重茬过程中，长期施用肥料会导致酸根离子在土壤中积累，导致土壤 pH 降低和盐分物质在土壤中的积累，进而影响植物的正常生长，导致连作障碍的发生[18]。另外，作物连作过程中长期施用单一的肥料易造成植物产生偏好性吸收，导致土壤中养分失衡，加剧了连作障碍效应[19]。Chen 等[20]研究发现，草莓连作过程中土壤的 pH 及速效钾和有机碳含量与连作年限呈负相关关系，而全氮和全磷则大量积累。Liu 等[21]研究表明，土壤 pH 显著降低和土壤盐分含量显著增加是引起西洋参连作障碍的关键因素。本研究中，0～20 cm 土层，较 CK 处理，连作 3 年的土壤中 pH 及有机质、全磷、速效钾、有效铁和有效锌含量降低，而全氮和有效磷含量则增加，20～40 cm 土层，pH 及全盐量、有机质、全磷、全氮、全钾、碱解氮、速效钾、有效铁、有效锌含量降低，有效磷含量升高。0～20 cm 土层全氮含量增加，可能是本试验 CK 处理为自然生草区，处理土壤结构有利于土壤墒情调节的同时可增加土壤有机质含量，通过调节地温，间接调节了果树根系对养分的利用特性。同样在 20～40 cm 土层，其他土壤养分含量因重茬均降低，有效磷则增加，可能与桃生长过程中所需有效养分不同有关，具体生理机理需进一步研究。
3.2 桃重茬育苗地土壤细菌群落特征变化
农业生产中，微生物参与了土壤养分循环的同时在土壤有害物质净化、维持土壤健康等方面也发挥着重要的作用[22]。连作中，土壤细菌群落的丰度和多样性降低，微生物群落结构失衡，导致土壤微生物群落的稳定性下降[23]。Chen 等[24]研究发现，作物连作后土壤中有益微生物的丰度显著降低，而有害微生物大量积累，导致植物病害的发生。本研究中，CK 处理为果园自然生草区，果园行间生草技术的应用可改变土壤的理化性质、微生物种群，继而最终提高果品产量和品质。笔者在前期的研究结果发现，生草果园可提高土壤氮、磷、钾含量及酶活性，并显著改变了土壤真菌、细菌结构，提高共生细菌的种类，降低病原菌种类[25]。本试验中，与 CK 处理相比，重茬育苗地 3 年后 0～20 和 20～40 cm 土层中细菌群落的多样性显著降低，微生物分子生态网络的复杂性降低，构成细菌群落分子生态网络的关键细菌多样性减少，研究结果与 Tan 等[18]相似，近年来，随着现代果园产业的发展，果园生草模式已大面积推广应用，本研究基于生草果园模式下开展研究重茬育苗地的生理生化及微生物特性变化，其机理需进一步深入研究，为重茬地的改良提供理论基础。
3.3 桃重茬育苗地土壤代谢组特征的变化
重茬育苗中，根际代谢产物会大量积累，尤其酚酸类物质的积累会对植物根系产生毒害作用，从而诱发连作障碍[9]。Gui 等[26]研究发现，在大豆长期连作中，土壤中对植物有害的次生代谢产物如酚酸类和酯类等物质在根际富集，导致自毒作用的发生，进而影响植物的生长发育。Huang 等[27]研究发现，连作使甜菜根际土壤中水杨酸大量积累，而蔗糖含量显著降低，表明作物连作影响了土壤代谢途径和次生代谢的生物合成。本研究中，不同土层中脂质和类脂分子、有机酸及其衍生物、苯类物质和有机氧化合物等代谢产物的占比较高。0～20 cm 土层中共有差异代谢产物 59 种，而 20～40 cm 土层中共有差异代谢产物 57 种，总体上连作 3 年时土壤中酸类物质的含量显著增加，植物自毒物质如（R）-3-羟基肉豆蔻酸、3，5-二甲氧基苯甲酸和 4-（苄氧基）苯甲酸等的含量在土壤中呈增加趋势，表明桃重茬育苗地连作过程中土壤自毒物质显著积累，加剧了桃的连作障碍效应。而本研究发现，土壤中花生四烯酸代谢、羟色胺突触和抗生素的生物合成通路也受到连作的影响，与之相关的差异代谢产物的含量显著降低，说明花生四烯酸代谢通路富集与（R）-3-羟基肉豆蔻酸等降解有关。
3.4 土壤理化性质、微生物群落及代谢产物的相关性分析
作物连作过程中土壤矿化能力减弱和代谢物的积累改变了根际土壤环境，影响微生物的群落结构，多种因素综合作用诱导了连作障碍的发生[28]。 Chen 等[29]研究发现，连作过程中土壤全氮、全磷和有机碳含量显著增加，而土壤速效养分含量则显著降低，自毒物质积累，从而影响微生物群落的多样性。本研究中土壤有机质、全磷、速效钾、有效铁和有效锌含量降低，而全氮含量则增加，可能重茬后，棕榈酸、5-氯-2，8-二甲基-4-[（3-硝基-2-吡啶基）氧基]喹啉等代谢产物富集发生变化，从而引起土壤养分有效性产生失衡，全氮含量反而增加，其原因可能为重茬后土壤 5-氯-2，8-二甲基-4-[（3-硝基-2-吡啶基）氧基]喹啉和异佛尔酮等物质长期累积，影响了土壤微生物的群落结构稳定性，使土壤养分的释放能力和作物吸收发生失衡。同时，土壤中适量的棕榈酸和延胡索酸等有机酸有利于促进土壤磷素循环，因此，重茬育苗后土壤全磷含量下降。但过量累积则会导致土壤酸化，不利于细菌的生存[30]。东莨菪素、七叶苷和 γ-壬内酯多来自于植物的代谢物，与 Actinobacteria、酸杆菌门、疣微菌门和 Planctomycetota 呈显著正相关，可见，此类微生物能够参与并促进相应代谢产物的合成[31]。
4 结论
重茬使桃育苗土壤有机质、全磷、碱解氮、速效钾、有效铁和有效锌的含量随着育苗年限的增加而降低，而全氮含量反而显著增加，使供给桃苗生长可利用的营养成分严重失衡。同时还影响了土壤中细菌的多样性和群落的稳定性，致使土壤中酸类物质的含量显著增加，花生四烯酸代谢、羟色胺突触和抗生素生物合成通路的富集强度较高且所含差异代谢产物的含量显著降低。
综上所述，桃重茬地土壤微生物群落的变化与土壤 pH 及有效铁和有效锌等含量具有显著相关性，而棕榈酸、5-氯-2，8-二甲基-4-[（3-硝基-2-吡啶基）氧基]喹啉和 γ-壬内酯等代谢产物是影响桃重茬育苗地土壤细菌群落结构的主要代谢产物。
