摘要
为探讨不同微生物类群接种顺序在不同类型矿物参与下形成木质素-矿物复合体腐殖质组成的差异影响，采用液体摇瓶法，在分别装有针铁矿（Goe）、三羟铝石（Bay）、δ-MnO2（MnO）、高岭石（Kao）和蒙脱石（Mon）的木质素培养液中接种由巨型芽孢杆菌（Bacillus megaterium，B）、灰色链霉菌（Streptomyces griseus， S）、黑曲霉（Aspergillus niger，A）3 种菌株全排列组成的 6 种微生物接种顺序（ABS、ASB、BAS、BSA、SBA 和 SAB），以此揭示历经腐殖化作用木质素-矿物复合体腐殖质组成的差异，探索细菌、放线菌及真菌三者不同接种顺序对木质素腐殖化作用的差异影响。结果表明：（1）基于 Kao 的添加，各接种顺序在培养后均促使类胡敏酸 （HLA）分子结构的脂族化，使分子缩聚程度降低，尤以 A.niger → B.megaterium → S.griseus 的接种顺序影响最显著，添加 Mon 也表现为相同规律；（2）Goe、MnO 和 Bay 对 HLA 形成的促进作用要高于 Kao 和 Mon，其中以 Goe 效果最佳，基于上述 5 种矿物的添加，在 B.megaterium → A.niger → S.griseus 接种顺序下，HLA 分子更易遭致降解。相反，A.niger → B.megaterium → S.griseus 接种顺序配合 Goe 或 MnO 的添加更易促进 HLA 碳含量（CHLA）的积累；（3）同等条件下，Goe 对腐殖质品质的改善效果显著高于其他矿物；MnO 添加条件，历经 110 d 培养，唯有 B.megaterium → A.niger → S.griseus 的接种顺序使 HLA 与类富里酸（FLA）碳含量之比（CHLA/CFLA）持续降低，其余接种顺序均不同程度地提高了 CHLA/CFLA。基于 Bay 或 Kao 的添加，S.griseus → A.niger → B.megaterium 接种顺序的培养均使 CHLA/CFLA 提高，而 Mon 添加、结合 S.griseus → B.megaterium → A.niger 的接种顺序使 CHLA/CFLA 增加幅度达到最大；（4）接种顺序相同、矿物种类不同会影响培养后类胡敏素（HLu）碳含量（CHLu）的丰缺，恰当的接种顺序辅以适当的矿物类型会促进 HLu 的分解，如 Kao 添加辅以 S.griseus → A.niger → B.megaterium 的接种顺序、 A.niger → S.griseus → B.megaterium 搭配 Goe 的添加、A.niger → B.megaterium → S.griseus 结合 MnO 的添加均可有效促进 HLu 的降解。Goe 对腐殖质品质的改善效果最佳，尤其是在 A.niger → B.megaterium → S.griseus 接种培养下更易促进 HLA 的形成，而 A.niger → S.griseus → B.megaterium 辅以 Goe 的添加更易促进惰性腐殖质组分——HLu 的分解并使其向其他活性腐殖质组分转化。
Abstract
This study aimed to investigate the impact of inoculation sequences from three microbial groups on the humus composition associated with different mineral types involved in lignin-mineral complex formation．The liquid shaking bottle method was adopted to inoculate six distinct microbial sequences（ABS，ASB，BAS，BSA，SBA，and SAB），which comprised three strains：Bacillus megaterium（B），Streptomyces griseus（S），and Aspergillus niger（A）within a lignin culture medium containing goethite（Goe），bayerite（Bay），δ-MnO2（MnO），kaolinite（Kao），and montmorillonite（Mon）． This approach aimed to elucidate the variations in the composition of lignin-mineral complexes formed during humification，and explored how different bacterial，actinomycete，and fungal inoculation sequences influenced the lignin humification process．The results indicated that：（1）The incorporation of kaolinite in various inoculation sequences enhanced thealiphatic structure of HLA molecules post-culture，leading to a reduction in molecular condensation，with the sequence A.niger → B.megaterium → S.griseus exhibiting the most pronounced effect；Similarly，montmorillonite addition demonstrated an analogous trend．（2）Goethite，δ-MnO2，and bayerite exhibited superior promoting effects on HLA formation compared to kaolinite and montmorillonite，with goethite yielding the most significant results．When these five minerals wereadded， HLA molecules showeda greater tendency for degradation under the inoculation sequence B.megaterium → A.niger → S.griseus；conversely，the sequence A.niger → B.megaterium → S.griseus combined with either goethite orδ-MnO2 was more conducive to enhancing CHLA levels．（3）Under identical conditions，goethite significantly outperformed other minerals in improving humus quality；Specifically，underδ-MnO2 supplementation，only the B.megaterium → A.niger → S.griseus sequence resulted inacontinuous decline in the C content ratio（CHLA/CFLA）between humic acid and fulvic acid （FLA）after 110 days of culture，whereas all other inoculation sequences led to varying degrees of increase in CHLA/CFLA ratios when bayerite or kaolinite were added alongside S.griseus → A.niger → B.megaterium sequencing which notably raised CHLA/CFLA levels，and the largest increment was observed with S.griseus → B.megaterium → A.niger sequencing． （4）Identical inoculation sequences paired with different mineral types influenced both abundance and deficiency of CHLu after cultivation，thus appropriate combinations of inoculation sequences and mineral types facilitated humin（HLu） decomposition．For instance：under kaolinite conditions using S.griseus → A.niger → B.megateriumasan inoculation sequence or employing goethite along with A.niger → S.griseus → B.megaterium orδ-MnO2 combined with A.niger → B. megaterium → S.griseus effectively promoted HLu degradation processes. Goethite proved optimal for enhancing humic quality while fostering HLA formation was more likely through culturing via A.niger → B.megaterium → S.griseus. Additionally， A.niger → S.griseus → B.megaterium supplemented by goethite appeared particularly effective at facilitating inert humic component（HLu）decomposition into other active humic component．
Keywords
微生物在维系土壤功能及土壤有机质（SOM） 生物转化过程中发挥着重要作用。长期以来，微生物代谢产物一直被认为是 SOM 的主要成分[1]。微生物、SOM 及矿物间的相互作用控制着土壤地球化学反应，其中最重要的当属腐殖化作用，最终形成土壤腐殖质（HS）[2]。不同微生物类群以及矿物种类势必会影响土壤环境中 HS 的形成[3-4]。
木质素是生物圈中含量最丰富的芳香族生物聚合物，由于其高度不规则的聚合物结构，很难被生物降解[5]。木质素是 HS 分子芳香性的主要贡献者[6]。土壤中木质素结构稳定与黏土矿物的相互作用有关[7]。关于微生物降解木质素的研究大多集中在真菌上，而细菌代谢木质素的特征及规律研究较少[8]，不同微生物类群的木质素降解途径不同[9]，因此，不同地域环境、植被特点及地质地貌会通过微生物类群的改变间接影响 HS 的分子结构，这也是造成 HS 分子结构异质性的根源。不同微生物类群，如革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、放线菌、菌根真菌等将产生各类胞外酶来调控 SOM 分解及转化的各个阶段[10]。Janusz 等[11]指出，为适应不同生态位环境，许多真菌和细菌进化出竞争或互惠策略，通过分解木质素获取生长资源，从而实现其生存与繁衍。
木质素降解是一个复杂的过程，相关酶之间可能存在协同作用[12]。在自然界中，木质素降解是由白腐真菌分泌的胞外氧化还原酶催化下的解聚反应引起的。细菌在木质素降解产物异质低分子量芳香族化合物的矿化作用中发挥着主要作用[13]，也就是说，木质素的降解主要由真菌驱动，除真菌外，放线菌、α-变形菌和γ-变形菌也参与了木质纤维素降解[14]。与细菌相比，真菌能够更加有效地分解木质素，细菌参与的脱木质素进程较慢且作用有限[11]，但最近的研究表明，细菌分解木质素的作用可能比以往认为的更加重要[9，11]。细菌能够消耗真菌降解产生的低分子量中间化合物，是真菌与细菌间协同作用的重要机理。一些细菌菌株，尤其是放线菌，可以较大程度地溶解并修饰木质素结构，但其矿化木质素的能力有限。与白腐真菌相比，放线菌在较高供氮水平下可降解木质素、发挥主要代谢活性，而白腐真菌中的大多数菌株还可通过次级代谢降解木质素[12]。 Zhang 等[15]还提出，芽孢杆菌和放线菌是降解木质素的典型微生物类群，在堆肥的升温和高温阶段能够将木质素分解转化为 HS 前体物质，进而聚合形成 HS，此外，还证实了细菌中的芽孢杆菌是利用多酚氧化酶降解多酚类物质的主要微生物类群[16]。
在土壤中，各类真菌与细菌共存，形成了一个较为复杂的种间相互作用系统[17]，微生物类群间并不是孤立存在的。为有效规避影响因素，本研究中，配制含有适于微生物营养需求的木质素培养液，分别添加针铁矿、三羟铝石、δ-MnO2、高岭石和蒙脱石 5 种土壤常见矿物，接种由代表性细菌（巨型芽孢杆菌，Bacillus megaterium，简写为 B）、放线菌（灰色链霉菌，Streptomyces griseus，简写为 S） 及真菌（黑曲霉，Aspergillus niger，简写为 A）3 种菌株全排列组成的 6 种微生物接种顺序（ABS、ASB、 BAS、BSA、SBA 和 SAB），通过调整微生物接种顺序，对培养所得产物，即木质素-矿物复合体的腐殖质组成特征进行分析，进一步明确促进木质素腐殖化作用的最佳接种策略，为富含木质素农业固体废弃物的肥料化利用提供技术参考和理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
供试菌株分别为巨型芽孢杆菌（Bacillus megaterium，B.megaterium）、灰色链霉菌（Streptomyces griseus，S.griseus）和黑曲霉（Aspergillus niger， A.niger），3 种单一菌株均在天津环微生物科技有限公司购买。B.megaterium、S.griseus 及 A.niger 的复壮及扩繁分别在牛肉膏-蛋白胨培养基、淀粉硝酸盐培养基、马铃薯蔗糖琼脂培养基上进行。用塑料涂布器刮取对应培养基上的菌落，用一定量的无菌水冲洗，制备单一菌株的菌悬液。将细菌和放线菌悬液分别稀释至 106 和 109 倍，使用涂布平板法计算菌落数，真菌采用菌悬液的等分试样，稀释 104 倍后在显微镜下用血细胞计数器计数分生孢子。经计算，B.megaterium 和 S.griseus 的活菌体浓度分别为 2.6×106 和 6.0×109 CFU/mL；A.niger 孢子悬液的活性孢子浓度为 68 CFU/mL。
供试 5 种土壤常见矿物分别为高岭石、蒙脱石、针铁矿、δ-MnO2 和三羟铝石，分别用 Kao、Mon、 Goe、MnO 和 Bay 表示。高岭石和蒙脱石均由国药集团化学试剂有限公司出产的高岭土（CAS No.[1332-58-7]）和蒙脱土（CAS No.[1318-93-0]）提供，针铁矿、三羟铝石及δ-MnO2 的人工制备方法参照文献 [18]进行，制备后磨细过 0.10 mm 筛。
木质素培养液配制：木质素（CAS No.[9005-53-2]）购于东京化成工业株式会社，参照察氏培养基，将原配方中的蔗糖改为木质素。培养液配方为：NaNO3 2.0 g，K2HPO4 1.0 g，KCl 0.5 g，MgSO4 0.5 g，FeSO4 0.01 g，木质素 1.0 g，1000 mL 无菌水， pH 值 6.8～7.2。
1.2 试验设计
采用液体摇瓶培养法，量取若干 300 mL 木质素培养液置于 500 mL 锥形瓶中，分别加入 1.0 g 高岭石、蒙脱石、针铁矿、δ-MnO2 和三羟铝石，用无菌密封膜封口，在 121℃下高压蒸汽灭菌 20 min，取出自然冷却。
在无菌操作条件下接种第一种菌悬液（I），按照 20 mL 菌悬液 /300 mL 木质素培养液的标准进行，接种后立即用无菌透气密封膜封口，置于 28℃恒温摇床（摇动频率为 180～200 r/min）中培养 15 d，而后接种第二种菌悬液（Ⅱ），培养 15 d 后再接种第 3 种菌悬液（Ⅲ），再培养 15 d。此后，不再接种其他菌悬液，在 28℃恒温气浴摇床中培养直至结束，总培养期设为 110 d，包括接种期（0～45 d）和培养期（45～110 d）两个阶段，3 种菌株 （B.megaterium、S.griseus 和 A.niger）进行全排列组合，构成 6 个接种顺序（ABS、ASB、BAS、BSA、 SBA 和 SAB），如表1所示。
表1不同微生物接种顺序及对应的处理名称
注：不同微生物接种顺序对应的处理名称由 3 种菌株学名的首字母组成。
在 45 和 110 d 取培养试样 25 mL，以 12000 r/min 高速离心 20 min，收集沉淀物质，在 45℃下鼓风干燥 48 h，终止微生物活动，研磨过 0.01mm 筛，获取木质素-矿物复合体，对其进行腐殖质组成特征分析。每个处理、每个培养时间点下均设置 3 次重复。
1.3 测试指标及方法
准确称取 0.3 g 木质素-矿物复合体，置于高速离心管中，加入 25 mL 0.1 mol/L NaOH 和 0.1 mol/L Na2P2O7·10H2O 的混合液，在 70℃恒温水浴振荡器中提取 60 min，以 12000 r/min 高速离心 15 min，分别收集上清液（HLE）及残渣。用 0.5 mol/L H2SO4 将 HLE 溶液酸化至 pH 值 1.0，絮状沉淀为类胡敏酸（HLA），上清液为类富里酸（FLA），采用过滤法将 HLA 和 FLA 分离，滤纸上棕色絮状沉淀依次用 0.025 mol/L H2SO4 和去离子水洗涤，然后用 0.05 mol/L NaOH 溶解、定容、制备 HLA 碱溶液，采用 TU-1810 紫外-可见分光度计（北京浦西通用仪器有限公司）测定其在 400 和 600 nm 处的吸光值（Abs400 nm 和 Abs600 nm），通过公式△ logK=lgAbs400 nm-lgAbs600 nm 计算色调系数 ΔlogK。将 HLA 碱溶液 pH 值调至中性并定容，获得 HLA 溶液。用去离子水反复淋洗残渣，然后转入 55℃鼓风干燥箱中烘至恒重，磨碎过 0.01 mm 孔径筛，获得类胡敏素（HLu）组分。用总有机碳分析仪（德国 Elementar，Vario TOCcube）测定 HLE、HLA 和 HLu 的碳含量分别用 CHLE、CHLA 和 CHLu 表示，差减法计算 FLA 的碳含量（CFLA），CFLA= CHLE-CHLA，比值法计算胡富比（CHLA/CFLA）。
1.4 数据处理
采用 Excel 2019 和 SPSS 18.0 对数据进行整理、绘图并进行差异显著性分析。
2 结果与分析
2.1 木质素-矿物复合体 HLA 碱溶液 ∆logK 及 CHLA
图1显示了接种顺序对培养 45 和 110 d 后 HLA 碱溶液 ∆logK 的影响。在各接种顺序影响下，供试矿物中添加 Kao 条件下的 HLA 碱溶液 ∆logK 均为最高。在 Kao 添加条件下，与 45 d 相比，历经 110 d 培养，无论何种接种顺序，HLA 碱溶液的 ∆logK 均有不同程度提高，ABS、ASB、BSA、BAS、 SBA 和 SAB 接种顺序下，∆logK 增加幅度分别为 60.3%、19.0%、26.2%、11.6%、33.6% 和 7.2%，表明 HLA 分子结构经历培养更趋于脂族化，显然， ABS 接种顺序下 HLA 碱溶液的 ∆logK 增加幅度更大，HLA 分子结构变得更加简单；当添加矿物为 Mon 时，ABS 接种顺序对 HLA 碱溶液 ∆logK 也有较大程度提升，使该值增加 109.1%，HLA 分子结构趋于简单；在分别添加 Goe、MnO 和 Bay 的影响下，ASB、BAS 和 BSA 3 种微生物接种顺序会相应增加 HLA 碱溶液的 ∆logK，使该值增幅在所添加矿物条件下达到最大，增加幅度分别达 17.3%、 30.4% 和 64.3%。
图2显示了接种顺序对木质素-矿物复合体提取 CHLA 的影响。在培养 45 和 110 d 下，无论接种顺序如何，添加 Goe 条件下的 CHLA 含量均居 5 种供试矿物之首。与铁铝锰（氢）氧化物相比，黏土矿物（Kao 和 Mon）对 CHLA 形成的促进作用较弱。无论添加何种矿物，与 45 d 相比，培养 110 d 后仅有 BAS 接种顺序下的 CHLA 有所降低，在 Kao、Mon、Goe、MnO 和 Bay 添加条件，CHLA 降低幅度依次为 0.25%、10.6%、9.34%、37.8% 和 4.30%。基于 MnO 的添加，除 BAS 外，ABS、 ASB、BSA、SBA 和 SAB 5 个接种顺序均有利于提高 CHLA，其中 ABS 接种顺序对 HLA 形成的促进作用最大，使 CHLA 增加 43.0%。当添加矿物种类为 Goe 时，ABS 接种顺序同样有利于 CHLA 的积累，使之增加 14.0%。相比之下，当添加 Kao、Mon 和 Bay 时，接种顺序 ABS 可分别使 CHLA 降低 33.6%、 15.3% 和 36.8%。无论何种接种顺序，基于 Bay 的添加，CHLA 经培养后均有不同程度降低，ABS、 ASB、BSA、BAS、SBA 和 SAB 接种顺序下 CHLA 分别为 36.8%、41.2%、18.4%、4.3%、19.9% 和 8.7%。
图1不同微生物接种顺序对木质素-矿物复合体 HLA 碱溶液 ∆logK 的影响
注：高岭石、蒙脱石、针铁矿、δ-MnO2 和三羟铝石分别由 Kao、Mon、Goe、MnO 和 Bay 表示。柱状图上方不同小写字母表示同一矿物类型、不同微生物接种顺序间差异显著（P<0.05），不同大写字母表示相同微生物接种顺序、不同矿物类型间差异显著（P<0.05）。a、b 分别代表培养 45 和 110 d 的结果。下同。
图2不同微生物接种顺序对木质素-矿物复合体 CHLA 的影响
2.2 木质素-矿物复合体 CHLA/CFLA
图3显示了接种顺序在不同矿物参与下对木质素-矿物复合体 CHLA/CFLA 的影响，相比之下，无论何种接种顺序，添加 Goe 条件下 CHLA/CFLA 均显著高于其他矿物下的结果。在添加 Goe 的影响下，与 45 d 相比，历经 110 d 培养，ABS、ASB、BSA、BAS、SBA 和 SAB 接种顺序下 CHLA/CFLA 分别增加了 15.7%、31.1%、70.0%、74.1%、77.4% 和 55.8%。培养 45 d，添加 MnO 条件下的 CHLA/CFLA 在供试矿物中处于最低水平，与 45 d 相比，培养 110 d 后仅有 BAS 接种顺序使 CHLA/CFLA 降低 38.9%，其余接种顺序均有利于 CHLA/CFLA 的增加，增加幅度在 8.8%～33.5%。在添加 Bay 的条件下，历经培养，仅在 SAB 接种顺序下CHLA/CFLA 增加 7.63%，其他接种顺序均不利于 CHLA/CFLA 的提高。以 Kao 为添加剂，SAB 接种顺序使 CHLA/CFLA 增加 16.1%，基于 Mon 的添加条件，SBA 接种顺序使 CHLA/ CFLA 增加 15.4%，增加幅度在各系列中处于最高水平。
图3不同微生物接种顺序对木质素-矿物复合体 CHLA/CFLA 的影响
2.3 木质素-矿物复合体 CHLu
如图4所示，与 45 d 相比，历经 110 d 培养，在添加 Kao 条件下，ABS 和 ASB 两个接种顺序在促进木质素-矿物复合体 CHLu 的积累方面作用最显著，增加幅度分别达到 278.8% 和 388.9%，而 SAB 接种顺序更有利于 CHLu 的降解，使 CHLu 降低 45.4%； 以 Mon 为添加剂时，除 SAB 接种顺序可使 CHLu 增加外，其余接种顺序均有利于 CHLu 的降低，降低幅度在 17.5%～66.5%，同样，SAB 接种顺序在添加 Bay 的条件下可使 CHLu 增加幅度（56.4%）达到最大。相反，基于 Goe、MnO 和 Bay 的添加，CHLu 降低幅度最大的处理分别来自 ASB、ABS 和 SBA 的接种顺序，使 CHLu 分别降低 40.1%、51.0% 和 65.1%。
图4不同微生物接种顺序对木质素-矿物复合体 CHLu 的影响
3 讨论
3.1 不同微生物接种顺序对木质素-矿物复合体 HLA 碱溶液 ∆logK 及 CHLA 含量的影响
不同微生物类群对木质素降解及腐殖质形成具有重要影响，不同矿物种类的参与使腐殖化作用途径更加复杂，不同微生物接种顺序对以木质素为碳源影响下的腐殖质组成特征及影响规律尚不明晰。在供试矿物中，高岭石具有最低的比表面积（SSA） 11.1 m2 /g 及可变电荷[19]，吸附固定能力有限，大部分来自木质素降解产物及菌体残留物的、含有芳香族化合物的结构会滞留在液体培养液中与微生物充分接触[20]，因此，无论微生物接种顺序如何改变，历经培养后，微生物矿化作用均会使 HLA 分子结构趋于简单化。在添加矿物种类为高岭石或蒙脱石时，ABS 的接种顺序均能最大限度地降低 HLA 分子的复杂程度，使其分子结构趋于简单，这是因为，以 A.niger 为首个接种菌悬液，在此阶段，培养液中营养成分丰富，高岭石或蒙脱石能够在 A.niger 与木质素间发挥吸附缔结作用，增加两者间的亲和力，更有利于木质素的氧化降解[7]，此后 B.megaterium 能够较好利用降解产物持续推进降解进程，待失活以菌体形式存在又接种了 S.griseus， S.griseus 对能源物质的需求量较少，A.niger 产生的有机酸或不同的酶足以支撑并使之持续降解[21]。在铁铝锰氧化物方面，第一阶段接种细菌或真菌，如 ASB、BAS 和 BSA，更易在各氧化物表面形成微生物生物膜，各类氧化物在此作为电子受体，生物膜由细胞外聚合物和高分子量细胞表面化合物组成[22]，生物膜可有效降低氧化物对木质素的保护作用，更有利于后续微生物的降解。然而，不同微生物接种顺序对生物膜形成后 HLA 分子结构的影响尚不清楚，这可能是由于铁铝锰氧化物与木质素结合的机制不同所致。
黏土矿物对 HLA 形成的促进作用低于铁铝锰 （氢）氧化物，这是因为黏土矿物吸附木质素及其降解产物的能力不如铁铝锰（氢）氧化物，尤其是针铁矿对木质素及其腐殖化产物的吸附能力显著高于其他矿物类型，因此可促进更多 HLA 的形成[23]。据 Hall 等[24]报道，由于铁氧化物的固定作用，木质素中较顽固的芳香 C 结构可以在土壤中保蓄数十年。此外，铁铝锰（氢）氧化物还可以将木质素降解产物中的酚类物质以非生物途径向腐殖质聚合物转化并进入 HLA 组分[25]。尽管木质素聚合物结构复杂，基于 5 种矿物的添加，在 B.megaterium → A.niger → S.griseus 接种顺序下，通过细菌改性再进行真菌降解，更有利于 HLA 分子的降解[26]，使 CHLA 有着不同程度的降低，其中 δ-MnO2 更有利于降解的促进，而δ-MnO2 在其他 5 个接种顺序下反而促进 HLA 的形成，其中，ABS 接种顺序的优势最大。Wu 等[27]报道，MnO2 可作为化学催化剂，促进玉米秸秆堆肥过程中腐殖质的形成。基于同种矿物添加条件，接种顺序的变化可以调控矿质化与腐殖化间的平衡，该理论应结合 13C 同位素示踪法进一步确定。此外，ABS 接种顺序在添加针铁矿培养可使 CHLA 增加，而在添加高岭石、蒙脱石和三羟铝石培养后使 CHLA 降低，即相同接种顺序在添加不同矿物类型后也可影响腐殖化作用，使 CHLA 积累或消耗。基于三羟铝石的添加，各接种顺序下 CHLA 均有不同程度降低， Schneider 等[28]研究指出，无定形氢氧化铝对溶解有机物（DOM）的结合相对较弱，DOM 更易解吸并受微生物降解的影响，该机理亦可作为 HLA 受微生物降解使 CHLA 降低的解析。
3.2 不同微生物接种顺序对木质素-矿物复合体 CHLA/CFLA 的影响
矿物表面结构及性质的差异会影响 FLA 和 HLA 间的平衡，会间接影响木质素-矿物复合体的 CHLA/CFLA [29]。与 FLA 相比，HLA 具有更高的摩尔质量、更低的总电荷[30]。针铁矿的添加能较好地抑制木质素的矿化，通过疏水作用使更多来自木质素的稳定大分子保留并进入 HLA 组分[24]，因此在同等条件下，针铁矿对腐殖质品质的改善效果显著高于其他矿物，在有机质循环及腐殖质形成中发挥重要作用[31]。δ-MnO2 是强氧化剂，同时又具有较高反应性，既可作为电子受体又是催化剂，更有利于快速吸附 FLA[25，32]，配体交换和疏水作用是 FLA 在δ-MnO2 上吸附的主要原因，因此在培养 45 d、δ-MnO2 添加条件下，CHLA/CFLA 在供试矿物中处于最低水平，尽管如此，历经 110 d 培养唯有 B.megaterium → A.niger → S.griseus 的接种顺序使 CHLA/CFLA 持续降低，其余接种顺序均不同程度地提高了 CHLA/CFLA。可见，细菌的改性更有利于后续真菌、放线菌的降解作用，使腐殖质品质下降。基于三羟铝石的添加，历经 S.griseus → A.niger → B. megaterium 接种顺序的培养使CHLA/CFLA 提高，该接种顺序在高岭石添加条件也使 CHLA/CFLA 的增加幅度达到最大，蒙脱石添加、结合 S.griseus → B. megaterium → A.niger 的接种顺序使 CHLA/CFLA 增加幅度达到最大。以 S.griseus（一种产孢的放线菌目革兰氏阳性菌）为第一菌悬液接种，不仅能在培养液中释放有机酸和复合多糖，而且还能释放抗生素。
3.3 不同微生物接种顺序对木质素-矿物复合体 CHLu 的影响
HLu 是腐殖质中的惰性腐殖质组分，对其降解有利于其他活性腐殖质组分的积累[33]。高岭石添加条件 S.griseus → A.niger → B.megaterium 的接种顺序使 CHLu 降解，而基于蒙脱石和三羟铝石添加条件，该接种顺序则使 CHLu 积累。尽管放线菌是形成多细胞菌丝的细菌，类似于真菌，可以溶解木质素[12]，能为后续真菌降解木质素提供更为有利的条件，但高岭石对降解产物的亲和力较差，不利于 HLu 的形成。可见，接种顺序相同、矿物种类不同会影响培养后 CHLu 的丰缺，相关机理还有待进一步明确。恰当的接种顺序辅以适当的矿物类型会促进 HLu 的分解，如 A.niger → S.griseus → B.megaterium 结合针铁矿的添加、A.niger → B.megaterium → S. griseus 结合δ-MnO2 的添加可有效促进 HLu 的降解，在此过程，第一阶段接种的真菌（A.niger），会在较充分的营养环境下发挥更大的降解潜力，使 CHLu 降低并向其他活性腐殖质组分转化。
4 结论
（1）基于高岭石的添加，各接种顺序在培养后均促使 HLA 分子结构脂族化，使分子缩聚程度降低，尤以 A.niger → B.megaterium → S.griseus 的接种顺序影响最显著，添加蒙脱石也表现为相同规律。
（2）针铁矿、δ-MnO2 和三羟铝石对 HLA 形成的促进作用要高于高岭石和蒙脱石，其中以针铁矿效果最佳，基于上述 5 种矿物的添加，在 B.megaterium → A.niger → S.griseus 接种顺序下， HLA 分子更易遭致降解。相反，A.niger → B.megaterium → S.griseus 接种顺序在添加针铁矿或δ-MnO2 条件下培养可使 CHLA 增加。
（3）同等条件下，针铁矿对腐殖质品质的改善效果显著高于其他矿物；δ-MnO2 添加条件下， CHLA/CFLA 在供试矿物中处于最低水平，尽管如此，历经 110 d 培养，唯有 B.megaterium → A.niger → S.griseus 的接种顺序使 CHLA/CFLA 持续降低，其余接种顺序均不同程度地提高了 CHLA/CFLA。基于三羟铝石或高岭石的添加，S.griseus → A.niger → B.megaterium 接种顺序的培养均使 CHLA/CFLA 提高，而蒙脱石添加、结合 S.griseus → B.megaterium → A.niger 的接种顺序使 CHLA/CFLA 增加幅度达到最大。
（4）接种顺序相同、矿物种类不同会影响培养后 CHLu 的丰缺，恰当的接种顺序辅以适当的矿物类型会促进 HLu 的分解，如高岭石添加条件 S.griseus → A.niger → B.megaterium 的接种顺序、A.niger → S.griseus → B.megaterium 结合针铁矿的添加、 A.niger → B.megaterium → S.griseus 结合δ-MnO2 的添加均可有效促进 HLu 的降解。